蛋白活性检测的常用方法

A. 蛋白药物生物学活性检测方法有哪些

一、MTT比色法检测细胞活性
（一）原理
活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶能催化无色的MTT形成蓝色的甲肷，其形成的量与活细胞数和功能状态呈正相关。对细胞活力有影响的表达蛋白活性检测可以通过MTT比色法进行。
（二）试剂准备
1、青链霉素溶液（100X）：青霉素100万U，链霉素100万U，溶于100mlddH2O中,抽滤除菌。
2、L15基础培养基：1000mlL15培养基，加2g碳酸氢钠，10ml 100X青链霉素，5mlHEPES。
3、MTT液：5mg/ml溶于L15基础培养基。
4、SDS处理液：20gSDS，50μl二甲基甲酰胺，加双蒸水50ml溶解。
5、L-多聚赖氨酸：50μg溶于1ml双蒸水中。
6、L15基础培养基溶解的不同浓度的蛋白液。
（三）操作步骤（以背根神经节细胞培养为例）
1、无菌条件下取新生一天的SD大鼠背根神经节（DRG）。
2、镜下去除神经根和外膜，放入1ml 0.1%胶原酶中37℃消化30min，每5min摇匀一次。
3、洗去胶原酶，吹打分散后，接种于预先涂有L-多聚赖氨酸的96孔培养板中，每孔含100μl无血清L15培养基，细胞约800个。
4、实验组分别加入纯化的表达蛋白（分别以不同的蛋白浓度），阴性对照加入等体积表达蛋白的溶剂。
5、37℃ 5%CO2培养48hr后，每孔加入10μl MTT，37℃ 5%CO2孵育4hr。
6、加入100μl 20%的SDS处理液，37℃孵育20hr。
7、用EL×800微孔酶标仪测定OD570值，数据分析。

B. 怎样检测蛋白酶活性

在适宜条件下(温度,pH),加入蛋清,若消失则有活性.

C. 一般采用什么方法检验蛋白质即鉴定

一般用双缩脲试剂鉴定，双缩脲试剂可以和蛋白质发生紫色反应。

D. 蛋白浓度测定的方法具体有哪些

蛋白浓度测定的方法：

1. 紫外分光光度法

紫外光谱吸收法测定蛋白质含量是讲蛋白质溶液直接在紫外分光光度计中测定的方法，不需要任何试剂，操作简单且易回收。蛋白质溶液在280nm附近有强烈的吸收，这是由于蛋白质中酪氨酸、色氨酸残基而引起的，所以光密度受这两种氨基酸含量的支配。另外核蛋白或提取过程中杂有的核酸对测定结果引起极大误差，其最大吸收在260nm。所以同时测定280及260nm两种波长的吸光度，通过计算可得较为正确的蛋白质含量。

2. 双缩脲法

利用半饱和硫酸铵或27.8％硫酸钠——亚硫酸钠可使血清球蛋白沉淀下来，而此时血清白蛋白仍处于溶解状态，因此可把两者分开，这种利用不同浓度的中性盐分离蛋白的方法称为盐方法。盐析分离蛋白质的方法不仅用于临床医学，而且还广泛地用于生物化学研究工作中，如一些特殊蛋白质—酶、蛋白激素等的分离和纯化。

蛋白质和双缩脲一样，在碱性溶液中能与铜离子形成紫色络合物（双缩脲反应），且其呈色深浅与蛋白质的含量成正比，因此可于蛋白质的定量测定。

但必须注意，此反应并非蛋白质所特有，凡分子内有两个或两个以上的肽键的化合物以及分子内有—CH2—NH2等结构化合物，双缩脲反应也呈阳性。本实验用27.8％硫酸钠—亚硫酸钠溶液稀释血清，取出一部分用双缩脲反应测定蛋白质的含量，剩余部分则用滤纸过滤，使析出的球蛋白与白蛋白分离，取出滤液用同一反应测定白蛋白的含量。总蛋白与白蛋白含量之差即球蛋白的含量。白蛋白与球蛋白之比即所谓的白／球比值。

3. Folin-酚试剂法

目前实验室较多用Folin-酚法测定蛋白质含量，此法的特点是灵敏度高，较双缩脲高两个数量级，较紫外法略高，操作稍微麻烦，反应约在15分钟有最大显色，并最少可稳定几个小时，其不足之处是干扰因素较多，有较多种类的物质都会影响测定结果的准确性。其原理是蛋白质中含有酚基的酪氨酸，可与酚试剂中的磷钼钨酸作用产生兰色化合物，颜色深浅与蛋白含量成正比。

4. 考马氏亮蓝G-250

此方法是1976年Bradform建立。染料结合法测定蛋白质的优点是灵敏度较高，可检测到微量蛋白，操作简便、快迅，试剂配制极简单，重复性好，但干扰因素多。考马氏亮蓝G－250具有红色和青色两种色调、在酸性溶液中游离状度下为棕红色，当它通过疏水作用与蛋白质结合后，变成蓝色，最大吸收波长从465nm转移到595nm处，在一定的范围内，蛋白质含量与 595nm的吸光度成正比，测定595nm处光密度值的增加即可进行蛋白质的定量。

以上便是实验室中常见的几种蛋白浓度测定的方法，另外还有凯氏定氮法和BCA法，有凯氏定氮法结果最精确，但操作复杂，BCA法又以其试剂稳定，抗干扰能力较强，结果稳定，灵敏度高而受到欢迎。

E. 求助：蛋白酶酶活的测定方法

酶活测定方法 还原法
酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。在此反应体系中添加化学试剂 ,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。通过在特定的波长下 比色 ,即可求 出还原产物的含量 ,从而计算出酶活力的大小 。
色原底物法
通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。该底物与酶发生反应后 ,生色基团可被释放出来 ,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后 ,即可求出待测酶的活力。 粘度法
该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶 的活力。木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切割成较小的分子使其粘度大 为降低。基 于Poiseuille定律我们知道 ,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。
高压液相色谱法
酶与其底物在特定的条件下充分反应后 ,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物的含量 ,从而换算出酶活力的数值。
免疫学方法
常用 于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法 、免疫凝胶扩散法。这两种方法都是根据酶与其抗体之间可发生特定的沉淀反应 ,通过待测酶和标准酶的比较,最终确定酶活力。免疫学方法检侧度非常灵敏,可检侧出经过极度稀释后样品中的酶蛋白,但其缺点是不同厂家生产的酶产品需要有不同特定的抗体发生反应。
琼脂凝胶扩散法
将酶作用的底物与琼脂混合熔融后 ,倒入培养皿中或载波片上制成琼脂平板。用打孔器在琼脂平面上打出一个约4-5mm半径 的小孔。在点加酶样并培养24h以后 ,用染色剂显色或用展开剂展开显出水解区,利用水解直径和酶活力关系测定酶活力。

F. 说明常用蛋白质测定方法的原理,并对各种方法加以比较

1、凯氏定氮法

准备4个50mL凯氏烧瓶并标号，想1、2号烧瓶中加入定量的蛋白质样品，另外两个烧瓶作为对照，在每个烧瓶中加入硫酸钾-硫酸铜混合物，再加入浓硫酸，将4个烧瓶放到消化架上进行消化。

消化完毕后进行蒸馏，全部蒸馏完毕后用标准盐酸滴定各烧瓶中收集的氨量，直至指示剂混合液由绿色变回淡紫红色，即为滴定终点，结算出蛋白质含量。

2、双缩脲法

双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法，硫铵不干扰显色， Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最大吸收。

利用标准蛋白溶液和双缩脲试剂绘制标准曲线，将待测血清与硫酸钠在待测试管中混合，并只加入硫酸钠不含血清的试管作对照，将两支试管加入等量的双缩脲试剂，混合后于37℃环境中放置10分钟，在540nm波长进行比色，以对照管调零，读取吸光度值，标准曲线上直接查出蛋白质含量。

3、酚试剂法

取6支试管标号，前5支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液，最后一支试管加待测蛋白质溶液，不加标准蛋白溶液，每支试管液体总量加入蒸馏水补足而保持一致，混合均匀，在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于650nm波长处测定各管中溶液的吸光度值。

4、紫外吸收法

大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在，可用于测定0.1～0.5mg/mL含量的蛋白质溶液。

取9支试管分别标号，前8支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液，1号试管不加标准蛋白溶液，最后一支试管加待测蛋白质溶液，而不加标准蛋白溶液，每支试管液体总量通过加入蒸馏水补足而保持一致，将液体混合均匀，在280nm波长处进行比色，记录吸光度值。

5、考马斯亮蓝法

Bradford浓染液的配制：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇，加入100ml85%的磷酸，用蒸馏水补充至200ml，此染液放4℃至少6个月保持稳定。

标准曲线蛋白质样本的准备：尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品，测定抗体，可用纯化的抗体作为标准。待测样本是未知的，也可用抗体作为标准蛋白。通常在20ug—150ug/100ul之间绘制标准曲线。

将待测样本溶于缓冲溶液中，该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同(最好用PBS)。按1：4用蒸馏水稀释浓染料结合溶液，出现沉淀，过滤除去。

每个样本加5ml稀释的染料结合溶液，作用5～30min。染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度。注意，显色反应不得超过30min。根据标准曲线计算待测样本的浓度。

G. 测定蛋白质含量的方法有哪些，其原理各是什么

Bradford法测定蛋白质浓度：实验原理。

双缩脲法（Biuret法）和Folin—酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制,促使科学家们去寻找更好的蛋。

取6支试管分别标号，前5支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液，最后一支试管加待测蛋白质溶液，不加标准蛋白溶液，每支试管液体总量通过加入蒸馏水补足而保持一致。

将液体混合均匀，在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于650nm波长处测定各管中溶液的吸光度值。

(7)蛋白活性检测的常用方法扩展阅读：

紫外吸收法：

大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在，可用于测定0.1～0.5mg/mL含量的蛋白质溶液。

取9支试管分别标号，前8支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液，1号试管不加标准蛋白溶液，最后一支试管加待测蛋白质溶液，而不加标准蛋白溶液，每支试管液体总量通过加入蒸馏水补足而保持一致，将液体混合均匀，在280nm波长处进行比色，记录吸光度值。

H. 测定血清总蛋白的参考方法是

总蛋白的六种检测方法
（一）凯氏定氮法
将血清与强酸一起加热消化，使血清中的含氮化合物转化为铵盐，再加碱使铵盐成为氨进经蒸馏分离出来，最后用酸滴定测定氮量，按每克氨相当于6.25g蛋白质计算蛋白质的浓度。
应用历史较久，结果较准确，是蛋白质测定的参考方法，但操作复杂，影响因素较多，且不少蛋白质的含氮量并非16%，不适用于日常工作，目前多用于标准蛋白的标定及校正其它的常规方法。
（二）双缩脲法
蛋白质中的肽键（-CONH-）在碱性条件下与Cu2+络合成紫红色复合物，产生的颜色强度在一定范围内与蛋白质含量成正比。
此反应和二分子尿素缩合后的产物双缩脲（H2N-CO-NH-CO-NH2）与碱性铜溶液作用形成紫红色的反应相似，故称为双缩脲反应。几分子中含有两个甲酰胺基(-CO-NH2)的化合物都能出现此反应。
因至少含2个-CONH-基团才能与Cu2+络合，所以氨基酸和二肽无此反应。体液中小分子肽含量极低，故血浆中除蛋白质外几乎不存在可与双缩脲试剂显色的物质，且各种蛋白质显色程度基本相同。
此法简便、准确、重复性好，在10-120g／L。浓度范围内呈良好的线性关系，批内CV值<2％，但灵敏度较其它方法稍差，是目前临床上最常规的方法。
（三）酚试剂法
蛋白质分子中的酪氨酸残基和色氨酸残基能够和酚试剂中的磷钨酸-磷钼酸反应生成蓝色化合物。Lowry改良法在酚试剂中加入Cu2+，提高了呈色的灵敏度，其中75％呈色靠铜离子产生。Lowry改良法的灵敏度为双缩脲法的100倍左右。
由于各种蛋白质中酪氨酸和色氨酸的比例不同，如白蛋白含色氨酸为0.2％，而在一些球蛋白中色氨酸含量高达2％~3％，因此使用本法测定纯粹的、单一的蛋白质较合适。此法灵敏度较高，为10~60ug／ml，因而适用于测定蛋白质含量较少的标本(如脑脊液)，但试剂反应易受还原性化合物糖类、酚类及多种药物如水杨酸、氯丙嗪和某些磺胺药的干扰。
（四）紫外分光光度法
蛋白质分子内的色氨酸、酪氨酸等芳香族氨基酸可使蛋白质溶液在280nm波长处有一吸收峰，依此性质可用于蛋白质定量。
由于各种蛋白质中芳香族氨基酸的含量和比例不同，血清中游离的酪氨酸和色氨酸在280nm处也有吸收，因尿酸和胆红素在280nm处也有干扰，因而本法的准确性和特异性都受到很大的影响。
此法敏感而且简便，由于制剂未经任何处理，蛋白质的生物活性得以保留，故常用于较纯的酶和免疫球蛋白的测定。但此法需紫外分光光度计和石英比色杯。
（五）染料结合法
在酸性环境中，蛋白质分子解离出的-NH3+，可与染料的阴离子产生颜色反应。常用的染料有氨基黑、考马斯亮蓝等。这一性质可用于电泳后蛋白质的染色和血清总蛋白测定。
此法操作简便、重复性好、灵敏度高、且干扰因素较少。缺点是特异性不高，分子量3 000以上的多肽也参与反应。另外，不同蛋白质和染料的结合力不一致，因此很难找到一种合适的物质作标准物，使此方法的应用受到限制。
（六）比浊法
用某些酸类(如二氯醋酸、磺基水杨酸等)和血清蛋白质结合产生沉淀，然后测定其浊度，与同样处理的蛋白标准液比较，即可求得蛋白质含量。
此方法简便，不需特殊仪器。缺点是浊度形成的强弱易受多种因素影响，如加入试剂的方法、反应时的温度等。另外，蛋白质沉淀时易形成絮状物，难以获得稳定的悬浮液

I. 用什么方法检测蛋白质

目前食品中蛋白质的测定方法有蛋白质自动分析仪，近红外自动测定仪，紫外分光光度法以及凯氏定氮法等。本文采用纳氏试剂作为显色剂测定食品中蛋白质含量，适用范围广，可用于各类食品及保健食品的检测。用本法对标准品、质控样品进行测定获得满意结果，对批量样品的快速测定更具有实用性。现将结果报告如下。

材料与方法

仪器与试剂 WFZ800-D3型紫外分光光度计(北京第二光学仪器厂)。分析纯硫酸、硫酸铜、硫酸钾。(1)纳氏试剂：称取碘化汞100g及碘化钾70g，溶于少量无氨蒸馏水中，将此溶液缓缓倾入己冷却的32%氢氧化钠溶液500ml中，并不停搅拌，再用蒸馏水稀释至1L，贮于棕色瓶中，用橡皮塞塞紧，避光保存。(2)硫酸铵标准储备溶液(1.0g/L)：精确称取经硫酸干燥的硫酸铵0.4720g，加水溶解后移入100mL容量瓶中，并稀释至刻度，混均此液每毫升相当于1.0mgNH3-N(10℃下冰箱内储存稳定1年以上)。(3)硫酸铵标准使用溶液(0.01g/L)：用移液管精密吸取1.0ml标准储备液(1.0g/L)于100ml容量瓶内，加水稀释至刻度，混匀，此溶液每毫升相当于10.0μg NH3-N。

方法

标准曲线绘制 取25ml比色管7支，分别准确吸取0.01g/L硫酸铵标准使用液0.00，0.5，1.0，3.0，5.0，7.0，10.0ml(相当于标准0.0，5.0，10.0，30.0，50.0，70.0，100.0μg)，加水至10ml刻度，于标准系列管中各加2ml纳氏试剂，混匀后放置10min，移入1cm比色皿内，以零管为参比，于波长420mm处测量吸光度，以标准管含量为横坐标(μg),对应的吸光度(A)值为纵坐标绘制标准曲线。

样品测定 选择牛奶和奶粉为检测样品。精密称取样品0.1～2.0g置于250ml三角瓶中，加入0.2gCuSO4、1.0gK2SO4、硫酸10ml，先小火加热，待内容物全部炭化，泡沫停止后，加大火力至液体呈蓝色，使H2SO4剩余量约为3ml左右为止，室温放冷后，沿瓶壁慢慢加入10ml水，移入100ml容量瓶中，用少量蒸镏水洗三角瓶3次，洗液全部并入容量瓶中，冷却，加蒸馏水至刻度，混匀。测定时取0.5ml，加水至10ml刻度，以后操作同标准曲线。同时做空白试验。

计算公式

X=c×Fm×V2V1×1000×1000×1000

式中：X-试样中蛋白质含量(g/100g或g/100ml)

C-试样测定液中扣除空白后氮的含量(μg)

V1-试样消化液定容体积(ml)

V2-测定用消化液体积(ml)

m-样品质量(g)或体积(ml)

F-氮换算为蛋白质的系数。

蛋白质的氮含量一般为15%～17.6%，按16%计算乘以6.25即为蛋白质，乳制品为6.38，面粉为5.7，肉及肉制品为6.25，大豆为5.71。

结果

2.1 测定波长选择 含氮量为30μg的标准管在显色后，在波长400～440mm范围内每间隔5nm进行测定，最大吸收波长为420mm。

显色剂用量选择 含氮量为30μg的标准管分别加入不同量的纳氏试剂，在420mm的波长下分别测定其吸光度结果。纳氏试剂显色剂加入量为1.5～3.0ml时吸光度基本无变化，本法选择加入纳氏试剂2.0ml。

显色时间及稳定性 含氮量为30μg的标准管经显色后，分别在10，30min，1，2，4，8h进行测定。显色后10min～8h内吸光度稳定无变化。本法选显色10min后测定。

标准曲线 回归方程：y=0.016X-1.5×10-3，r=0.9998，最佳线性范围0.0～100μg。

精密度 牛乳和奶粉2种样品分别取6份按本法重复测定6次，牛乳和奶粉精密度测定结果：平均数分别为3.06，23.50；标准差分别为±0.029，±0.073；相对标准偏差分别为0.31%，0.94%。

对2种样品利用标准加入法作回收试验(表1) 结果可见，回收率为95.50%～99.44%。

2种方法测定结果比较 分别用GB/T5009.5-2003凯氏定氮法与本法测定。结果显示，2种分析方法的测定结果差异无统计学意义(t=0.026，P>0.05)。

测定标准物质 用本法测定4种不同的蛋白质标准物质，测定结果与标准物质含量一致。

以纳氏试剂作为显色剂快速测定食品中蛋白质的方法特点简单、快速，适用于批量样品测定。在碱性条件下NH3-N与纳氏试剂反应生成的黄色化合物稳定。本法与国标凯氏定氮法进行比较t=0.026,P<0.05，n=32，2种方法测定结果无明显差异。测定范围广，线性范围宽0.0～100.0μg；精密度高；相对标准偏差为0.31%～0.94%；回收率好，加标回标率为95.50%～99.44%。用本法测定标准物质结果一致，用于质量控制样本测定结果满意。本法仪器试剂简单，易于基层普及，有利于推广应用。