hplc常用的维护方法

‘壹’ LC-100高效液相色谱仪使用维护 常见问题解决 详细点

HPLC系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成.有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、柱温控制器等。

一、输液泵

1.泵的构造及原理

目前高效液相输液泵多用柱塞往复泵，一般都采用双泵补偿法。

2.泵的使用及维护注意事项

泵使用时要注意：

a.防止固体微粒进入泵体，泵的入口都连接有砂滤片(或棒)，滤器要经常清洗或更换。

b.流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不应保留在泵内，尤其是在停泵过夜或更长时间的情况下。如果将含缓冲液的流动相留在泵内，由于蒸发或泄漏，甚至只是由于溶液的静置，就可能析出盐的微细晶体，会增加泵头内的宝石活塞杆和活塞的磨损。

c.泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环，最终产生漏液。

d.流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性，如果有大量气泡，泵就无法正常工作。

泵的一般故障排除：

a.没有流动相流出，又无压力指示。原因可能是泵内有大量气体，这时可打开泄压阀，使泵在较大流量(如3ml/min)下运转，将气泡排尽，也可用一个针筒在泵出口处帮助抽出气体。另一个可能原因是密封环磨损，需更换。

b.压力和流量不稳。原因可能是气泡，需要排除；或者是单向阀内有异物，可卸下单向阀，浸入丙酮内超声清洗。有时可能是砂滤棒内有气泡，或被盐的微细晶粒或滋生的微生物部分堵塞，这时，可卸下砂滤棒浸入流动相内超声除气泡，或将砂滤棒浸入稀酸(如4mol/L硝酸)内迅速除去微生物，或将盐溶解，再立即清洗。

二．进样器

HPLC进样方式可分为：隔膜进样、停流进样、阀进样、自动进样。

1．隔膜进样。用微量注射器将样品注入专门设计的与色谱柱相连的进样头内，可把样品直接送到柱头填充床的中心，死体积几乎等于零，可以获得最佳的柱效，且价格便宜，操作方便。但不能在高压下使用(如10MPa以上)；此外隔膜容易吸附样品产生记忆效应，使进样重复性只能达到1~2%。

2．停流进样。可避免在高压下进样。但在HPLC中由于隔膜的污染，停泵或重新启动时往往会出现"鬼峰"；另一缺点是保留时间不准。在以峰的始末信号控制馏分收集的制备色谱中，效果较好。

3．阀进样。一般HPLC分析常用六通进样阀。六通阀的进样方式有部分装液法和完全装液法两种。①用部分装液法进样时，进样量应不大于定量环体积的 50%(最多75％)，并要求每次进样体积准确、相同。②用完全装液法进样时，进样量一般定量环体积的3~5倍，这样才能完全置换定量环内的流动相，消除管壁效应，确保进样的准确度及重复性。

六通阀使用和维护：①样品溶液进样前必须用0.45μm滤膜过滤，以减少微粒对进样阀的磨损。② 转动阀芯时不能太慢，更不能停留在中间位置，否则流动相受阻，使泵内压力剧增，甚至超过泵的最大压力；再转到进样位时，过高的压力将使柱头损坏。③为防止缓冲盐和样品残留在进样阀中，每次分析结束后应冲洗进样阀。通常可用水冲洗，或先用能溶解样品的溶剂冲洗，再用水冲洗。

三.色谱柱

柱的使用和维护:

①避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行。

②应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂直接改变为水相。

③一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。

④选择使用适宜的流动相(尤其是pH)，以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面连接一预柱，分析柱与预柱填料相似。

⑥经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积至少应是柱体积的5倍以上。

四.检测器

UV检测器是HPLC中应用最广泛的检测器，主要性能指标:1)噪音和漂移：在仪器稳定之后，记录基线1小时，基线带宽为噪音，基线在1小时内的变化为漂移。它们反映检测器电子元件的稳定性，及其受温度和电源变化的影响，如果有流动相从色谱柱流入检测器，那么它们还反映流速(泵的脉动)和溶剂(纯度、含有气泡、固定相流失)的影响。

2)灵敏度(sensitivity)：表示一定量的样品物质通过检测器时所给出的信号大小。

3)检测限.检测器灵敏度的高低，并不等于它检测最小样品量或最低样品浓度能力的高低，因为在定义灵敏度时，没有考虑噪声的大小，而检测限与噪声的大小是直接有关的。检测限是检测器的一个主要性能指标，其数值越小，检测器性能越好。

检测器的故障及排除

1)流动池内有气泡

如果有气泡连续不断地通过流动池，将使噪音增大，如果气泡较大，则会在基线上出现许多线状"峰"，这是由于系统内有气泡，需要对流动相进行充分的除气。

2)流动池被污染

无论参比池或样品池被污染，都可能产生噪音或基线漂移。可以使用适当溶剂清洗检测池，要注意溶剂的互溶性；如果污染严重，就需要依次采用1mol/L硝酸、水和新鲜溶剂冲洗，或者取出池体进行清洗。

检测器对温度有一定的敏感度。紫外检测器一般在温度波动超过±0.5℃时，就会造成基线漂移起伏。

流动相：理想的液相色谱流动相溶剂应具有低粘度、与检测器兼容性好、易于得到纯品和低毒性等特征。反相色谱的流动相通常以水作基础溶剂，再加入一定量的能与水互溶的极性调整剂，如甲醇、乙腈、四氢呋喃等。极性调整剂的性质及其所占比例对溶质的保留值和分离选择性有显着影响。一般情况下，甲醇-水系统已能满足多数样品的分离要求，且流动相粘度小、价格低，是反相色谱最常用的流动相。但现在多采用乙腈-水系统做初始实验，因为与甲醇相比，乙腈的溶剂强度较高且粘度较小，并可满足在紫外185~205nm处检测的要求。

溶剂的截止波长：将溶剂装入1cm的比色皿，以空气为参比，逐渐降低入射波长，溶剂的吸光度A＝1时的波长称为溶剂的截止波长。也称极限波长。

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‘贰’ 请问HPLC是做什么的原理操作方法

HPLC是高效液相色谱，英文全称是High Performance Liquid Chromatography。该方法在化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中被用来做重要的分离分析技术。

用途：高效液相色谱更适宜于分离、分析高沸点、热稳定性差、有生理活性及相对分子量比较大的物质，因而广泛应用于核酸、肽类、内酯、稠环芳烃、高聚物、药物、人体代谢产物、表面活性剂，抗氧化剂、杀虫剂、除莠剂的分析等物质的分析。

原理：高效液相色谱以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析和分离。

操作方法：如下图所示，溶剂贮器中的流动相被泵吸入，经梯度控制器按一定的梯度进行混合然后输出，经测其压力和流量，导入进样阀（器）经保护柱、分离柱后到检测器检测，由数据处理设备处理数据或记录仪记录色谱图，馏分收集器收集馏分，废液瓶收集废液。

(2)hplc常用的维护方法扩展阅读：

液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。

HPLC根据固定相和流动相的成分分为正相色谱和反向色谱。

正相色谱法

采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。

反相色谱法

一般用非极性固定相（如C18、C8)；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。

参考资料：网络-高效液相色谱

‘叁’ 如何保护色谱柱延长使用寿命

一、流动相的PH应在使用的范围内
Welch公司的色谱柱除反相氰基柱PH1.5-9.0外，其反相色谱柱的PH范围均为1.5-10，由于填料中存在Si-C和Si-O键，流动相超过其PH范围将会导致硅胶基质流失和键合相碳链断裂，使柱效下降，使用寿命变短。由于流动相的PH 控制不当而对色谱柱造成的损害，通常很难是色谱柱恢复，因此必须认真对待，严格控制流动相的PH值。
二、去除样品和流动相中的固体颗粒
样品和流动相中含有的固体颗粒物质会堵塞色谱柱筛板，筛板被堵住不仅会引起柱压的升高，而且也会引起柱效下降，因为筛板的堵塞会引起液流不均，导致色谱峰型拖尾、变宽，从而使柱效下降。因此，建议使用超纯水和色谱纯试剂，在分析样品前对样品进行针筒过滤，流动相过0.45μm滤膜。
三、使用保护柱或在线过滤器
样品和流动相经过滤后并不能完全消除固体颗粒物质，因为泵的磨损、密封圈和管路的老化也会产生固体颗粒物质，这些固体颗粒被流动相带入色谱柱，堵塞筛板，导致柱压升高、柱效下降。保护柱和在线过滤器上都有筛板，其孔径与色谱柱孔径相同，因此可以阻止固体颗粒物质到达色谱柱，有效防止色谱柱筛板的堵塞。由于柱压升高在分析故障中占很大 比例，因此，除对样品和流动相进行过滤外，建议您在色谱柱进样端加上保护柱或在线过滤器。
如果去人色谱柱柱压升高是由于进样端筛板被堵引起的，科选择一下方式进行补救：
1、先在色谱柱前加上保护柱或在线过滤器，然后用甲醇、水=20/80ml/min反向冲色谱柱180min。
2、先在色谱柱进样端加上保护柱或在线过滤器，然后反向使用。
四、正确使用缓冲盐
缓冲盐通常易溶于水，难溶于有机溶剂，因此缓冲盐使用不当会使其析出，堵塞填料基质上的微孔和颗粒间的空隙，使填料板结，柱压上升；同时阻碍了基质上键合的碳链自由舒展，使色谱柱的保留能力下降，柱效降低。缓冲盐析出后，去除非常困难，因此，正确的使用缓冲盐对延长色谱柱使用寿命非常重要。
正确使用缓冲盐的目的是防止缓冲盐析出，因此正确使用缓冲盐的方法可归结为一句话：使用前要过滤，使用后要冲洗。具体方法如下：
1、等度条件：使用缓冲盐前和使用后需用过渡流动相以1.0ml/min流速冲洗60min；使用后去除缓冲盐的另一个方法是用过渡流动相以0.2ml/min流速冲洗色谱柱过夜。
2、梯度条件：用含有缓冲盐的流动相跑梯度之前，用与初始流动相组成相同的过渡流动相以1.0ml/min流速冲洗60min，再用该过渡流动相以1.0ml/min冲洗色谱柱120min。含缓冲盐流动相的梯度设定应尽量平缓，以避免梯度过程中缓冲盐析出。
注意：过渡流动相是指有机相和水相的组成与分析流动相相同，区别只是过渡流动相不含缓冲盐。
3、缓冲盐析出的补救方法：
1）方案1：用甲醇/20/80以1.0ml/min流速35摄氏度条件下反向冲洗色谱柱120min
2）方案2：用甲醇/水=20/80以0.2ml/min流速反向冲洗色谱柱过夜。
五、防止强保留物质在色谱柱上存留
强保留物质和大分子化合物在色谱柱中累积，对样品中的化合物产生额外的保留行为，不仅引起峰型变宽、拖尾，使柱效下降，同时也会引起保留时间的变化，累积到一定程度时还会导致柱压升高。由于强保留物质和大分子化合物对色谱分离的影响是一个累积效应，需要一定的时间才会体现出来，但对许多药品特别是复杂样品而言，很难判断其是否是含有强保留物质，因此要防止强保留物质的累积，需要在每天的日常维护中用纯甲醇或乙氰清洗色谱柱。
清洗方法：
1、未使用缓冲盐：每天分析完成后，先用上述方法除去缓冲盐，然后再用甲醇或乙氰反向冲洗色谱柱60min。
2、使用过缓冲盐：分析完成后，先用上述方法除去缓冲盐，然后在用纯甲醇或乙氰反向冲洗色谱柱60min
3、补救方法：
水——乙氰——氯仿（或异丙醇）——乙氰——水
每一步以1.0ml/min流速反向冲洗色谱柱60min。

‘肆’ 液相色谱柱应该如何使用和维护

一、使用前准备

1、使用前认真阅读色谱柱的说明书，了解色谱柱的种类，选用合适的色谱柱。

在选用色谱柱时，应充分考虑所分析样品的极性大小、化合物的种类数量、结构特征。根据化合物的性质，选择合适的色谱柱和分析条件。不同类型的色谱柱使用的流动相不同，使用错误的流动相会降低柱效，损伤柱子。如分析极性较大的多糖类成分，应当采用亲水性的反相填料。对于首次使用的色谱柱，还应按照厂家的出厂说明对色谱柱进行低流速的冲洗活化，活化后的色谱填料共价键键合力增强，柱效提高，寿命延长。

2、样品的准备与预处理

我们的经验是样品纯化得越干净，色谱柱的使用寿命越长。许多样品，尤其是生物样品，组份非常复杂，对色谱柱的损伤性较大，不经预处理的样品直接分析，会严重缩短色谱柱的使用寿命。因此，在样品的准备时需对样品进行预处理，包括准备溶剂的选择、样品过滤等。

2.1 制样溶剂的选择

制样溶剂通常需要考虑样品的溶解性、与流动相的相溶性、色谱填料的适用性等方面。这类溶剂需对样品有较大的溶解性，而且与流动相溶，洗脱强度最好低于流动相或梯度洗脱中的起始流动相，以免影响样品分离。目前许多手性色谱柱都禁止使用DMSO、四氢呋喃、氯仿等溶解样品，这些溶剂会破坏固定相的结构，从而缩短色谱柱的使用寿命。此外，制样溶剂还应与色谱系统其他部件如高压泵、进样器等相适用。

2.2 制样溶剂过滤

在进样前需过滤样品溶液，如采用0.22μm的微孔滤膜除去不溶性微粒，以免堵塞柱头滤片及柱内填充床。在条件允许的情况下，最好采用与色谱柱同种填料的固相萃取柱过滤进样溶液，可以减少在色谱柱上死吸附的物质或易堵塞的大分子样品。如生物样品中的小极性的油脂类易于沉淀死吸附在C18反相色谱柱中，导致柱效降低、柱压升高。采用SPE柱过滤后，可以有效减少在色谱柱中附着沉积的死吸附成分，保护色谱柱不被污染，保证其使用寿命。

2.3 其他，如溶液浓度、进样量等

分析物的某些性质同样能影响色谱柱的使用寿命。强酸、强碱性物质和蛋白质类生物大分子，它们能与固定相填料作用，或生成不可逆吸附层，改变填料表面特征，使色谱柱性能发生变化，最终导致分离失效。此外样品的进样量过大、超载都会影响色谱柱的分离性能和使用寿命。

二、使用过程中的维护

1、流动相的使用和分析方法的选择

流动相的纯度、溶剂的选择、适当分析方法的使用与色谱柱的性能和寿命密切相关。

1.1 流动相的选择

所选用的流动相应与色谱柱、待分析样品相兼容，即样品、样品溶液和流动相是互溶的。流动相能够溶解样品，避免样品沉淀析出；同时还要求流动相与样品不发生化学反应，并且要求与色谱柱不能发生溶解或化学反应。

色谱分析应选择色谱级的流动相。通常分析纯的溶剂含有微量杂质，如有机溶剂中的聚乙二醇、无机铁离子（Fe+）等，作为流动相大量使用后会引起色谱柱性能变化。最好是使用色谱纯级或者更高纯度的试剂，尽量降低溶剂中杂质带来的损伤。

1.2 流动相过滤

使用色谱纯试剂配制流动相，使用前需经0.45μm或者更小孔径的滤膜过滤和超声脱气处理，减少灰尘、微生物等杂质堵塞色谱柱，尤其是水溶性流动相易引起微生物生长而造成色谱柱阻塞。流动相最好是现配现用，放置时间最好不要超过2天。

1.3 流动相的pH和缓冲盐的选择

极端pH的流动相会破坏填料内的共价键，“溶解”硅胶，使固定相流失，从而降低柱效，缩短使用寿命。以硅胶作基质的固定相一般要求pH在2.5~7范围内使用。长期在pH>7或pH<2使用环境中，硅胶会逐渐溶解或者表面键合的官能团会逐渐流失。如果一定要用高或低pH的流动相，最好是选用相适应的色谱填料。

1.4 流速的控制

目前粒径为1.8μm的UPLC的流速常设为0.3~0.5mL/min，粒径为5μm的HPLC分析流速不大于1.5mL/min，粒径为10μm半制备柱流速控制在3mL/min。流速过大，压力升高，会引起色谱填料冲垮、塌陷。

2、色谱仪器的操作

每次开机使用分析仪器时，泵启动太快，流速和柱压的瞬间升高，柱床受到冲击，引起紊乱，产生空隙，影响色谱柱的使用寿命。因此，在操作实验开始时，应当将流速和柱压逐渐增加。

3、保护柱的使用

“保护柱”是与所使用液相色谱柱相同填料的短型色谱柱，可以有效地阻拦容易损坏色谱柱的大分子和不溶性颗粒，过滤易沉着色谱柱上产生死吸附的物质，从而延长色谱柱使用寿命。

4、柱温的控制

不同类型的色谱柱耐受的温度各有差别。通常色谱柱温维持在10～40℃之间，能够充分、最优的发挥色谱柱的性能。超出色谱柱温度范围，尤其高于柱温范围，会增加对流动相中化学物质的吸附，引起色谱柱固定相结构的改变；此外，还可能引起柱床塌陷，改变峰形，降低柱效，产生不可逆性的损伤。

三、使用后的清洗与保存

柱子使用一段时间后，总会有一些杂质累积在柱内，保留值较弱的物质，一般能快速从色谱柱冲洗出来，不产生干扰；中等保留强度的杂质能被缓慢冲洗出来，但对分析产生一定的干扰；强保留杂质通常聚集在柱头或色谱柱中，难以被洗脱，甚至可能与填料发生相互作用，形成新的伪固定相，改变色谱柱的分离性能。通常表现为柱压升高、基线不平、色谱双峰、分离性能降低等。这些被污染的色谱柱经清洗后，可恢复部分甚至大部分离能力。因此使用后认真、定期清洗，不仅能延长色谱柱的使用寿命，节省资源，还能大大降低分析的成本。以我们常用的硅胶基质色谱柱为例，简要阐述常用色谱柱的清洗与再生。

1，色谱柱的清洗与再生

色谱柱的使用前后都需经较强的流动相冲洗。通常情况下，在使用硅胶、氧化铝、极性键合相色谱柱时，每次用完后可先用二氯甲烷或正己烷等溶剂低流速长时间的冲洗；键合反相硅胶色谱柱、离子交换色谱柱和凝胶色谱柱可先用高比例的水（甲醇水混合溶剂）冲洗，再用100%甲醇冲洗。此外，色谱柱低流速的反相冲洗能够有效除去堵塞在柱头或筛板上的杂质，以及清洗聚集在柱头部位的较强吸附物质。有些色谱柱在许多方法处理污染失效后，反过来使用，不仅柱压降变小，柱效也可恢复如，延长了色谱柱的使用时间。

若上述常规清洗法无法清除污染物，则有必要采用更强的洗脱剂清洗，如反相材料的冲洗顺序为：100%甲醇→100%乙腈→乙腈∶异丙醇(75∶25，V/V)→100%异丙醇。或者可以采用较低浓度的稀酸或稀碱可将有机溶剂不能洗脱的污染物除去。例如采用0.05mol/L的硫酸和流动相溶液冲洗色谱柱，可取得良好效果；或者采用1%氢氧化铵或50%二甲基甲酰胺水溶液，对聚集在柱头的污染物具有良好的清洗效果。

如果分析时流动相中含有缓冲液（通常为盐溶液），冲洗时宜用水取代缓冲液与有机相混合冲洗色谱柱（20倍柱体积）；再用100%有机溶剂冲洗。若直接用100%有机溶剂冲洗，可造成缓冲液沉积析出，从而损坏柱子品质。同样的，若流动相中加入酸、碱溶液时，也应当按照上述方法，先采用高比例的水（水：甲醇10:90）冲洗20倍柱体积，防止强酸强碱溶液导致硅胶基质填料的溶解。

蛋白质对反相色谱柱的污染已成为常见问题，尤其在分离未经处理的动物组织等生物样品。一般情况下，纯有机溶剂如乙腈或甲醇不能很有效地清洗色谱柱，因而需要一些特殊的清洗方法。首先尝试用高比例强极性溶剂的流动相进行冲洗，如乙腈∶异丙醇（1:2,V/V）；或使用0.1%的三氟乙酸水溶液或者0.1%乙酸水溶液清洗。此外，还可以采用1%十二烷基硫酸钠 (SDS)，然后用5%～95%乙腈/水（含0.1%TFA）梯度冲洗，去除蛋白污染物效果也较好。

若采用上述的条件清洗后色谱柱仍不能达到理想的效果，有必要将固定相从色谱柱内取出，进行清洗再生后重新装填。具体操作是：将色谱固定相从色谱柱内打出后，用甲醇浮选，去除其中细小的破碎颗粒；然后用二甲基甲酰胺、丙酮、甲醇超声清洗；最后干燥固定相，重新装填色谱柱。经该方法处理的色谱柱，性能可得到显着提高。

2、色谱柱的保存

色谱柱的保存应按照使用说明书中所指明的溶剂进行填充，尽可能的贮存于100%有机溶剂。色谱柱不能贮存在水或含水量高的溶剂中，会引起微生物的滋生，影响色谱柱寿命。如反相色谱柱长期不用，最好采用90%~95%的有机溶剂混合水溶液保存，防止色谱柱因密封不严造成色谱柱两头干涸、断层引起的寿命缩短。

此外，色谱柱还应当轻拿轻放，避免剧烈碰撞引起的色谱柱填料产生塌陷、断层，缩短使用寿命。答案来自

‘伍’ HPLC的紫外检测器长期不用怎样维护

问技术支持啊 我们实验室的就那么放了好几年没用好像也没啥事再用的时候

‘陆’ 液相色谱仪是如何进行保养和维护的

转载：《分析测试网络网》
液相色谱仪的维护与保养

液相色谱仪的维护与保养

液相色谱仪是属于易学难用的仪器，特别讲究“正确使用”和经验。

液相工作者接触最多的是流动相，也就是流动相，是造成液相色谱各种问题的最主要源头。

液相色谱仪最常见的故障一是堵，二是漏。下面就这两点分别展开讨论。(注：流动相以甲醇为例，色谱柱以C18为例)

“堵”的表现现象就是柱压异常升高，直接原因就是流路不畅。堵塞的主要位置就是在色谱柱的前端，最主要原因就是流动相里有杂质，杂质的主要来源就是细菌。

“堵”的原因之一：配制流动相时细菌污染。

首先我们要认识到，一般的国产甲醇其实不需要额外过滤处理，直接使用没有问题。即使是有些固态微粒杂质，也能在液相流路系统最前端的过滤头上排除，真正容易引起问题的，是水中的细菌。

新制备的纯水在室内放置几天就会长菌，而这些细菌虽然肉眼不可见，却足以堵塞柱填料颗粒的空隙，造成柱子很快报废。这就是在配制流动相时造成的细菌污染的原因，解决它的方法很简单，就是确保水的可靠性。这里有两种方式推荐：

(1)最理想的方式当然是购买实验室专用纯水机，既方便又可靠，质量也放心。唯一的缺点就是价格不菲。

(2) 成箱购买市售品牌纯净水，如500ml 一支的怡宝或娃哈哈，这些水的质量足以应付液相色谱的要求。先随机抽取一支做一下细菌平板实验，待菌落数合格方可使用。这样每次只要单独开一支即可，也很方便。每次成本2 元左右。

这里特别指出一个细节：在绝大多数书本上，凡谈到配制流动相都会谈到最后有一个过滤的步骤。但是从我们长期使用的实际效果来说，只要能保证水的质量，这一步完全可以也应当去除。原因有以下三点：

(1)流动相过滤在理论上有好处，但是实际操作时由于不可能做到专瓶专用，反而容易造成的交叉污染，对于配比复杂的流动相影响更大。

(2)流动相过滤在经济成本上不划算。买一套过滤装置要6000多元，且过滤器公认是比较容易损坏的设备。最主要是过滤片的成本太高，一片就要几十元。按一般液相柱的正常使用寿命计算，过滤片的成本会远远高于色谱柱的成本。

(3)流动相过滤对于工作效率成本不划算。使用溶剂过滤器有一个预清洗、装备、使用、用后清洗，晾干的过程，至少也有一个小时的时间。这个成本也不能忽视。

(4)在实际工作未发现流动相不过滤会对柱寿命有任何影响。我们起码有6 年时间没有做过流动相过滤的工作，但是和国内同行相比较，在同等使用强度下我们的柱寿命是比较长的。

“堵”的原因之二：使用流动相时的细菌污染。

指的是：流动相刚开始没有长菌，在使用时却产生了细菌污染。这主要是在使用多元液相色谱仪时的一种不良使用习惯造成的。

举最简单的例子：50%的甲醇水流动相，有两种使用方式。一种方式是在上机前就配好混合在一起，另一种方式是在流路A放纯甲醇，流路B放纯水。

从单纯实验效果来说，后一种有明显的优点：首先是简单，不需要实验者另个计算配比混合，其次就是比例准确，能得到保留时间重复性极好的实验效果。

但是，它有一个致命的缺陷，就是纯水在流动相瓶中几天时间就会长细菌(很多情况下不仅仅用纯水作流动相，而是用缓冲盐溶液，本身就是优质肥料，细菌长得更迅速)，一旦有细菌柱子就坏得很快。所以这种方式要求操作人员每次实验都要用新制备的纯水，更要求在每次实验后把水相换掉，换成甲醇冲洗干净，这一点在实际工作中很多人意识不强，就是意识到了但多次使用中总有一两次会遗漏，但是往往这一两次就足以产生致命的影响。因为液相色谱柱的堵塞是不可逆的。

所以，宁可牺牲小小的保留时间的重复性，也不要用纯水溶液作为流动相的一组。从实际实验效果来说，我建议用10%的甲醇水代替纯水溶液(以前我做过不同比例甲醇水的细菌总数实验，在5%就基本可以抑菌，在10%及以上就可以完全杀菌了)，这样可以有效排除长细菌的隐患，既可作流动相，也可冲柱。就算是在配制流动相时会计算得麻烦一些，但是一次麻烦，终身受益。

"堵”的原因之三：不适当操作。

常见问题的有以下几种：

(1)在更换零件时选择的型号有误，接口不是很匹配，在拧紧的时候产生变形而使得管路堵塞。

(2)样品处理液净化得不干净，长期会在六通阀和柱之间形成阻塞不畅。

(3)在使用手动六通阀时，有些人可能由于手劲小的原因，转动的不到位，于是造成流路形成了死堵，压力快速升高超过警戒值。

(4)在使用金属管路作出废液管时，应当注意最好废液瓶中先放一些水，并把废液管的出口端放在液面下。如果位于在液相上且实验使用较高浓度的缓冲盐溶液，在停机时可能在出口端结晶成块并造成堵塞。这种情况不常见，但却的确发生过。

“堵”的原因讲了不少，现介绍查堵的方法。

在发生“堵”的现象后，就需要找出原因，主要是什么位置发生了“堵”。注意，绝大多数情况下，整个系统只会有一个地方发生堵塞。

查堵的方法是从尾向前逆向分段拆开，仔细观察压力数值，如果某一个部件(柱子除外)装上和拆下时的压力差别很大，可发展变化判断。至于柱的堵塞，可以通过换同样规格的柱的压力是否一致来判断。

下面再谈一下“漏”的问题。“漏”则分两种：漏液和漏气。

一. 漏液

液相色谱仪从流动相瓶到废液瓶之间的流路是一个全封闭体系，内部压力很高，但外部却能保证一滴不漏。如果某个部件发生了漏液，那就是故障所在。

漏液的原因分两种：

(1) 接触硬件不当。

在更换零件如流路管或换柱时，换的接头接口不匹配，造成漏液。要注意不同公司的柱子接头很多是不同的，甚至同一家公司在不同时期生产的液相柱接头也有很大区别。当然选用PEEK接头是一个较好的解决方法，不仅通用性好，而且靠手拧就能保证不漏液。

即使是接口本身是匹配的，但是如果操作不当也会漏液，一种不当就是力度把握不好，拧得太紧或太松;另一种不当就是致命的错误：滑丝，这是往往是动手能力不太强，螺丝钉很少拧的工作者犯的错误，滑丝的后果不仅是漏液那么简单，常造成重要部件的报废。解决这个问题只能靠恶补基本功来实验，那就是拧螺丝。

(2) 使用仪器不当

如果是输送泵漏液，最常见的原因就是在活塞位置缓冲盐析出造成。

析出的原因有两个，一是使用缓冲盐溶液时突然加入了纯甲醇而析出，这种错误很容易避免，这是尽量不要用纯的甲醇和纯水。只要互相有10%的比例就不会出现这个问题。另一原因是在用缓冲盐溶液(不论甲醇含量有多少)作流动相时，实验结束后没有换甲醇水冲洗，使得微渗的流动相干燥形成晶体造成。

不过，输送泵漏液并不是非得马上修不可，冲洗干净并在以后的使用中多加小心一般都可以正常使用。

检测器漏液是个很麻烦的事，一般都是吸收池的问题，更换的费用相当高。但是并不是说一定要马上更换，还可以从实际实验效果看能否凑合使用。

二. 漏气

漏液是从内部向外漏，而漏气则是外部的气体进入液相色谱仪的流路内部形成了气泡。下面按流路的方向逐个部件分析产生气泡的原因和相应解决方法。

(1) 过滤头

抽液时，在流路管中有不规则但持续的小气泡产生，这时考虑的是流动相有没有脱气(需要特别提醒即使是有了真空脱气机也是要先超声脱气的，起码可以减少脱气机的工作压力并提高工作效率)，如果已经脱了气，则要注意过滤头的污染也会造成这种现象。处理方法比较简单，拧下过滤头在稀硝酸中浸泡，超声半小时，洗净后装回去即可。

(2) 透明流路管

指的是在过滤头和输送泵之间的那一段管路。这一个部分往往不是有点气泡，而经常是整个管中全是空气而操作人员却浑然不知，以致输送泵工作了半天才发现流动相瓶里的液体一点也没少。这也是我们常说的液相色谱仪至少一周要开机一次的原因(我们做液相一定要有“微渗”的概念)。如果长时间不用，这一段管路的液体会彻底干掉，而充满空气的管路和充满液体的管路不仔细看是分辨不出的。

这种情况对于输送泵很危险，因为泵从设计来说是输送液体而不是气体，内部的液体对于活塞来说起到了机油的作用，如果活塞杆上还残存了一些缓冲盐，则极易拉伤，造成不可逆转的影响。

对于这种情况，要突出“预防为主”如：，液相色谱使用人员要相对固定和稳定，工作中合理搭配资源，每台机一周击至少作一次实验，如长期不用起码每周要冲流动相2 小时。养成良好的工作习惯很重要。

如果不慎出现了这种问题怎么办?我的建议是用外力使管路中充满液体。具体如下：

1、 找到流路管进入输送泵的接头。

2、 拧下来。

3、 用一干净的洗耳球的尖端对准管路的平整切口。

4、 吸液体，看液面从流动相瓶里上升，至离洗耳球5 厘米左右时停止该动作。

5、快速把接头拧回输送泵上(这个过程可能会有少许流动相外泄，这是正常现象)。

6、 开机，打开排液阀门，启动输送泵。

7、等排液管中流出的溶液没有气泡时，再关闭排液阀，仪器正常工作。

(3) 输送泵和柱子

这些部分进了气泡一般不怕，冲掉就行。

(4) 检测器

应该说，整个流路中只要有一个气泡都会在检测器上得到强烈的信号反映，检测器内部的气泡一般都能被冲走，但也有很难冲掉的残留气泡的情况。

如果检测器里有残留气泡，会有特征明显的表现形式，就是在走基线时会时不时间隔出现直上直下信号很大的信号峰。这时先看普通流量能否冲走，如果冲不走，那唯一的办法就是拆柱，把检测器直接连到输送泵的出口，加大几倍流量冲洗，则肯定能冲走气泡。

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‘柒’ 请问谁知道使用液相色谱仪的应注意的事项

HPLC用水来源

1 专门的纯水机或超纯水机；
2 去离子水重蒸；
3 二次或三次重蒸水；
4 采用类似家用的纯水机；
5 市场上瓶装的纯净水或蒸馏水；
6 其它途径
以上的水除第1项的水能用于梯度淋洗外，其余的水均难用于梯度淋洗。不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水，水质越高放置时间越短。
理想的HPLC用水应为18.2MΩ的超纯水，并通过0.22um的滤膜，除去热源、有机物、无机离子及空气等。
最小检测限的计算方法

（以N2000色谱工作站为例）
CL=2*Nd*c*20/HV
注：Nd 基线噪声，单位：mV
c 样品浓度
H 峰高，单位：mV（或AU）
V 进样体积
例：
如基线噪声为20微伏即0.02mV，萘的甲醇标样溶液浓度为0.0001g/L，峰高145000微伏即145mV，进样体积为20微升，即得：
CL=2*0.02*0.0001*20/145*20=2.76e-8
即10的负8次方

对仪器进行维护时应该遵循的几条基本规则

1. 一次规则
当系统出了故障，你可以试探性地改变某些状态，一次可以改变一个参数。例如，限制色谱峰脱维的问题，可以依次改变流动相，换保护柱，换分析柱等。做一些简单的改变步骤，也许就能解决问题。
2. 二次比较规则
在动手检修之前已经明确了故障所在，或者已经确定了解决故障的方案。换句话说，动手之前已经找对了解决办法。例如，在进样过程中发现内标物的峰值变低了，可以重复进样看看重复性如何，如果是偶然变低，是否是定量管里进了气泡。这个规则可用于考察系统改变后的情况。更换了流动向后在正式进样前可以进两次标准品以检查保留时间的稳定情况和色谱峰的稳定性。在梯度洗脱中如果出现了多余的峰，可以空载梯度洗脱一次（真的有问题吗？），用此规则可以避免不必要的改变，尽快确定纠正措施。
3. 取代规则
用好的部件换下可疑的部件，是查找故障的最好方法。如果你怀疑检测器引起了噪音，就换一个性能好的检测器。如果故障被排除了，就说明换下的检测器有问题。这个规则应用的规模有大有小，可以从换整个部件到换印刷线路板上的集成块。
4. 换回规则
这个规则和取代规则一起运用，好部件取代了可疑部件后情况并未得到改善，应重新换上原部件。这样做的维修费用最小，也防止了用过的部件积压下来。这条规则仅适用于单一的故障。换回原则不适用于以下的情况：
（1） 在取下时新部件已损坏（如泵密封垫圈）；
（2） 部件价格低（如柱内衬过滤片）；
（3） 重新装上原部件要冒损坏的风险；
（4） 定期更换的部件。
5. 参考条件规则
通常有两种参考条件：①标准参考条件；②试验参考条件。
标准参考条件也叫标准试验条件，是从一个系统到另一个系统，从一个实验室到另一个实验室都易于验证的条件。用该条件所测得的数据有助于识别实际试验和系统间的问题。如果在某试验条件下系统压力升高，而在标准条件下压力正常。这说明系统异常是由实验室的变化所引起的。下表列举了启用新色谱柱是的标准试验条件，在使用过程中也可用此标准试验条件检查系统的情况。
流动相 甲醇/水（体积比=70/30）
色谱柱 C18
反相 流速 1mL/min
检测器 UV 254nm
样品 尿嘧啶（用于t0）
苯酚，苯乙酮，硝基苯，苯甲醚，甲苯

流动相 正己烷/异丙醇（体积比=75/25）
色谱柱 腈基
极性键合相 流速 1mL/min
检测器 UV 254nm
样品 硝基苯，苄醇，2,4-二硝基甲苯，对硝基苄醇

流动相 正己烷/二氯甲烷/异丙醇胺（体积比=95/4/1）
色谱柱 硅胶
正相 流速 1mL/min
检测器 UV 254nm
样品 2-苯-2-丙醇，甲苄醇，肉桂醇
试验参考条件是用于检查正常系统每天的工作情况。要选最方便的方法验证这种条件。每天可以打印两张校正用色谱图作对照，检查保留时间、峰宽、系统压力等方面的变化。发现峰的斜率、色谱柱塔板数和其他参数与原来色谱图相比有了变化，说明系统在运行中可能发生了问题。当然发生问题不结合实际分析程序考虑，只通过查找标准参考色谱图是不能一目了然的。
6. 记录规则
这条规则往往被人忽视。应该在每次维护和故障排除后都作记录。例如，对系统的某一特定故障因为没作记录就不可能系统地分析问题，费时又费力。从长远挂点看，系统发生的特定故障对今后的操作也有极其重要的意义。每台仪器都应备有维修记录本，内容包括日期、故障部位、现象、产生的原因、解决的办法和结果等。还有一点要注意，试过或换下的部件都要贴上标志。
做好维修保养记录有如下好处：
（1） 让所有的操作人员都知道发生了什么故障，在操作过程中以引起注意；
（2） 帮助操作人员描述故障现象；
（3） 当再次发生故障时可根据资料尽快解决问题。
7. 预测规则
有维修实践和保养习惯的人员应能够预测系统的故障，平时在保养方面多投入些时间，系统会以减少故障作为报答，同时也消除了连锁性的损坏。例如，平时不注意保养，泵的密封垫圈坏了，造成流动相渗漏，会腐蚀泵和其它部件。善于保养能节约时间和金钱，而不是仪器控制了操作人员。例如，每天开始工作或结束工作时发现灯寿命引起基线漂移就把灯换下来。如果等到灯全坏了，就需要停机，造成的损失可能比一个灯的费用还要高。
8. 缓冲液规则
这条规则提醒你停机时一定要洗净系统中的缓冲物。系统中的缓冲物的残余会造成磨损、腐蚀和阻塞。另外，生理缓冲液极易受到细菌和霉菌的影响。理想的冲洗液是不含缓冲物的相同组成的流动相。不要让纯水储藏于系统中，以防生长细菌。可在水中加入10%的有机溶剂或0.02~0.05%的叠氮化钠。在实验室中应按如下程序冲洗：用纯水冲洗30~60min(1mL/min)再用甲醇冲洗30min后关机。千万不能一开机就用有机溶剂冲洗，否则无机盐就`会沉淀在系统中，造成不良后果。

HPLC日常维护办法之一：压力异常

操作压力的变化往往是故障的征兆。从下表中找出所观察到的现象，并在右侧的列表中参考相应的解决方法。

A、 没有压力显示，没有流动相流动
原 因 解决方法

1Q、电源问题 1A、接通电源，开机

2Q、保险丝被烧坏 2A、更换保险丝

3Q、控制器设定不正确或设定失败 3A、a、采取恰当的设定 b、修理或更换控制器

4Q、柱塞杆折断 4A、更换柱塞杆

5Q、泵头内有空气 5A、溶剂脱气、启动泵抽出空气

6Q、流动相不足 6A、a、补充流动相b、更换入口滤头

7Q、单向阀损坏 7A、更换单向阀

8Q、漏液 8A、拧紧或更换手紧接头

B、 流动相流动正常，但没有压力显示
原 因 解决方法

1Q、仪表损坏 1A、更换仪表

2Q、压力传感器损坏 2A、更换压力传感器

C、 压力持续偏高
原 因 解决方法

1、流速设定过高 1、调整流速设定

2、柱前筛板堵塞 2、a、在允许情况下反冲色谱柱 b、更换筛板c、更换色谱柱

3、流动相使用不当或缓冲盐的结晶沉淀 3、a、使用恰当的流动相b、冲洗色谱柱

4、色谱柱选择不当 4、选择恰当的色谱柱

5、进样阀损坏 5、清洗或更换进样阀

6、柱温过低 6、提高温度

7、控制器失常 7、修理或更换控制器

8、保护柱阻塞 8、清洗或更换保护柱

9、在线过滤器阻塞 9、清洗或更换在线过滤器

D、 压力持续偏低
原 因 解决方法

1、流速设定过低 1、调整流速

2、系统漏液 2、确定漏液位置并维修

3、色谱柱选择不当 3、选择恰当的色谱柱

4、柱温过高 4、降低温度

5、控制器失常 5、维修或更换控制器

E、 压力不断上升
原 因 解决方法

1、见列表C 1、见列表C

F、 压力降为零
原 因 解决方法

1、见列表A、B 1、见列表A、B

G、 压力不断下降，但不回零
原 因 解决方法
1、见列表D 1、见列表D

H、 压力波动
原 因 解决方法

1、泵中有气体 1、a、溶剂脱气b、从泵中除去气体

2、单向阀损坏 2、更换单向阀

3、泵密封损坏 3、更换泵密封

4、脱气不充分 4、a、溶剂脱气b、改变脱气方法（使用在线脱气法等）

5、系统漏液 5、确定漏液位置并维修

6、使用梯度洗脱 6、由于流动相粘度的变化引起的压力波动

HPLC日常维护办法之二：漏液

通常可以通过拧紧或更换管路接头来解决漏液的问题。但值得注意的是过份拧紧会导致金属接头的漏液和塑料接头的磨损。如果通过稍微拧紧接头不能解决漏液的问题，就必须将接头取下，检查是否损坏（例如，卡套损坏、密封表面有杂质）；损坏的接头应该更换掉。

A、 接头处漏液
原 因
解决方法

1、接头松动
1、拧紧

2、接头磨损
2、更换

3、接头过紧
3、a、拧松，再重新拧紧

b、更换

4、接头被污染
4、a、拆下清洗

b、更换

5、部件不匹配
5、使用同一品牌的配件

B、 泵漏液
原 因
解决方法

1、单向阀松动
1、a、拧紧单向阀（不必拧的过紧）

b、更换单向阀

2、接头松动
2、拧紧接头（不必拧的过紧）

3、混合器密封损坏
3、a、更换混合器密封

b、更换混合器

4、泵密封损坏
4、维修或更换泵密封件

5、压力传感器损坏
5、维修或更换压力传感器

6、脉冲阻尼器损坏
6、更换脉冲阻尼器

7、比例阀损坏
7、a、检查隔膜，如果漏液立即更换

b、检查手紧接头，损坏的立即更换

8、放空阀的损坏
8、a、拧紧放空阀

b、更换放空阀

C、 进样阀漏液
原 因
解决方法

1、转子密封损坏
1、重新安装或更换进样阀

2、定量环阻塞
2、更换定量环

3、进样口密封松动
3、调整

4、进样针头尺寸不合适
4、使用恰当的进样针

5、废液管中产生虹吸
5、保持废液管高于废液液面

6、废液管阻塞
6、更换或疏通废液管

D、 色谱柱漏液
原 因
解决方法

1、尾端接头松动
1、拧紧接头

2、卡套内有填料
2、拆下、清洗卡套、重新安装

3、筛板厚度不合适
3、使用合适的筛板（参考下表）

筛板选择指导

物质粒径
筛板孔径

3-4u
0.5u

5-20u
2u

E、 检测器漏液
原 因
解决方法

1、流通池垫片损坏
1、a、避免过大的背景压力（压力降）

b、更换垫片

2、流通池窗破碎
2、更换窗口

3、手紧接头漏液
3、拧紧或更换

4、废液管阻塞
4、更换废液管

5、流通池阻塞
5、重新安装或更换

HPLC日常维护办法之三：谱图的各种问题

液相色谱系统的许多问题都能在谱图上反映出来。其中有一些问题可以通过改变设备参数得到解决；而其他的问题必须通过修改操作程序来解决。对于色谱柱和流动相的正确选择是得到好的色谱图的关键。

A、 峰拖尾
原 因
解决方法

1、筛板阻塞
1、a、反冲色谱柱

b、更换进口筛板

c、更换色谱柱

2、色谱柱塌陷
2、填充色谱柱

3、干扰峰
3、a、使用更长的色谱柱

b、改变流动相或更换色谱柱

4、流动相PH选择错误
4、调整PH值。对于碱性化合物，低PH值更有利于得到对称峰

5、样品与填料表面的溶化点发生反应

图
5、a、加入离子对试剂或碱性挥发性修饰剂

b、更改色谱柱

B、 峰前延
原 因
解决方法

1、柱温低
1、升高柱温

2、样品溶剂选择不恰当
2、使用流动相作为样品溶剂

3、样品过载
3、降低样品含量

4、色谱柱损坏
4、见A1、A2

C、 峰分叉
原 因
解决方法

1、 保护柱或分析柱污染

图
1、取下保护柱再进行分析。如果必要更换保护柱。如果分析柱阻塞，拆下来清洗。如果问题仍然存在，可能是柱子被强保留物质污染，运用适当的再生措施。如果问题仍然存在，入口可能被阻塞，更换筛板或更换色谱柱。

2、样品溶剂不溶于流动相
2、改变样品溶剂。如果可能采取流动相作为样品溶剂。

D、 峰变形
原 因
解决方法

1、样品过载
1、减少样品载量

E、 早出的峰变形
原 因
解决方法

1、样品溶剂选择不恰当
1、a、减少进样体积

b、运用低极性样品溶剂

F、 早出的峰拖尾程度大于晚出的峰
原 因
解决方法

1、柱外效应
1、a、调整系统连接（使用更短、内径更小的管路）

b、使用小体积的流通池

G、 K’增加时，脱尾更严重
原 因
解决方法

1、二级保留效应，反相模式
1、a、加入三乙胺（或碱性样品）

b、加入乙酸（或酸性样品）

c、加入盐或缓冲剂（或离子化样品）

d、更换一支柱子

2、二级保留效应，正相模式
2、a、加入三乙胺（或碱性样品）

b、加入乙酸（或酸性样品）

c、加入水（或多官能团化合物）

d、试用另一种方法

3、二级保留效应，离子对
3、加入三乙胺（或碱性样品）

H、 酸性或碱性化合物的峰拖尾
原 因
解决方法

1、缓冲不合适
1、a、使用浓度50-100mM的缓冲液

b、使用Pka等于流动相PH值的缓冲液

I、 额外的峰
原 因
解决方法

1、样品中有其他组份
1、正常

2、前一次进样的洗脱峰
2、a、增加运行时间或梯度斜率

b、提高流速

3、空位或鬼峰
3、a、检查流动相是否纯净

b、使用流动相作为样品溶剂

c、减少进样体积

J、 保留时间波动
原 因
解决方法

1、温控不当
1、调好柱温

2、流动相组分变化
2、防止变化（蒸发、反应等）

3、色谱柱没有平衡
3、在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱

K、 保留时间不断变化
原 因
解决方法

1、流速变化
1、重新设定流速

2、泵中有气泡
2、从泵中除去气泡

3、流动相选择不恰当
3、a、更换合适的流动相

b、选择合适的混合流动相

L、 基线漂移
原 因
解决方法

1、柱温波动。（即使是很小的温度变化都会引起基线的波动。通常影响示差检测器、电导检测器、较低灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器。）
1、控制好柱子和流动相的温度，在检测器之前使用热交换器

图

2、流动相不均匀。（流动相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移。）
2、使用HPLC级的溶剂，高纯度的盐和添加剂。流动相在使用前进行脱气，使用中使用氦气。

3、流通池被污染或有气体
3、用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池。如有需要，可以用1N的硝酸。（不要用盐酸）

4、检测器出口阻塞。（高压造成流通池窗口破裂，产生噪音基线）
4、取出阻塞物或更换管子。参考检测器手册更换流通池窗。

5、流动相配比不当或流速变化
5、更改配比或流速。为避免这个问题可定期检查流动相组成及流速。

6、柱平衡慢，特别是流动相发生变化时
6、用中等强度的溶剂进行冲洗，更改流动相时，在分析前用10-20倍体积的新流动相对柱子进行冲洗。

7、流动相污染、变质或由低品质溶剂配成
7、检查流动相的组成。使用高品质的化学试剂及HPLC级的溶剂

8、样品中有强保留的物质（高K’值）以馒头峰样被洗脱出，从而表现出一个逐步升高的基线。
8、使用保护柱，如有必要，在进样之间或在分析过程中，定期用强溶剂冲洗柱子。

9、使用循环溶剂，但检测器未调整。
9、重新设定基线。当检测器动力学范围发生变化时，使用新的流动相。

10、检测器没有设定在最大吸收波长处。
10、将波长调整至最大吸收波长处

M、 基线噪音（规则的）
原 因
解决方法

1、在流动相、检测器或泵中有空气
1、流动相脱气。冲洗系统以除去检测器或泵中的空气。

2、漏液

图
2、见第三部分。检查管路接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要，更换泵密封。

3、流动相混合不完全
3、用手摇动使混合均匀或使用低粘度的溶剂

4、温度影响（柱温过高，检测器未加热）
4、减少差异或加上热交换器

5、在同一条线上有其他电子设备
5、断开LC、检测器和记录仪，检查干扰是否来自于外部，加以更正。

6、泵振动
6、在系统中加入脉冲阻尼器

N、 基线噪音（不规则的）
原 因
解决方法

1、 漏液

图
1、见第三部分。检查接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正常的噪音。如有必要，更换密封。检查流通池是否漏液。

2、流动相污染、变质或由低质溶剂配成
2、检查流动相的组成。

3、流动相各溶剂不相溶
3、选择互溶的流动相

4、检测器/记录仪电子元件的问题
4、断开检测器和记录仪的电源，检查并更正。

5、系统内有气泡
5、用强极性溶液清洗系统

6、检测器内有气泡
6、清洗检测器，在检测器后面安装背景压力调节器

7、流通池污染（即使是极少的污染物也会产生噪音。）
7、用1N的硝酸（不能用磷酸）清洗流通池

8、检测器灯能量不足
8、更换灯

9、色谱柱填料流失或阻塞
9、更换色谱柱

10、流动相混合不均匀或混合器工作不正常
10、维修或更换混合器，在流动相不走梯度时，建议不使用泵的混合装置

O、 宽峰
原 因
解决方法

1、流动相组成变化
1、重新制备新的流动相

2、流动相流速太低
2、调节流速

3、漏液（特别是在柱子和检测器之间）
3、见section 3。检查接头是否松动、泵是否漏液、是否有盐析出以及不正常的噪音。如果必要更换密封。

4、检测器设定不正确
4、调整设定

5、柱外效应影响

a、柱子过载

b、检测器对反应时间或池体积响应过大

c、柱子与检测器之间的管路太长或管路内径太大

d、记录仪响应时间太长

图
5、

a、 小体积进样（例如：10ul而不是100ul）以1：10或1：100的比例稀释样品

b、减少响应时间或使用更小的流通池

c、 使用内径为0.007-0.01的短管路

d、减少响应时间

6、缓冲液浓度太低
6、增加浓度

7、保护柱污染或失效
7、更换保护柱

8、色谱柱污染或失效，塔板数较低
8、更换同样类型的色谱柱。如果新柱子可以提供对称的色谱峰，则用强溶剂冲洗旧柱子。

9、柱入口塌陷
9、打开柱入口，填补塌陷或更换柱子

10、呈现两个或多个未被完全分离的物质的峰
10、选择其它类型的色谱柱以改善分离效果

11、柱温过低
11、提高柱温。除非特殊情况，温度不宜超过75℃

12、检测器时间常数太大
12、使用较小的时间常数

P、 分离度降低
原 因
解决方法

1、流动相污染或变质（引起保留时间变化）
1、重新配置流动相

2、保护柱或分析柱阻塞

图
2、去掉保护柱进行分析。如果必要则更换保护柱。如果分析柱阻塞，可进行反冲。如果问题仍然存在色谱柱可能被强保留的污染物损坏，建议使用恰当的再生程序。如果问题仍然存在，进口可能阻塞了，更换入口处的筛板或更换色谱柱。

Q、 所有的峰面积都太小
原 因
解决方法

1、检测器衰减设定过高
1、减少衰减的设定

2、检测器时间常数设定太大
2、设定较小的时间常数

3、进样量太少
3、增大进样量

4、记录仪连接不当
4、使用正确的连接

R、 所有的峰面积都太大
原 因
解决方法

1、检测器衰减设定过低
1、采取较大的衰减

2、进样过多
2、减少进样量

3、记录仪连接不正确
3、正确连接记录仪

HPLC日常维护办法之四：进样阀的问题

以下问题在使用进样阀过程中有可能发生。

A、 手动进样阀，转动不灵
原 因
解决方法

1、转子密封损坏
1、更换或调整转子密封

2、转子太紧
2、调整转子的松紧度

B、 手动进样阀，载样困难
原 因
解决方法

1、进样阀安装不当
1、重新安装

2、定量环阻塞
2、清洗或更换定量环

3、进样器污染
3、清洗或更换进样器

4、管路阻塞
4、清洗或更换管路

C、 自动进样阀，不能转动
原 因
解决方法

1、无压力（或电源）
1、提供恰当的压力（电源）

2、转子太紧
2、调整转子的松紧度

3、进样阀安装不当
3、重新安装

D、 自动进样阀，其它问题
原 因
解决方法

1、阻塞
1、清洗或更换阻塞部件

2、机械故障
2、见随机维修手册

3、控制器故障
3、维修或更换控制器

HPLC日常维护办法之五：由气味、景象和声音可以发现的问题

由气味、景象和声音可以发现的问题

你需要运用你所有的感官去发现液相色谱的问题。你最好养成习惯，每天花上几分钟运用你的感官（除了味觉）来“感觉”你的液相色谱是否存在问题，这样可以帮助你迅速找到问题所在。例如：在你看到漏液之前，你可能首先闻到它的气味。大部分的问题是可以通过眼睛看到。

A、 溶剂的气味
原 因
解决方法

1、漏液
1、见section 3

2、溅出
2、a、检查废液瓶是否已满

b、找到溅出的部位并清洗干净

B、 热气味
原 因
解决方法

1、仪器过热
1、a、检查并调节通风设施

b、检查并调节温度设定

c、关掉仪器，查找维修手册

C、 读数不正常
原 因
解决方法

1、压力不正常
1、见section 2

2、柱温箱问题
2、

a、检查并调节设定

b、参照用户手册

3、检测器灯失效
3、更换灯

D、 灯警告
原 因
解决方法

1、压力超出极限值
1、

a、检查是否阻塞

b、检查并调节极限值的设定

2、其它警示灯
2、见用户手册

E、 警告音
原 因
解决方法

1、溶剂泄漏/溅出
1、找到并解决

2、其它警告音
2、见用户手册

F、 刺耳的短音或长音
原 因
解决方法

1、轴承失效
1、见用户手册

2、润滑不够
2、进行恰当的润滑

3、机械故障
3、见用户手册

HPLC日常维护办法之六：常见故障及日常维护

常见故障及日常维护

下表中列出了液相色谱常见的一些问题，右侧中则列出的日常维护的方法可以减少问题出现的频率。括号中的数字是建议进行维护的时间间隔。用户手册则提供您更多的维护方法。

溶剂瓶

问 题
维 护

1、进口筛板阻塞
1、

a、更换（3-6个月）

b、过滤流动相，0.5u滤膜

2、气泡
2、流动相脱气

泵

问 题
维 护

1、气泡
1、流动相脱气

2、泵密封损坏
2、更换（3个月）

3、单向阀损坏
3、过滤流动相，运用在线过滤，准备备用单向阀

进样阀

问 题
维 护

1、转子密封损坏
1、

a、不要拧的过紧

b、过滤样品

色谱柱

问 题
维 护

1、筛板阻塞
1、a、过滤流动相

b、过滤样品

c、运用在线过滤或保护柱

2、柱头塌陷
2、a、避免使用PH>8的流动相（针对大部分硅胶的柱子）

b、使用保护柱

c、使用预柱（饱和色谱柱）

检测器

问 题
维 护

1、灯失效，检测器响应降低，噪音增大
1、更换（6个月）或准备备用灯

2、流通池有气泡
2、a、保持流通池清洁

b、池后使用反压抑制器

c、流动相脱气

一般

问 题
维 护

1、腐蚀/摩擦损坏
1、在不使用时保持系统缓冲液的清洁

‘捌’ 液相色谱c18柱子怎么维护保养

柱子维护保养无外乎使用过程中的保护及使用后的保养。
使用过程：流动相必须过滤、脱气，以防颗粒性物质堵塞柱子塞板；如果使用缓冲盐，其pH必须在适宜的范围内，不能超过柱子的承受能力范围，一般柱子pH要求范围2-8，尽量不要靠近2和8，而且换缓冲盐流动相之前必须用同等比例或者更大比例的水相切换（如用50%的缓冲盐流动相，则之前应该用大于50%的水相切换至少30min）；流动相水相容易长菌，一般两天就要换新的，有机相长时间放置从新使用也需要过滤；有可能的话，使用保护柱吧。
使用后：使用缓冲盐流动相先用水相切换，再用高比例有机相切换并保存柱子，短时间内保存（例如第二天或者一周之内要用）用大于50%的有机相保存就行，如60%甲醇：40%水，长时间内保存建议用大于80%的甲醇保存。而且保存柱子时需要密封，有必要的话可以用封口膜包裹一下柱头处。
只知道这么多，希望对你有用。

‘玖’ 高效液相色谱仪不使用时怎么维护

LZ你好！
如果你的高效液相色谱仪将有很长时间不会用，一些维护是必不可少的。
首先，要清洗管路，避免里面有残留的盐导致析晶或者长菌。
其次，清洗管路后，要用有机相保存管路，避免色谱系统长菌。
最后，虽然长期不用，但还是要周期性的开下仪器让其运转，最好再用有机相保存一下。另外室内的环境也要保持适合。

‘拾’ 液相色谱仪的日常维护需要做什么

日常维护最主要是外部除灰，还有就是常冲洗柱子，冲洗系统，每个通道不常用时都保证用甲醇或乙腈，不要用水之后放那不管，会长菌。经常擦洗针座，更换冲洗泵头的溶剂（如果需要的话），常更换滤芯和过滤白头。基本就这些了。
定期做的还有校正，检定，内部除灰和拆泵清理等。