固定化酶常用的方法与直接使用

① 固定化酶的各种方法（如：包埋法和交联法等）的具体操作流程～～～ 谢谢！！！‘‘‘‘‘

包埋法、交联法对细胞、酶的固定化操作及其比较

一． 实验目的
通过用聚丙烯酰胺包埋法和明胶——戊二醛交联法两种方法固定枯草杆菌菌体和细胞色素C，掌握细胞和酶的一些固定方法，并对它们进行固定效果的比较，了解这些固定方法的特点。

二．实验原理
酶的固定化技术是用物理或化学的方法将水溶性的酶与固态的水不溶性载体结合，使之成为一种不溶于水的仍具有酶活性的物质。固定化酶的优点在于：1）可以反复使用；2）易与产物分离，便于产物的纯化处理，提高产物的产量和质量；3）多数情况下，比水溶性的酶稳定；4）适于装柱使用，有利于生产的连续化。细胞的固定是将产酶的微生物细胞直接固定在固态的水不溶性载体上，省去了细胞破碎以及酶提取等复杂的步骤。但要求所固定的微生物能让底物和产物易透过细胞膜并且细胞内不存在产物的分解系统。所以，要固定的细胞应该是有选择性的。本实验主要是学习固定的方法，并通过比较了解这些方法的特点。丙烯酰胺在一定条件下经催化可形成凝胶，把酶或细胞包埋在凝胶的网络空隙中，形成不溶性的酶的载体。明胶是一种惰性蛋白，当与细胞或酶蛋白混合后，就把酶或细胞包埋在明胶联成的网架之中。由于菌体细胞或酶蛋白的表面都有蛋白质游离氨基，当加入双功能团试剂戊二醛以后，戊二醛即和蛋白质游离氨基形成Schiff碱，因此，在明胶表面与菌体或酶蛋白表面之间发生错综复杂的交联，从而使酶或细胞固定化。

三．主要仪器与试剂
仪器：灭菌锅，摇床，冰箱，离心机，水浴锅，紫外-可见分光光度计等。
试剂：蛋白胨，牛肉膏，明胶，戊二醛，丙烯酰胺（Acr），过硫酸铵（AP），甲叉双丙烯酰胺（Bis），四甲基乙二胺（TEMED），过氧化氢，邻苯二胺，细胞色素C等。

四．操作步骤
1．枯草杆菌细胞的培养
在超净台上将已灭菌的培养液（见实验二十七）5ml移置已灭菌的试管中，接种纯的枯草芽孢杆菌。在37℃摇床快速振荡培养8-10小时（培养液较混浊为止）。离心收集菌体，加3ml蒸馏水轻搅使菌细胞悬浮。
2. 丙烯酰胺凝胶固定细胞色素C和菌细胞
取50ml烧杯三只，各加入3ml 29%Acr-1%Bis混合液，2ml水。轻搅匀后，于1号烧杯中加入1ml菌细胞悬浮液、2号烧杯中加入1ml 0.13%细胞色素C液和在3号烧杯中加入水1ml作为对照，然后都加入10％过硫酸铵液70μl和TEMED8μl，轻搅匀后待凝。将凝固后的凝胶用水浸泡5分钟，其中换水3次。把凝胶放置滤纸上，用滤纸轻吸干，观察凝胶颜色。（可能的话，将包含菌细胞的凝胶切成较薄的薄片与对照一起在显微镜下观察）。将这几种凝胶切成小颗粒，分别取约0.5克放置于有滤纸的漏斗中，用水淋洗数次后移置试管中，各加入20mmol/L邻苯二胺4ml浸泡2分钟后加入10%过氧化氢0.04ml，混匀反应30秒，倒出上清液，以水为空白测定428nm处的吸光值，分析测定结果并解释。
3. 明胶包埋—戊二醛交联法制备固定化细胞色素C和固定化菌细胞
取50ml烧杯二只，各加入明胶1克，水4ml，于80℃水浴熔化，冷却至60℃左右分别加入2ml菌细胞悬浮液或0.13%的细胞色素C液，在搅动下迅速加入25%的戊二醛0.5ml，置于—20℃，三天后取出融化，观察比较。

② 酶的固定化方法主要有哪些

一、包埋法 定义：将酶、细胞或原生质体包埋在各种多孔载体中，使其固定化的方法。 分类：根据载体的材料和方法的不同分为凝胶包埋法（网格型包埋法）、半透膜包埋法（微囊型包埋法）。 1、凝胶包埋法：应用最广泛的固定化方法。

③ 什么是固定化酶有何优点如何制备固定化酶

什么是固定化酶？有何优点？如何制备固定化酶
1固定化酶的传统制备方法
1.1吸附法
吸附法是利用物理吸附法,将酶固定在纤维素、琼脂糖等多糖类或多孔玻璃、离子交换树脂等载体上的固定方式.
显着特点是：
工艺简便及条件温和,包括无机、有机高分子材料,
吸附过程可同时达到纯化和固定化；
酶失活后可重新活化,
载体也可再生.
但要求载体的比表面积要求较大,有活泼的表面
1.2包埋法
包埋固定化法是把酶固定聚合物材料的格子结构或微囊结构等多空载体中,而底物仍能渗入格子或微囊内与酶相接触.这个方法比较简便,酶分子仅仅是被包埋起来,生物活性被破坏的程度低,但此法对大分子底物不适用.
(1)网格型
将酶或包埋在凝胶细微网格中,制成一定形状的固定化酶,称为网格型包埋法.也称为凝胶包埋法.
(2)微囊型
把酶包埋在由高分子聚合物制成的小球内,制成固定化酶.由于形成的酶小球直径一般只有几微米至几百微米,所以也称为微囊化法.
1.3结合法
酶蛋白分子上与不溶性固相支持物表面上通过离子键结合而使酶固定的方法,叫离子键结合法.其间形成化学共价键结合的固定化方法叫共价键结合法.共价键结合法结合力牢固,使用过程中不易发生酶的脱落,稳定性能好.
该法的缺点是载体的活化或固定化操作比较复杂,反应条件也比较强烈,所以往往需要严格控制条件才能获得活力较高的固定化酶.
1.4交联法
交联法是用多功能试剂进行酶蛋白之间的交联,使酶分子和多功能试剂之间形成共价键,得到三向的交联网架结构,除了酶分子之间发生交联外,还存在着一定的分子内交联.多功能试剂制备固定化酶方法可分为：
(1) 单独与酶作用；
( 2) 酶吸附在载体表面上再经受交联；
( 3) 多功能团试剂与载体反应得到有功能团的载体,再连接酶.交联剂的种类很多,最常用的是戊二醛,其他的还有异氰酸衍生物、双偶氮二联苯胺、N,N-乙烯马来酰亚胺等.
交联法的优点是酶与载体结合牢固,稳定性较高；缺点是有的方法固定化操作较复杂,进行化学修饰时易造成酶失活
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竞争性抑制剂与被抑制的酶的底物通常有结构上的相似性,能与底物竞相争夺酶分子上的结合位点,从而产生酶活性的可逆的抑制作用.与酶的活性中心相结合.与酶的结合是可逆的.
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增大底物浓度可以减弱竞争性抑制剂的影响.

④ 固定化酶的制备方法

固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类。
物理方法包括物理吸附法、包埋法等。物理法固定酶的优点在于酶不参加化学反应,整体结构保持不变,酶的催化活性得到很好保留。但是,由于包埋物或半透膜具有一定的空间或立体阻碍作用,因此对一些反应不适用。
化学法包括结合法、交联法。结合法又分为离子结合法和共价结合法。是将酶通过化学键连接到天然的或合成的高分子载体上,使用偶联剂通过酶表面的基团将酶交联起来,而形成相对分子量更大、不溶性的固定化酶的方法.
其中吸附法和共价键法又可统称为载体结合法。 吸附法
利用各种吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使酶固定的方法。通常有物理吸附法和离子吸附法。
常用吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等。
采用吸附法固定酶，其操作简便、条件温和，不会引起酶变性或失活，且载体廉价易得，可反复使用。
载体结合法
最常用的是共价结合法，即酶蛋白的非必需基团通过共价键和载体形成不可逆的连接。在温和的条件下能偶联的蛋白质基团包括：氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基。参加和载体共价结合的基团，不能是酶表现活力所必需的基团。以中国首先采用的双功能团试剂“对位-β-硫酸酯乙砜基苯胺”偶联载体和酶为例，载体结合的步骤如下页反应式。
此法曾先后用于3′-核糖核酸酶、5′-磷酸二酯酶和葡萄糖淀粉酶等的固定化。此外酶通过物理吸附或离子吸附于载体制备固定化酶也是常用的方法。
交联法
依靠双功能团试剂使酶分子之间发生交联凝集成网状结构，使之不溶于水从而形成固定化酶。常采用的双功能团试剂有戊二醛、顺丁烯二酸酐等。酶蛋白的游离氨基、酚基、咪唑基及巯基均可参与交联反应。
包埋法
酶被裹在凝胶的细格子中或被半透性的聚合物膜包围而成为格子型和微胶囊型两种。包埋法制备固定化酶除包埋水溶性酶外还常包埋细胞，制成固定化细胞，例如可用明胶及戊二醛包埋具有青霉素酰化酶活力的菌体，可连续水解帤基青霉素，工业生产6-氨基青霉烷酸。
酶经过固定化后，比较能耐受温度及pH的变化，最适pH往往稍有移位，对底物专一性没有任何改变，实际使用效率提高几十倍（如5′-磷酸二酯酶的工业应用）甚至几百倍（如青霉素酰化酶的工业应用）。 特点 吸附 共价链接 包埋 膜限制 制备 简单 难 难 简单 费用 低 高 中等 高 结合力 易变 强 弱 强 损失 有 无 有 无 适用性 广 有选择性 广 非常广 运转问题 高 低 高 高 基质效应 有 有 有 无 溶解度 无 无 有 有 抗微生物特性 无 无 有 有

⑤ 酶的固定化方法有哪些各有何分缺点

固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类。物理方法包括物理吸附法、包埋法等。物理法固定酶的优点在于酶不参加化学反应,整体结构保持不变,酶的催化活性得到很好保留。但是,由于包埋物或半透膜具有一定的空间或立体阻碍作用,因此对一些反应不适用。化学法是将酶通过化学键连接到天然的或合成的高分子载体上,使用偶联剂通过酶表面的基团将酶交联起来,而形成相对分子量更大、不溶性的固定化酶的方法.

⑥ 直接使用酶,使用固定化酶和固定化细胞催化反应,都有哪些缺点

各自的缺点如下：
直接使用酶：对环境条件非常敏感，容易失活；溶液中的酶很难被回收，不能被再次被利用，提高了生产成本；反应后酶会混在产物中，可能影响产品品质。
使用固定化酶：一种酶只能催化一种化学反应，而在生产实践中，很多产物的形成都是通过一系列的酶促反应才能得到的。
使用固定化细胞：固定后的细胞与反应物不容易接近，可能导致反应效果下降。由于大分子物质难以自由通过细胞膜，因此固定化细胞的技术也受到限制。

⑦ 把酶固定化有什么好处和用处固定酶的方法有那些

酶工程的实现，体现在酶的半衰期的延长和酶活的稳定性。采用固定化可以显着提高这两个指标，固定化酶所用载体是比较多的，比如树脂等。
是指利用酶催化剂所具有的特异催化功能，借助工艺学手段和生物反应器装置来生产所需的生物化工产品的过程，与发酵过程相比，它采用了反应专一性的酶为催化剂,无副产品,过程精制和产物分离纯化较方便。在生物反应器及操作方式上有较大的选择余地，除分批釜式反应外，可考虑用膜式反应器进行连续操作。在应用固定化酶为催化剂时，更可采用各种固定床和流化床的连续操作反应器。
沿革 古代人类虽不知道酶的存在，但是自古以来就知道利用植物和微生物的酶来催化反应生产各种食品。如利用麦芽中的麦芽糖酶来制备饴糖，利用酒药中的微生物产生的淀粉酶和酒化酶来生产酒酿、黄酒和白酒等。随着科学技术的发展，人们认识到，虽然酶是活细胞产生的，但是许多酶可以单独分离得到，在分离的状态下，酶仍然能继续它的生物催化作用。20世纪40年代，以生产抗生素为代表的深层液体通气纯种培养技术获得成功，从生产技术方面为酶制剂工业的形成创造了条件。以后，酶的生产、分离、精制，酶在游离状态下的利用，固定化酶的制备和利用，酶反应器的应用等技术的发展，导致70年代初人们将酶反应过程（有时也称酶过程）从发酵过程中分出去，单独成为酶工程中的核心部分。
分类 以酶为催化剂的酶反应过程，可根据作用于底物的酶性质决定。以单一酶为催化剂的反应称单酶反应；以两个酶或两个以上酶参与反应的过程称多酶反应；或称多酶串联反应。从化学反应工程角度出发，可分为单（液）相催化反应以及多相催化反应，后者以液固相催化反应为主。游离酶的反应常属前者，而固定化酶的反应则属后者。
组成步骤 以工业生产为目的的酶过程可由以下五个步骤所组成：
①产生酶的微生物发酵过程。
②胞内酶的微生物细胞破碎过程。可用机械研磨、高压匀浆器进行破碎;也可用加入溶菌酶的方法处理,或用超声波、反复冻融的物理方法。胞外酶则不需上述操作，直接将发酵液过滤除去菌体即可。
③酶的分离纯化过程。根据酶分子与其他蛋白质之间性质的差异，例如分子的大小、溶解度的不同，用盐析法、有机溶媒沉淀法、电渗析法、离子交换层析和电泳法等技术，将酶进行分离纯化。
④为了提高酶的催化性能，将酶固定在载体上的固定化过程（见固定化酶）。
⑤酶反应器的设计和酶反应控制。对于游离酶反应，通常采用分批搅拌槽反应器；对于固定化酶反应，则常用连续柱式反应器（见生物反应器）。
典型过程 有单酶反应和多酶反应。
①单酶反应 用氨基酰化酶对酰化DL－氨基酸进行水解,析出为L-氨基酸和酰基-D-氨基酸是典型的单酶反应。

若采用液相催化反应，当间歇反应结束后，给产物的提取带来困难。由于缺乏适当分离手段，酶使用一次就被弃掉，很不经济。目前，工业上采用液固催化反应，即用固定化氨基酰化酶进行连续生产（见图）。底物乙酰-DL-氨基酸溶液以一定流速进入酶反应柱，反应过程中对温度、pH进行控制，经过浓缩后，利用溶解度不同进行分离得到产品L－氨基酸。酰化-D-氨基酸用化学方法进行消旋化反应后，作为基质循环使用。该法与用液态酶间歇式反应相比较，有操作稳定、分离简便、收率高、成本低等优点。

②多酶反应 以DL-α-氨基-ε-乙内酰胺为原料通过由L-α-氨基-ε-已内酰胺水解和α-氨基-ε-已内酰胺消旋酶共同固定的酶柱后，即可获得最终产品L-氨基

⑧ 固定化酶的方法

固定化酶是借助于物理和化学的方法吧酶束缚在一定的空间内并仍具有催化活性的酶制剂。
制备方法有：1、吸附法 是酶分子吸附于水不溶性的载体上，有物理吸附法及离子交换剂吸附法。
2、共价结合法 将酶通过花些反应以共价结合与载体的固定化方法。
3、交联法 用多功能试剂与酶蛋白分子进行交联的一种方法。其基本原理是酶分子中有力的氨基、酚基及咪唑基均可与多功能试剂之间形成共价键，得到三相的交联网状结构。
4、包埋法 是将酶物理包埋在高聚物内的方法。

⑨ 简述酶的固定的方法及优点

与自然酶相比，固定化酶和固定化细胞具有明显的优点（也就是为什么要进行酶的固定化）： 一、可以做成各种形状如颗粒状、管状、膜状，装在反应槽中便于取出，便于连续、反复使用。
二、稳定性提高，不易失去活性，使用寿命延长。
三、便于自动化操作，实现用电脑控制的连续生产。
方法：物理方法包括物理吸附法、包埋法等。化学法包括结合法、交联法。
各种方法优缺点
1·吸附法 ：利用各种吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使酶固定的方法。 常用吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等。 采用吸附法固定酶，其操作简便、条件温和，不会引起酶边形或失活，且载体廉价易得，可反复使用。
2·包埋法 酶被裹在凝胶的细格子中或被半透性的聚合物膜包围而成为格子型和微胶囊型两种。优点酶包埋在聚合物中不易漏出;操作条件温和、对外界环境的缓冲作用大，可防止酶体的机械损伤,易于再生,产物分离提取容易。3·共价结合法（属化学法中的结合法）即酶蛋白的非必需基团通过共价键和载体形成不可逆的连接。共价结合法酶与载体之间结合紧密，不易脱落，稳定性好，但反应条件激烈，操作复杂，控制条件苛刻，活力损失较大
4·交联法 依靠双功能团试剂使酶分子之间发生交联凝集成网状结构，使之不溶于水从而形成固定化酶，此法制备的细胞与载体结合紧密，但制备麻烦，活力损失较大