㈠ 初中物理实验室的器材摆放应如何贴标签,有一定的分类标准吗
一、设施设备的管理问题
中小学校理科实验室的设施设备主要包括仪器橱柜、实验桌凳、水电设施及其他通用设备。管理好实验室的设施设备,有利于提高实验室的投资效益,有利于营造洁净、整齐的科学实验氛围,有利于提供文明、安全和高效的实验教学环境。实验室的设施设备管理一般包括以下内容:
1、仪器橱柜的管理
存放仪器的橱柜要色调一致,摆放整齐。仪器橱柜摆放时应注意采光、通风、美观和方便等要求,同时还应考虑便于仪器分类存放。一般情况下仪器橱呈一字形排列,橱门要与窗户垂直,便于通风。各排仪器橱柜之间要留有不少于1米的通道,便于取放。仪器橱柜一般不要靠墙摆放,非靠墙不可的,橱与墙之间应留有10厘米左右的通风空间。一般新旧仪器橱柜要相对分开,高矮、式样相近的仪器橱要放在同一排或同一室。仪器橱柜定位后要编序号,序号一般编在仪器橱柜正面(或左)上方。
2、实验桌凳的管理
学生实验桌应排列整齐,色调一致,每张实验桌应编有序号。为了保护桌面,有条件的学校可在实验桌面上垫耐酸碱的橡胶板或橡塑板。实验凳应尽量不要使用长凳或椅子,采用不易摇晃的单人凳为适宜,便于起坐和走动。要教育学生爱护实验桌、凳,不要在实验桌、凳上乱涂乱写,实验完成后要认真清理实验器材以保持桌面的洁净。
3、实验室水电设施的管理
实验过程中经常要用水和用电,所以水源和电源设施是实验室必不可少的设施。水电设施应充分保证教师演示实验和学生实验的需要,必须能集中控制,以保证安全和便于检修。水源必须设置可以关闭的总水阀,电源应由配电柜控制。要教育学生爱护水电设施,不要旋转送水管道和整体水龙头,不要将抹布晾在水龙头上(必要时可晾在水池边上),不要拉松电源线,注意保护电源插座。实验教师(实验员)要经常检查电路、接地线、漏电保护器及有关设备是否正常,发现问题要及时采取有效措施。
5、其他通用设备的管理
实验室内的各种配套设施要做到巧安排,要适合实验室管理与使用的要求,做到布局合理,整齐划一。在实验教学及仪器药品保管过程中会产生各种有害气体,因此实验室和药品保管室都要建立良好的通风排气装置,以便及时把有害气体排出室外。普通实验室和保管室一般都采用比较经济的排气扇通风装置,有条件的学校可采用先进的、吸气能力强、噪声低的管道汇流式通风装置。实验教师要经常检查通风设施,检查是否完好,发现问题及时采取相应措施。实验室应配备废液处理装置,实验中废液应收集,并经集中处理后排人污水管道。
随着现代科学技术的发展,中小学实验教学中除了运用各种传统的实验手段外,现代教育技术手段也在逐步普及,如视频展示台、投影机等多媒体设备已成为实验室的常用设备。这些设备的使用弥补了传统实验方法的不足,提高了实验教学的质量,达到了良好的实验教学效果。但一般的中学化学实验室湿度大,药品较多,腐蚀性强,不宜固定安装多媒体投影设备,可配备移动式多媒体投影设备。小学科学、中学物理与中学生物实验室则可将多媒体投影设备固定安装在实验室的适当位置,方便教学时使用。实验教师应熟练掌握多媒体设备正确的操作方法,且设备应由专人负责管理,记录好使用、维修、定期检查和保养情况,出现故障时应请专业人员修理。
二、仪器及器材管理问题
实验室里的仪器品种繁多、规格各异、使用频繁,要管理好实验室内各种仪器,就应从编制仪器添置计划、采购、到货验收、建档、建账、分类存放到保管、维修等各个环节都要做到缜密处理,按照一定的规章制度办事,才能繁而不乱、忙而不疏、有条不紊,才能有利于实验教学的进行。
(一)、仪器添置
随着实验的开设和教材的调整,实验室必须正常添置、补充仪器和药品,一般每学期或每学年补充一次。实验教师要依据教材和教学的需要,参照教育主管部门制订的仪器配备目录和实验室仪器药品库存情况编制仪器添置计划,并征求任课教师意见,经校领导批准后,报主管部门代购或自购。采购仪器及实验材料、药品要及时,不能影响实验教学的正常进行。
采购仪器时要严把质量关,教育部制订的《教学仪器设备产品一般质量要求》和《教学仪器设备产品的检验规则》是判定仪器质量是否合格的主要依据。对于没有制订国标、部标的仪器,就要以行业标准或企业标准为准(但须要由设备供应商提供)。
(二)、仪器验收
采购进来的仪器应先验收后使用。验收的一般程序:开箱察看,核对仪器的名称与数量是否与货单相符,查看仪器说明书,检查仪器的所有配件是否齐全,整机有无损伤。根据仪器说明书,检测仪器的基本性能,有的要开机检测,有的还应通过实验操作来检验仪器的质量。实验仪器的及时验收,有利于及时发现仪器品种、数量、质量等问题,以便及时与购买者或仪器厂家取得联系,在保质期内免费更换或维修,减少损失。验收结束应及时将全套仪器(含零部件)存人相应的仪器橱内,说明书要集中收集,归类成册,以便日后查阅。同时要及时填写仪器验收记录,并将仪器记入“仪器分类账”。
需要特别提醒的是,各实验教师(实验员)要将非本学科使用的仪器及时送交相应学科的实验室,不要将其他学科的仪器滞留,以免影响其他学科使用。
(三)、仪器编号
验收入库的仪器一般都应贴标签或用专用记号笔标记,即在仪器不显眼位置注明仪器编号。教育部颁发的仪器配备目录中,每一种实验仪器均有一个固定的由5位数字组成的编号,每位数字代表不同的含义。每件仪器除编有固定的编号外,还应编上同种仪器的顺序号,如:20个学生电源,则它们的顺序号分别为1到20。同种仪器的顺序号不能重复。由于大量仪器本身即可知道名称,在仪器编号时可以只写仪器的固定编号和顺序号,如第5支米尺,写上“10003—5”即可,这样可减少大量工作。给仪器编顺序号的目的是为了能准确管理到每件仪器,间接了解仪器使用寿命、质量等情况。在准备学生实验时还可以将仪器序号与实验桌号相对应,便于仪器在使用中的管理。新到的化学试剂应检查标签是否脱落,字迹是否清楚,最好在试剂瓶上另行贴上写有试剂分子式的标签,并上蜡保护;配制的学生实验用试剂瓶上的标签要直接写清分子式和溶液浓度。标签张贴的位置要适宜,字迹端庄,大小适当。同一台(套)仪器的主件或附件,都应写上同一编号,以免主、附件错乱而影响使用。各校也可根据本校实际确定编序号方式。在条件允许时,可使用计算机打印的标签。
(四)、仪器分类与存放
仪器的分类与存放既要有条理性,又要符合科学性。一般情况下,要求做到:①按仪器、药品的自身特点归类进行科学摆放,以利于仪器保养和实验室安全;②存放既要整齐美观,又要科学分类,以便进行维护和查找。因此,仪器分类与存放的原则:分类科学、陈列有序、整齐美观、取用方便。
1、分类
仪器分类要注意以下几点:
①、不同学科仪器要分开。
②、同一学科仪器也要按学科特点分开摆放。如物理仪器按力学、电学、光学、热学等分类,也可按《配备标准》中的学科大类编号,分为通用(0)、测量(1)、专用仪器(2)、模型(3)、挂图、软件及资料(5)、玻璃仪器(6)、药品(7)、其他实验器材和工具(8)等。化学仪器与药品分开,危险药品与一般药品分开。化学仪器又可按金属仪器、玻璃仪器、配套仪器分类;化学药品按无机物、有机物分类,无机物又可分为单质、酸、碱、盐等,有机物又可按官能团分为醇、酚、醚、醛、酮、酸、酯等。生物仪器按一般仪器、标本、模型分类,标本又可分为浸制标本、剥制标本、骨骼标本、切片标本等,标本与模型可再按植物、动物和生理卫生三个类别分别依次存放。
③、演示仪器和分组仪器相对分开。
如学校仪器较多,条件较好还可以分得再细一些。规模较大的学校一般是一学科一层楼,农村学校可将物理与生化仪器分室存放。总之,要因地制宜,做到分学科分室存放。
2、存放
分类是为了存放,一般情况下同一类仪器要放在同一排或相邻的几个仪器橱柜内。有条件的学校可将同一类仪器独室存放,如专门设置生物标本室、物理力学仪器室等。特别强调的是化学药品必须独室存放,危险药品必须专室(柜)存放。因教育部颁发的仪器配备标准中已将仪器按学科、性质、教学内容进行顺序排列,因此存放时依照仪器编号顺序,再在同一橱柜内作适当调整即可。
(五)、仪器人橱存放必须注意以下几点:
1、符合仪器自身特点的原则。要防止因存放不当而损坏仪器或降低仪器寿命。如:①磁铁要防止振动、退磁,要使磁路闭合。条形磁铁要两两相对,对应交错,使异性磁极相衔;蹄形磁铁要成对异性相靠,单个蹄形磁铁中间要加一衔铁;小磁针要静止在地球磁场的方向。②仪表存放时要将全部开关置“零位”。③电表存放时要短路保护,磁电式仪表(如演示电表)要避开强磁场存放。④仪器一般都要正放、平放,不能堆放,以免互相叠压变形。天平、显微镜、电表、验电器等不能倒放或侧放。⑤光学仪器、电子仪器、生物标本和各种挂图等都不能放在有阳光直射的地方。⑥定型的成套化学实验装置要存放于固定橱柜内,以备下次再用。⑦化学试剂要放在干燥、阴凉、通风的地方。具有挥发性的药品要密封保存。易燃、易爆、有毒药品要有专门的保护措施。⑧玻璃仪器品种多,大小形状各异,易损坏,要根据器皿的形状制作专用放置架,或横卧,或竖插,分组人柜存放,避免相互碰撞而损坏。⑨生物显微镜、解剖镜等要放入原包装盒内存放,以防尘、防潮等等。⑩对干燥要求较高的仪器应放在仪器橱的中上方。再如:剥制标本注意防蛀;浸制标本添液孔向上;磨口的试剂瓶的瓶盖、针筒的内外筒应取出后编号存放,以防日久粘连或因温度变化膨胀使玻璃开裂;乳胶管应清洁后放滑石粉,以防橡胶老化后走胶失效;传动皮带应卸下以防老化等等。
仪器的存放有具体的要求,应不断总结规律,尤其是随教材变化,新的科技产品进入实验室,这些仪器的合理保管与保养更需要我们去探索、总结与交流。
2、符合美观原则。仪器存放陈列要纵横整齐,存放有序,有条不紊,美观大方,要讲究艺术性,要像商店布置橱窗一样精心摆放仪器。仪器存放要做到橱内分层,层内定点,定橱、定位存放。要尽可能做到轻件、小件在上,重件、大件在下;矮件、小件在前,高件、大件在后。当较高的仪器在一层(如人体半身模型等)橱内放不下时,应调整隔板高度来解决,也可将特别高大的仪器集中专橱或根据仪器量身定做橱柜存放;有条件的学校可专门制作双面玻璃柜,集中于一室或放在实验室内相对封闭的公共场所,用来存放生物模型和各类标本,供学生课后观赏;鸟兽剥制或仿真标本要依形定位(似展览橱窗)存放室内,供学生参观。陈列给学生观察的各类标本应附上写有名称、学名、产地、特性等内容的相关说明;各学科挂图、图片资料要制作专用图架摆放等。总之,要做到科学性与艺术性的有机结合。
3、符合取用方便的原则。仪器存放陈列要便于管理和使用。仪器到实验室后要进行安装、试验,并组装成可使用状态存放。常用仪器、特小件仪器要放在仪器橱中间位置,同一仪器的主附件、零配件要放在一起,同时使用的仪器也要尽可能放在一起。
在仪器入橱摆放时要注意以下几点:同一层橱内放不同的学生实验用仪器时应按块排列,块与块间留有一定间隙,见图
同一层橱内放置多种演示仪器时应纵向列队放置,教师实验时可依次取用,见图。
有的学校将多种仪器排列成,见图
则取用和放置里面的仪器时必须先拿去前面的仪器,十分不便。
以上是仪器分类存放的几点原则。在实际操作过程中,常常会出现相互矛盾的现象,这时应综合考虑,首先保证符合仪器自身特点的要求,然后再考虑符合美观和方便取用的原则。
(六)、建卡
仪器归类存放后,还要以仪器橱柜为单位建橱柜卡。仪器橱柜卡是为了便于查找而标明某仪器橱内存放仪器品种、数量和位置的卡片。一般在卡上设有“仪器(或器材)编号”、“名称”、“现存数量”和“橱柜号”等栏目,橱柜卡要设计美观,大小适中,纸质要厚,最好用电脑打印。一般每橱柜设一张卡,如存放仪器品种较多,上半橱柜和下半橱柜可各设一张卡。橱柜卡一般用透明胶带固定于仪器橱正面、玻璃背面的右上角的玻璃上。固定橱柜卡的位置要统一,如仪器橱规格差别较大,则也要保证同一室或同一排仪器橱柜卡的位置统一。
另外,存放仪器的橱柜要按学科统一编号,橱柜上要张贴定位标签。可按橱内仪器的类别用较显着的标记制作分类定位标签固定在仪器橱柜的左上方,要做到整齐美观。
实验室橱柜卡
类别 橱号
编号
仪器(或器材)名称
规格
现存数量
(六)、仪器维护与保养
仪器在长期存放过程中受周围环境的影响会产生质地变化、性能变差等问题,甚至报废。因此,实验教师要依据仪器自身特点,做好维护与保养工作,使仪器经常处于良好可用状态,以延长其使用寿命。
1、仪器维护、保养工作的重点是做好“八防”
①、防尘。灰尘能使光学仪器透光率降低,使静电仪器绝缘性能下降,使电位器、开关、继电器等接触不良,能使高压电源部分火花放电,甚至造成短路,还能影响散热元件正常散热。例如,机械的运动部件有灰会增加机械磨损,金属表面有灰会粘附水汽而生锈,静电仪器粘附灰尘会影响绝缘性能,光学仪器粘附灰尘会影响透光度,使镜头霉变等等。仪器本身要定期擦抹或用机械吸尘除灰,特别是精密贵重仪器(如气垫导轨、电子仪表),要经常保持洁净,有的要装入原包装盒内存放,有的要加盖防尘罩等。通常,仪器的防尘应做好以下两方面工作:一是要截断尘源,如仪器室常关闭门窗,平时将窗帘拉上;用湿拖把清洁仪器室内地面;仪器橱的门要密闭;在精密仪器上盖布等等。二是定期对仪器进行除尘的常规保养,除在仪器使用过后入橱前进行一次保养外,还应做到每年对橱内的所有仪器进行一次除尘保养。仪器保养应备有专用工具,如各种规格的刷子、洗耳球、擦镜纸、清洁的软布等,有条件的还可添置小型吸尘器。
②、防潮。湿度对仪器设备的影响很大。对于较长时间存放的电子仪器、电气设备要定期通电;对于精密光学仪器长期搁置不用时,要装进专用的盒子里或塑料袋里,并放上干燥剂。常用的干燥剂有硅胶等。如果仪器室是平房或是底楼,地面必须经过防潮处理。在放置仪器橱、架时应与墙壁留有一定的距离。在无风的干燥天气要做好仪器室的通风换气工作,平时要利用自然通风调节室内温、湿度,有条件的学校应配备除湿机。存放精密仪器及电子仪表的橱柜内要放置干燥剂(如氯化钙、硅胶等),并要定期更换或除湿。
③、防腐蚀。药品储藏室内和化学实验室中进行实验时,空气中会散逸着多种有害气体,如二氧化硫等等。这些气体会造成金属腐蚀,影响仪器的使用寿命。因此仪器应与药品分开保管,药品室应安装排气风扇,实验室要有通风设施。另外,使用时要用到干电池的万用表、激光笔等仪器,入橱保管时必须将电池取出,防止电液析出腐蚀电路。
④、防霉变。霉菌对各种仪器均有破坏作用,其中对光学仪器、生物标本、无线电设备更为严重。为防止仪器霉变,精密仪器可密封保管,并放入干燥剂,使其内部空气干燥、清洁。标本可采取晾晒,浸制标本要注意补充保护液。
⑤、防锈蚀。仪器使用后用布擦拭金属部件表面或涂中性凡士林,运动部件要涂机油,贵重精密仪器要涂钟表油,旋钮部件涂黄油,转动部件要加润滑油。
⑥、防变形。仪器不得堆放、挤压,要防碰、防压,平放正放,避免重力或其他外力引起仪器变形。如:机械仪器用完要按要求拆开或拆松放置,防止弯曲变形;传动皮带使用后应及时松下;弹簧发条用后要完全松开,解除变形;木直尺要水平叠放;天平不用时应在托盘架下垫上橡胶垫圈,以免刀口长期受压变形。
⑦、防虫蛀。生物剥制标本、骨骼标本、昆虫标本等特别容易被虫蛀,一般可采用放卫生球(樟脑丸)或熏蒸的方法防虫、灭虫。
⑧、防震。精密仪器、高档仪器要轻拿轻放。投影器(仪)、投影机在使用的过程中不要搬动,使用完毕待冷却后再搬动,以防灯丝在高温下断落。
2、特殊仪器的维护与保养
①、剥制标本。剥制标本不能和浸制标本混放,保管时要特别注意通风、干燥。因剥制标本受潮后毛皮易腐烂,毛发易脱落,梅雨天前后更要利用晴好天气,打开窗户通风或直接放到室外晾晒。为防止标本被虫蛀蚀,橱内需放人硅胶(干燥剂)、樟脑或合成樟脑(除虫剂),一般每年按春秋分两次对标本室进行熏蒸。常用杀虫灭菌药剂有二硫化碳、四氯化碳、溴甲烷、甲醛、氢化物(剧毒)等。如已发生虫蛀,可在密封环境内用磷化铝、二氯乙烷熏蒸(熏蒸时要特别注意安全,防止中毒),还可将2.5%溴氰菊酯原液稀释成浓度为1:250后进行喷洒。
②、骨骼标本。A、骨骼标本应放在干燥、通风的标本橱中保存,避免阳光直射,以防骨骼发黄,关节脱开和脱胶。B、使用骨骼标本应轻取轻放,不要剧烈震动和撞击,以防骨骼脱开和细小骨骼断裂。C、如发现标本有脱胶,可用聚醋酸乙烯胶粘合,再用线缚扎固定,待胶凝固后拆掉缚线。D、如果骨骼断裂,可以用聚醋酸乙烯胶粘接修补。
③、昆虫标本。这类标本在其盒子里的下角常设有樟脑角,出厂时一般放有樟脑或卫生球,学校验收时要进行检查,如发现没有要及时添加,以后要定期检查。
④、显微镜。A、显微镜用过之后,一定要人箱保管以防灰尘落入光学部件上,要经常对某些光学器件用毛笔刷去灰尘,再用细绸布或专用的长纤棉擦拭,切不可用普通粗布或绒布去擦。因为这些材料不仅纤维粗糙而且易染有灰尘,会划伤光学件表面,使之发毛。若镜面上粘有污物不易擦去,可先用绸布或专用的长纤棉蘸少许二甲苯擦拭,然后再换一块干净的绸布或擦镜纸去擦拭干净。但二甲苯用量要少,擦拭次数不宜太多。因为显微镜的透镜多是由几层透镜用树脂粘在一起的,二甲苯会使树脂溶解。另外,显微镜的镜头也不要用酒精去擦,以免被破坏。长期不用的显微镜镜头可集中放入干燥缸内,干燥缸内放有用纱布包裹的生石灰,并定期检查生石灰是否失效。B、显微镜不可置阳光下曝晒,以免晒熔树脂而毁坏镜头。③显微镜更不可和化学试剂存放在一起,以防有害气体腐蚀。C、不要在阴雨天擦拭显微镜,以防湿气侵入镜内造成锈蚀。D、擦拭显微镜的机械部分时,不要涂油。传动部分只可涂少许润滑脂而不能用油,以防滑动。E、任何时候,镜筒内必须插有目镜,或套上套盖,以防灰尘从上部进入镜筒中。(可向生产显微镜的厂家购买专用于保养显微镜的长纤棉和润滑脂。)
三、仪器借还
教学仪器借还分为教学用借还和非教学用借还两种。
教学用仪器借出由借用人填写《仪器借还记录》。该记录一般设计为表格式,主要栏目有借取日期、仪器名称、借取人签字、归还日期。非贵重、民用仪器和非危险品借出时,仪器名称栏可简填为“某某演示实验仪器一套”。实际操作时管理人员可以先填好,借用人领取时签字即可。
非教学用仪器借出必须由借用人出具借条,经学校相关领导批准后方可借出,管理人员要注意及时收回。
四、仪器的报废
实验过程中由于人为或教学仪器本身出现下列情况时,可以申请报废:①仪器超过使用年限、性能已不能达到实验需要的最低要求,且无法修复;②损坏严重,无法修复;③主要部件无处配购,无法修复使用;④修理费昂贵,无修理价值。
教学仪器的报损和报废应由学校实验室负责人组织鉴定,证实无修理价值和使用价值,经过学校领导审核和批准后,方可办理注销手续,并保存人档,做到有账可查,有据可凭。实验教师(实验员)个人不得擅自处理。仪器的报废工作应定期进行,根据实验室规模,一般1~2年进行一次。
报废的仪器须适当处理,处理方式有以下几种:①实验室留用:虽然作为一件整体仪器,性能已达不到最低要求或无法修复,但是仪器的部分零部件可能还是完好的,可以拆下来用于同类仪器的修复。②建立废旧仪器实验室,向学生开放,让学生利用课外时间,在教师指导下,拆卸、安装仪器,开展兴趣实践活动。③调剂与赠送:由于经费、人员等原因,仍有许多基层学校缺乏基本的实验仪器,因此报废的仪器可以调剂或赠送给条件差的学校,作为示教仪器。④废品出售处理:在上述几方面都无法使用的报废仪器,可以作为废品出售,由废品回收部门收回,作为再生资源。
五、化学药品管理
化学实验所用的药品也称化学试剂,主要有固体和液体两类,气体都是临用时制备的。化学试剂各有特性,有些试剂容易潮解,有些易风化,有些受光照后容易变质,所以必须放在干燥通风的地方,防止受强烈的阳光照射。还要注意取用方便,分门别类依一定的顺序排列。
(一)、化学药品的分类
初中化学试剂近一百种(小学科学课的药品较少,就不讲了,可参照初中化学课药品的管理方法)。管理好化学试剂的前提是将化学试剂进行分类。目前中学化学实验室里大多先把试剂分成无机和有机两大类。
无机物再按固体和液体分成两类,然后按单质、酸、碱、盐分类。单质分为金属和非金属,盐类按酸根分为卤化物、硫酸盐、硝酸盐、碳酸盐等。有机试剂按官能团分为醇、酚、醚、醛、酮、酸、酯、糖、含氮化合物、含卤化合物、含硫化合物等。
(二)、化学药品的验收与存放
化学药品入库验收时应核对试剂的品名、数量、包装、规格,并及时登记。检查包装是否合格,即包装是否符合试剂的保管要求,容器有无破损、渗透,是否密闭。检查标签是否清晰,是否粘贴牢固。检查试剂有无变质现象及变质迹象。验收完后,应将试剂按要求归类妥善存放。有问题的试剂应及时处理。
1、化学药品要专室存放。药品室应干燥、阴凉、通风,具有防火措施。危险品应放在危险品柜(室)内,单独保管。同时要注意安全,防止火灾、中毒、爆炸、风化、潮解、曝光、挥发等。在此前提下,再根据试剂特点,注意取用方便。
2、有些用量较大的试剂如酸类,如一次购买较多,不必全部开箱人橱,可将部分另存。
3、在分类存放的同时,将学生分组试剂瓶、教师演示实验试剂瓶及已配好待用的大瓶试剂单独存放。为达到化学试剂查找方便、先购先用和避光等目的,在存放化学试剂时可每个品种中取出一瓶放在橱的上半部分作正在使用药品,橱的下半部放多余的试剂,下部试剂的同一品种纵向排列,做到先购的放在前面,新购的排到后面。使用时当上面一瓶内的药品使用完后再从下面取出一瓶补充。
4、室内要保持适宜的温、湿度,要防止试剂瓶上的标签脱落或腐蚀,一般采取在标签外面涂一层石蜡保护。少数购进时用塑料代包装的试剂,入库后要改装存放在试剂瓶中,并贴好标签。受光照易分解或变质的试剂如硝酸银、碘化钾、过氧化氢等,要用棕色玻璃瓶盛装,并放在低温阴暗处;容易挥发、潮解或风化的试剂,盛装的玻璃瓶要用石蜡封口,并经常检查封口的严密性。氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钡、碳酸钠、碳酸钾的溶液必须盛装在带有橡胶塞的玻璃瓶中,浓硫酸等要盛装在带玻璃塞的瓶子中等等。
(三)、定期检查药品
化学药品在保管中要注意定期检查。检查药品是否变质、失效,检查保存液(如水、煤油等)是否挥发缺少,检查标签是否腐烂、脱落,文字是否模糊不清。如发现问题及时采取相应措施。一般试剂的使用应遵循“先进先出,后进后出”的原则。化学实验对试剂的消耗量较大,既要注意安全保管,又要考虑到厉行节约,杜绝浪费。
(四)、危险药品管理
化学试剂品种繁多,各有特性。凡具有易燃、易爆、腐蚀、毒害等危险性质,在一定条件下能引起燃烧、爆炸或中毒等,导致破坏财产和引起人身伤亡事故的化学药品统称为化学危险品。中学化学实验接触到的危险药品有下列八类,保管时特别要注意安全。
①、易燃液体:这类药品主要是有机试剂,极易挥发成气体,如遇明火就会燃烧。如汽油、苯、甲苯、二甲苯、甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、乙酸乙酯、松节油等,应单独存放在阴凉通风处,特别要注意远离火种。
②、易燃固体:无机物如红磷、硫磺、镁粉、镁条、铝粉等,有机物如硝化棉、樟脑等着火点都很低,容易着火,应隔开存放。
③、自燃品:白磷放置在空气中被氧化发热,温度逐渐上升,会自行着火燃烧,应保存在水里,并放在避光阴凉处。贮存白磷的瓶子的三分之二应埋入黄沙内保管,以防冬天瓶子里的水结冰将瓶胀破,致使白磷外露而引起危险。
④、遇水易燃烧的物品:金属钾、钠、电石、锌粉等与水接触就会产生易燃气体,如果在反应过程中发生的热量不易消散或接触明火,这些气体就会燃烧,有时甚至引起爆炸,贮存时应特别注意。金属钾、钠应贮存在煤油里。盛电石和锌粉的瓶子必须封严密闭,防止受潮。
为防止玻璃瓶因气温变化或其他原因碎裂,放有这类试剂的瓶子的三分之二也应埋入黄沙内保管。
㈡ 同位素标记法的实验介绍
选定放射性标记剂的比活度λqδ的值必须足够大,以保证实验所需要的灵敏度,而又要尽可能地小,使得在该实验条件下辐射自分解可忽略。一般情形是根据实验目的和实验周期长短,来选择具有合适的衰变方式,辐射类型和半衰期,且放射毒性低的放射性同位素。至今已确定的放射性核素包括天然的58种和人工制造的约1300种,其中大多数不常能用作放射性标记剂。主要原因是制备困难、半衰期不合适及放射性不足以定量。在任何一种生产方法中,生产步骤很可能包含或多或少的化学处理,因而标记实验人员需要了解某个核素及其周围的那些元素的化学性质,因为它们有可能成为此放射性同位素的杂质。
放射性同位素都衰变(经过或不经过中间状态)到处于基态的子体核素,衰变时伴随各种形式的能量辐射,如α、β-、β+、γ、X放射等。在选择标记剂时,标记实验人员要仔细研究衰变纲图,根据实验条件和计数条件来决定那一种辐射,在衰变纲变内,代表核能级的两条水平线之间和距离表示能量差,↑或↓表示能级同伴随原子序数增或减少的能量,↓表示从激发态至基态的同质异能跃迁。一般要选择最适宜的半衰期τ的放射性同位素,使τ足够长,从而使衰变校正有意义或干脆不必作衰变校正,同时又要足够短,能较安全地进行标记实验,并使得放射性废物容易处理,在实际工作中,使用的放射性同位素的半衰期应该与实验需要持续的时间t相适应,如对于某个实验,t/τ=0.04时,应所选放射性同位素的衰变校正为3.5%;而t/τ=0.10时,应选放射性同位素的衰变校正为6.6%。t/τ=0.15时,应选用其衰变校正为10%。
在体外标记条件,一般选用半衰期较长而射线强度适中,既利于探测,又易于防护和保存的放射性标记剂。体内标记条件下,若实验周期短,应选用半衰期短,且能放出一定强度r射线物放射性同位素,若实验周期长,如需要将动物活杀后对组织脏器分别测定的,则应选用半衰期较长放射性同位素。此外,根据实验目的来选用定位的或不定位的标记标记剂,例如研究氨基酸的脱羧反应,14C应标记在羧基上,只有这种定位标记的氨基酸,才能在脱羧后产生14CO2。而有些实验不要求特定位置标记,只须均匀标记即可。
选择放射性标记剂还必须同时满足高化学纯度,高放射性核纯度的要求。在标记剂制备期间、贮存期间以用试验体系中所使用的溶剂、化学试剂、酶等可能会产生化学杂质、放射化学杂质及辐射自分解引起的放射性杂质,这些杂质的存在,使得标记实验中使用的标记剂不“纯”,而或多或少影响实验的结果,甚至会导致错误结论。 氚标记的胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)和尿嘧啶核苷(3H-UR)是两种常用的标记剂,前者有效地结合到DNA中,后者则掺入到RNA中,它们的辐射分解速度随比较放射性的增高及保存时间的延长而增加,在不同温度和不同溶液中的稳定性也不同。
经保存八年的3H-TdR约有35%辐射分解为3H-胸腺嘧啶,并导致二醇和水合物的形式,在实验中这杂质会很快掺入细胞并与大分子(很可能是蛋白质)结合,而不是与DNA和RNA相结合,这些杂质用DNA酶和RNA酶处理细胞都不除去。3H-TdR和3H-UR贮存在-20℃的冷冻溶液中辐射分离速度要比+2℃增加3-4倍,但低温度(-140℃)对贮存也有利,在允许对标记实验人员在选择保存放射性标记剂时会有所启发。 测量方法的选择取决于射线种类,对于α射线通常可用硫化锌晶体、电离室、核乳胶等方法探测;对能量高的β射线可用云母窗计数管、塑料闪烁晶体及核乳胶测定,对于能量低的β射线可用液体闪烁计数器测量:对于γ射线则用G-M计数管,碘化钠(铊)闪烁晶体探测。目前大多数实验室主要采用晶体闪烁计数法和液体闪烁计数法两种测量方式。
同一台探测仪器对不同量的标记剂具有不同的最佳工作条件,在实验准备阶段要检查探测器是否已调有所用标记同位素的工作条件,否则需要用一定量的标记剂作为放射源(或选用该同位素的标准源),把探测器的最佳工作条件调整好,并且要保证探测器性能处于稳定可靠的状态。
探测最佳工作条件的选择方法:一种是测“坪曲线”,另一种是找最好的品质因素。对于光电倍增管,在理论上不存在“坪”(plateau)。但随着高压的增加,在一定范围内,脉冲数变化较小,形成一段坡度较小的电压脉冲曲线,通常也称其为坪。测坪曲线的方法:固定放射源,根据其射线能量的大小,初选 一个广大器增益(放大倍数)和甄别器阈值。不断地改变高压(由低到高,均匀增加伏度),每改变一次高压,都测定一次本底和放射源的计数率,最后作出高压本底计数率和高压放射源计数曲线。
用同样的方法,作另一个甄别阈值(放大倍数不变)下的高压计数率曲线,这样反复多作几条曲线。必要时,还可固定甄别阈值,改变放大倍数,求出高压计数率曲线。应选择“坪”比较平坦的曲线工作条件:甄别阈值和放大增益,作为正式测定时间的仪器工作条件,高压值应选择在该“坪”中点偏向起始段一边相应的高压值。品质因素,又称为优值,是指在一定条件下,要达到合适的统计数目所需要的时间是仪器的计数效率E和本底计数Nb的函数: 品质因素F=E2/Nb它是衡量一台计数器性能的指标,仪器的品质因素F应该越大越好,品质因素F越大,表示测量效率E越高而本底Nb越小。
如果某放射性标记的标准源存在来源困难等问题的话,可以用相对品质因素f来代替。 相品质因素f=ns/nb 式中ns指某种放射性样品的计数率。找最好品质因素的方法与测坪曲线一样,作出几条高压-F(或f)的关系曲线,在几条曲线中选择峰值最高的曲线。这根曲线的峰值所对应的条件:高压,甄别阈,放大倍数等,就是该仪器对被测同位素的最佳工作条件。最佳品质因素不一定恰好落在“坪”上,有的在“坪”附近,有的却在“坪”的下端。着眼于把同位素的整个能谱峰都计下来的标记实验者主张取“坪”所对应的工作条件,而着眼于优值者,主张取最佳品质因素所对应的工作条件,也有人折衷。如果某仪器本底很低,光电倍增管噪音很低和能谱分辩高,二者应该相差不大。同一台仪器的最佳工作条件,随仪器的使用期延长而有所改变,不同的放射性同位素,其最佳工作条件不同。因此核探测仪器的最佳工作条件具有专属性,并且要经常通过选择其不同时期的最佳工作条件。更不能不问被测同位素的种类,而千篇一律地使用同一个工作条件。
为了达到准确地计数,可以长时间一次计数,或短时间多次测量,两者达到的标准误基本相同,为避免外界因素的影响,在实际工作中,取短时间多次测量较为合理适用。在测量样品的放射性时,本底是一个重要影响因素。本底高,则标准误和标准误差都增大,尤其在样品计数较低时,本底对标准误和标准误差的影响就愈大,从而影响实验结果的精度,而且为了达到一定的精度,势别要增加样品的测量时间。根据核衰变的统计规律,在实验中如果样品数量少,选择tN=1.4tb的比例(式中tN为样品放射性测量时间,tb为本底测量时间)较为合理;如果样品数量较多是一大批样品,则延长本底测量时间tb,取tb的时间均值,而tN则可相对短,这样可节省时间,有利于缩短实验周期。对于标记实验设计来说,样品中所含放射性强度的要求,是使其放射性计数率大于或等于本底计数的10-20倍。
㈢ 用125I标记抗原,直接标记法最常用于以下哪些物质的碘化标记
简单说,放射性碘标记法,标记的化合物内部必须有碘原子可结合的基团,即结构上要含有酪胺基或组织胺残基。凡蛋白质、肽类等抗原,在结构上含有上述基团的可直接用放射性碘进行标记。如不含上述基团的,放射性碘无法标记,必须在这些化合物的结构上连接上述基团后才能进行碘标记。具体点,放射性碘标记在RIA中,标记抗原质量的优劣,直接影响测定结果,必须制备比放射性强、纯度高的标记抗原,并保持免疫活性不受丧失。一、同位素的选择同位素有稳定性和放射性两种。放射性同位素可利用其衰变时放出的放射线进行测量,这种测量较灵敏而方便,故多用放射性同位素。标记抗原,常用的放射性同位素有3H、14C、131I和125I等。在使用上各有其优缺点,可根据所进行的放射免疫分析的类型特点,标记物制备和供应情况以及实验室设备条件等作适当的选择(表8-1)。大多数抗原分子中都含有C、H等原子,所以用14C或3H标记不改变抗原的结构及其免疫学活性,且14C、3H半衰期长,所标记的抗原长时间放置后仍可使用,这都是其优点。14C或3H标记的不足之处是操作较繁琐,并难以获得高比放射性的标记物;3H及14C放出的都是弱β射线,需用较昂贵的液体闪烁计数器方能获得较高效率的测量,且测定操作也较麻烦。但某些抗原用放射性碘标记容易丧失免疫化学或生物学活性者,则仍以采用3H或14C标记物为佳。表8-1标记抗原常用的放射性同位素及其性质放射性元素半衰期射线种类及能量(百万电子伏特)βγ14C5720年0.155-3H12.5年0.0189-125I60天-0.035131I8.05天0.608,0.335,0.2500.364,0.637,0.722大多数抗原分子中是不含碘的,引入碘原子就改变了抗原的分子结构,往往容易损伤抗原的免疫化学活性;且放射性碘的半衰期较短,标记物放置后因衰变使放射性降低,因而需要经常制备标记物或要求能定期提供放射性碘标记都能适用,放射性碘放出γ—射线,用一般晶体闪烁计数器就能获得较高效率而精确的测量,测量操作也很简单。由于这些突出的优点,目前在放射免疫分析中,使用放射性碘标记物最多。从应用角度来看,131I和125I又各有其优缺点,可根据实验的要求、仪器的条件和放射性碘制剂的规格等条件合理选用。但相对而言,125I有较多的优点,一是半衰期适中,允许标记化合物的商品化及贮存应用一段时间;二是它只发射28keV能量的X射线和35keV能量的γ射线,而无β粒子,因而辐射自分解少,标记化合物有足够的稳定性。放射性碘适用于放射免疫分析许多对象(包括蛋白质、肽类、固醇类、核酸类以及环型核苷酸衍生物等)的标记,且操作简单,一般实验室都不难做到。二、蛋白质与多肽激素的放射性碘标记要制备高比度、高纯度与免疫化学活性好的标记物,首先要有高纯度、良好免疫活性的抗原。用作放射标记加网免疫分析的特异性,所以若用纯度不高的抗原作标记,则标记后必须采取适当的步骤除去杂质,以获得高纯度的标记物。标记对象的纯化应尽量采用温和的方法,否则在纯化操作中已受潜在性损伤的蛋白质(这时表面上活性可能还是良好的),再经标记反应时所受的损伤,活性就会显着降低,影响以后的放射分析结果。有了好的纯抗原,还要采用适当方法加以标记,尽量获取高比放射性、而又能保持良好的特异免疫化学活性的标记物。这些都是放射免疫分析能取得高特异性和高灵敏度的关键问题。多肽激素与蛋白质多用碘标记,最常用的是125I。碘化反应的基本过程如下:通过氧化剂的作用,使碘化物(125I-)氧化成的碘分子(125I2),再与多肽激素、蛋白质分子中的酪氨酸残基发生碘化作用。所以不管采用哪一种放射性碘标记法,标记的化合物内部必须有碘原子可结合的基团,即结构上要含有酪胺基或组织胺残基。凡蛋白质、肽类等抗原,在结构上含有上述基团的可直接用放射性碘进行标记。如不含上述基团的,放射性碘无法标记,必须在这些化合物的结构上连接上述基团后才能进行碘标记。因此影响蛋白质、多肽碘化效率的因素,主要决定于蛋白质、多肽分子中酪氨酸残基的数量及它们在分子结构中暴露的程度;此外,碘化物的用量、反应条件(pH、温度、反应时间等)及所用氧化剂的性质等也有影响。常用的标记方法有:(一)氯胺T法氯胺T法标记效率高、重复性好、试剂便宜易得,是目前使用最多的碘标记方法。1.原理氯氨—T(Chloramine--T)是一种温和的氧化剂,在水溶液中产生次氯酸,可使碘阴离子氧化成碘分子。这活性碘可取代肽链上酪氨酸苯环上羟基位的一个或两个氢,使之成为含有放射性碘化酪氨酸的多肽链。2.方法以125I—AVP的制备为例。(1)碘化反应:AVP5μg+0.5mol/lPB50μl(pH7.5)+1251800μCi,混合后,加入新配置的Ch—t30μg/15μl(0.05mol/lPB,pH7.5)。迅速振荡混匀,室温下反应40s。(2)终止碘化反应:加入还原剂偏重亚硫酸钠40μg/20μl(0.05mol/lPB,pH7.5),以终止碘化反应。(3)Bio—GelP2层析纯化:将碘化反应混合液注入Bio—GelP2柱,用0.1nHAC溶液洗脱,分部收集,每2min收集一管,共收集60管。(4)放射性测量:测定各收集管的放射性,出现两个峰,第一峰为125I—AVP,第二峰为游离碘盐峰。第一个峰中计算最高的几管,留下备用。为了解标记抗原的质量,每次碘标记后应计算出碘的利用率,标记上多少放射性碘,以及每微克抗原结合上多少放射性碘。(5)标记抗原的贮存:经纯化与检查后的标记物、加入1/8体积的异丙醇,分成若干小份,置于铅罐中,在-20℃以下的冰箱中贮存备用,应避免反复冻融。标记抗原在贮存中是不稳定的,这是因为:一是脱碘,标记的碘从原来位置上脱落,变成游离碘;二是蛋白损伤、变性,成为聚合大分子或断键成小分子碎片。由于上述原因,使B/F明显降低,标准曲线斜率变小,以致不能使用,故需分离纯化,其方法是用SephadexG100长柱(40~80cm)过柱,洗脱后出现3个峰。第1个峰分子量大,是蛋白变性的聚合的大分子,尚保留部分抗原决定簇,免疫活性弱;第2个峰是纯抗原的蛋白峰,免疫活性好;第3个峰是游离125I或小分子碎片,不具备免疫活性。收集到的第2个纯抗原蛋白峰,免疫活性好;第3个峰是游离125I或小分子碎片,不具备免疫活性。收集到的第2个纯抗原蛋白峰,其性能类似于新鲜标记的抗原。分离纯化的方法解决了标记抗原的贮存、长期使用问题,特别对来之不易的抗原更显得重要。2.注意事项(1)放射性碘源的选用:无载体的131I或125I均可用于碘化标记,但应尽量选用新鲜的、比放射强度高的、含还原剂量少的放射性碘源。碘源的比放射强度最好≥50~100mCi/ml,至少也要>30mCi/ml,否则加入碘源的容量要增加,随着带入碘源中含有的还原剂(为放射性碘源运输保存所需加入)量也增加,这将会显着降低碘利用率及标记蛋白比放射强度。放置较久和放射性碘源,一方面因衰变致比放射强度降低,另一方面因水的辐射化学产物增多(主要是131I源),都会降低标记时的碘利用率。放射性碘源含还原剂(如Na2S2O5等)量多时,会抵消氯胺T的作用,降低碘利用率,甚至导致标记完全失败。放射性碘源要用无载体的,标记所用全部用具和试剂必须不含碘;只要有极少量的碘的污染,非放射性碘就会稀释放射性碘,使放射性碘利用率显着降低。为了便于放射性防护和除污染,以及减少射线对蛋白质分子的损伤,标记投入的放射碘量不宜过大,一般以0.5~1.0ml)时则影响较小。微量氯胺T法放射碘标记时,一般多控制碘化反应体积<100μl。(5)碘化反应温度:温度升高,碘化反应速度加快,碘利用率有所增加。但总的来看,反应温度的影响不很大,一般从0℃到20℃碘利用率相差不过百分之几,故一般在室温下进行标记操作就可能获得重复性好的结果。有些蛋白质或肽类极易丧失活性,则可在0℃进行碘化反应。(6)碘化反应的pH值:受氧化剂氧化生成的活性碘,对多肽链的酪氨酸基苯环羟基邻位的碘化作用,最适pH是7.3~7.8之间。当pH变化时,碘化位置也会发生变化,例如pH值较高时,组氧酸的咪唑环也可被碘化;当pH4~5时,活性碘能迅速氧化色氨酸基生成羟基吲哚,导致肽链断裂。这些都会影响蛋白质或多肽的放射性碘化反应,或引起降解或失活。因此作放射性碘化标记时,除放射性碘源外,所有的试剂都应用适当的缓冲液配制,保证碘化反应在最佳pH条件下进行。(7)微量蛋白质或多肽的吸附损失:界面的吸附损失,在使用大量蛋白质或多肽类时是可以忽略的,但作微量法标记时投入的蛋白质或多肽类只在微克甚至毫克甚至毫微克水平,界面吸附导致的损失就不能忽略。例如制备131I—ACTH时,所用ACTH浓度低到50Pg/ml时,因表面吸附可损失10%~30%,甚至高达75%。改变pH、加入非特异性载体蛋白、或使用聚苯乙烯、聚乙烯容器时,能减少吸附,但不能完全消除。一般残留在反应管和滴管上的放射性为投入总放射性的2%~8%、残留在层析柱上折占5%~10%。残留量随标记蛋白比放射性强度而直线增减,残留者几乎全部都是标记蛋白。由此可见,微量蛋白质或多肽受吸附而损失的量是不容忽略的。由于微量蛋白质、多肽会被显着吸附而丢失,所以标记时投入蛋白质、多肽量过微(如<2μg)也是不适宜的,否则标记蛋白质、多肽的收回率会太低,并在计算上会造成较大的误差。(8)不同蛋白质、多肽碘化标记的差别:由于不同的蛋白质和多肽分子中含有的酪氨酸数目不同,而且其空间结构也不相同,分子中的酪按酸残基有的容易发生碘化反应,有的就不容易碘化,因此同样条件下进行碘化标记,不同蛋白质或多肽对碘的利用率是不相同的。不同蛋白质经碘化标记后生物活性受损的情况也各不相同。例如ACTH、促性腺激素释放激素(GRH)、促黄体激素释放激素(LRH)等多肽,碘化标记后容易丧失激素活性或与受体结合的活性;而AFP及人绒毛膜促性腺激素(HCG)等的碘化标记,则较容易保存良好的免疫化学活性。尽管不同多肽、蛋白度的碘化标记结果有所差别,但上述讨论的因素对不同多肽、蛋白质碘化标记的影响有共同的规律。掌握了这些因素,就容易成功地获得合格的标记物。不同多肽、蛋白质的分子量大小、理化性质各不相同,放射碘化标记反应后,可根据具体情况采取不同的方法将标记蛋白质(或多肽)与未反应的游离放射性碘及受损伤的标记物分开,常用的方法有凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析、各种电泳法等。
㈣ 酶联免疫法的酶标记法
酶与抗体交联,常用戊二醛法和过碘酸盐氧化法。郭春祥建立的HRP标记抗体的改良过碘酸钠法简单易行,标记效果好,特别适用于实验室的小批量制备。其标记程序为:将5μg HRP溶于0.5ml蒸馏水中,加入新鲜配制的0.06 mol/L的过碘酸钠(NaIO4)水溶液0.5ml,混匀置4℃冰箱30分钟 , 取出加入0.16mol/L的乙二醇水溶液0.5ml,室温放置30分钟后加入含5(g纯化抗体的水溶液1ml,混匀并装透析袋,以0.05mol/L、pH9.5的碳酸盐缓冲液于4℃冰箱中慢慢搅拌透析6小时(或过夜)使之结合,然后吸出,加硼氢化钠(NaBH4)溶液( 5(g/ml)0.2ml,置4℃冰箱2小时,将上述结合物混合液加入等体积饱和硫酸铵溶液,置4℃冰箱30分钟后离心,将所得沉淀物溶于少许0.02mol/L、pH7.4PBS中,并对之透析过夜(4℃),次日离心除去不溶物,即得到酶标抗体,用0.02mol/L、pH7.4PBS稀至5ml,进行测定后,冷冻干燥或低温保存。
㈤ 高中生物有什么实验用同位素标记法所有的…
高中阶段的实验不可能用到同位素标记法,这对实验室的条件要求太高了!但是我们在高中阶段接触过同位素标记的实验,最典型的就是:
1、光合作用中氧18标记水,追踪氧的去处;碳14追踪二氧化碳的转化路线;
2、T4噬菌体实验中,磷32和硫35分别标记DNA和蛋白质,确定谁是遗传物质的实验;
3、用氮14标记DNA研究其复制过程,总结出了DNA的半保留复制。
㈥ 基因探针的探针标记
探针是能与特异靶分子反应并带有供反应后检测的合适标记物的分子。利用核苷酸碱基顺序互补的原理,用特异的基因探针即识别特异碱基序列的有标记的一段单链DNA(或RNA)分子,与被测定的靶序列互补,以检测被测靶序列的技术叫核酸探针技术。探针制备就是将目的基因进行标记。特异性探针有三种形式——cDNA、RNA、寡核苷酸。cDNA和寡核苷酸是目前最常采用的探针。RNA探针用途很广,也容易获得,但其不稳定性限制了其商业用途。cDNA探针的获得是,将特定的基因片段装载到质粒或噬菌体中,经过扩增、酶切、纯化等复杂的步骤,才能得到一定长度的cDNA探针。这一过程比较复杂,有相应条件的实验室才能做到。寡核苷酸探针是在已知基因序列的情况下,由核酸合成仪来完成,可廉价获得大量的此类探针。质量也相对来说更为稳定。由于cDNA探针长度通常为数百至数千个碱基,所以有良好的信号放大作用,但其渗透性比较差。寡核苷酸探针一般为十数个至数十个碱基,渗透性强,但信号放大作用则较差,合成的多相寡核苷酸探针,敏感性可以达到cDNA探针水平。
探针的标记方式有放射性标记和非放射性标记。标记物质有放射性元素(如32P等)和非放射性物质(如生物素、地高辛等)。32P是最常用的核苷酸标记同位素,被标记的dNTP本身就带有磷酸基团,便于标记。特点是比活性高,可达9000Ci/mmol;发射的β射线能量高。用它标记的探针自显影时间短,灵敏度高。32P的半寿期短,虽使用不方便,但为废弃物的处理减轻了压力。非放射性标记法有酶标法和化学物标记法。酶标方法与免疫测定ELISA方法相似,只是被标记的核酸代替了被标记的抗体,事实上被标记的抗体也称为探针,现有许多商品是生物素、地高辛标记的。血凝素与生物素有非常高的亲和性,当血凝素标记上过氧化物酶或碱性磷酸酶,经杂交反应最终形成探针-生物素-血凝素酶复合物(ABC法),酶催化底物显色,观察结果。ABC法底物显色生成不溶物,以便观测结果。酶标记法复杂、重复性差,成本高,但便于运输、保存,灵敏度与放射物标记法相当。 ①缺口平移标记法。利用的是DNA聚合酶I能修复DNA链的功能。该法先由DNaseI在DNA双链上随机切出切口,然后DNA聚合酶I沿缺口水解5´端核苷酸,同时在3´端修复加入被标记核苷酸,切口平行推移。缺口平移法快速、简便、成本相对较低、比活性相对较高、标记均匀,多用于大分子DNA标记,(>1000bp最好),但单链DNA、RNA不能用该法标记。
②随机引物法。随机引物是指含有各种可能排列顺序的寡聚核苷酸片断的混合物,因此它可以与任意核苷酸序列杂交,起到聚合酶反应的引物作用。将待标记的DNA探针片断变性后与随机引物一起杂交,然后以此杂交的寡聚核苷酸为引物,在大肠杆菌DNA聚合酶I大断段(KlenowFragment)催化下,合成与探针DNA互补的DNA链,当在反应体系中含有a-32P-dNTP时,即形成放射性同位素标记的DNA探针。具有上述优点,可代替缺口平移法。此外大小、单双DNA均可标记,标记均匀,标记率高,但也不能标记环状DNA。随机引物法标记探针一般长400~600bp。
③末端标记法(又叫尾标)。利用末端转移酶可进行“尾标”,尾标适用于寡核苷酸探针标记,寡核苷酸探针多用于核酸“点”突变的检测,该探针可用核酸合成仪人工合成,克隆出的探针一般较长,特异性好,标记量大,杂交的检出信号强。 1、4—6微米切片,用防脱片胶(多聚赖氨酸)处理过的玻片贴附
2、56—60℃烤片2—16h
3、新鲜二甲苯脱蜡,10minX2(趁热脱蜡)
4、100%乙醇5minX2次,不用浸水,直接空气干燥
5、加入50μl蛋白酶K工作液(蛋白酶K用蒸馏水稀释,浓度为25μg/ml),37℃消化10—15min
6、弃去蛋白酶K工作液,0.1MTBS洗涤3minX3次逐级酒精脱水(85%,95%,100%酒精)1minX3次然后空气干燥
7、加入20μl探针,加盖薄膜。(探针用预杂交液稀释,浓度为5μg/ml)。
8、95℃变性10—12min;立刻置于冰块上,防止复性。
9、37℃杂交16—20h
10、揭去薄膜,每张切片加入以下杂交后洗涤液:
>用2—3滴2XSSC37℃洗涤3minX2次;
>0.5XSSC37℃洗涤3minX2次;
>0.2XSSC37℃洗涤3minX2次;
11、0.1MPBS/TBS缓冲液洗涤,1minX3次
12、滴加小鼠抗地高辛生物素标记的抗体工作液,37℃孵育45—60min;
13、0.1MPBS浸洗,5minX3次
14、滴加高敏碱性磷酸酶链亲和素复合物工作液,37℃孵育45—60min。
15、0.1MPBS浸洗,5minX3次
16、滴加NBT/BCIP显色6—16h,
17、双蒸水终止反应(37℃10min—2h),双蒸水浸洗,5minX2次
18、滴加核固红,30秒—5min;
19、双蒸水浸洗,5minX3次
20、脱水、透明、封片
㈦ 实验室中常用的DNA分子量的测定方法有哪些
第一种方法最常用
1)紫外吸收法也就是测量OD(260)和OD(280)的吸收值,这样的方法其它的杂质对测量结果影响大一点,因为其它杂质在这两个吸收波长也有吸收.
(2)荧光法,用PicoGreen荧光染料,测定DNA,RNA浓度比较灵敏,并且适合测量低浓度和微量DNA和RNA,并且受其它杂质的影响不大,缺点要有专门的荧光检测仪器,试剂比较昂贵.
纯化DNA可以买试剂盒,主要有膜吸附法,磁珠分离法,都很方便.
RNA与DNA最重要的区别一是RNA只有一条链,二是它的碱基组成与DNA的不同,RNA没有碱基T(胸腺嘧啶),而有碱基U(尿嘧啶).所以导致他们有以下性质上的不同.
1.两性解离:DNA无,只有酸解离,碱基被屏蔽(在分子内部形成了H键).RNA有,有PI.
2.粘度大:DNA;RNA,粘度由分子长度/直径决定,DNA为线状分子,RNA为线团.
3.碱的作用:DNA耐碱RNA易被碱水解.
4.显色反应:
鉴别DNA和RNA+浓HCl RNA ------→ 绿色化合物
DNA ------→ 蓝紫色化合物苔黑酚
二苯胺啡啶溴红(荧光染料)和溴嘧啶都可对DNA染色,原理是卡在分子中,DNA的离心和电泳显色可用它们.
DNA和RNA的鉴别染色
利用吖啶橙的变色特性可鉴别DNA和RNA.吖啶橙作为一种荧光染料已被用于染色固定,非固定细胞核酸,或作溶酶体的一种标记.观察死亡细胞荧光变色性变化以及区别分裂细胞和静止细胞群体.虽然测定DNA和RNA含量时较难获得好的重复性结果,但该方法已被许多实验室广泛采用.
5.溶解性:都溶于水而不溶于乙醇,因此,常用乙醇来沉淀溶液中的DNA和RNA.DNA溶于苯酚而RNA不溶,故可用苯酚来沉淀RNA.
6.紫外吸收:核酸的λm=260nm,碱基展开程度越大,紫外吸收就越厉害.当A=1时,DNA:50ug/ml,RNA和单链DNA:40ug/ml,寡核苷酸:20ug/ml.用A260/A280还可来表示核酸的纯度.
7.沉降速度:对于拓扑异构体(核苷酸数目相同的核酸),其沉降速度从达到小依次为:RNA ; 超螺旋DNA > 解链环状DNA ; 松弛环状DNA ; 线形DNA也就是在离心管中最上层是线形DNA,最下面是RNA.
8.电泳:核苷酸、核酸均可以进行电泳,泳动速度主要由分子大小来决定,因此,电泳是测定核酸分子量的好方法.
9.DNA分子量测定最直接的方法:用适当浓度的EB(溴嘧啶)染色DNA,可以将其他形式的DNA变成线形DNA,用电镜测出其长度,按B-DNA模型算出bp数,根据核苷酸的平均分子量就可计算出DNA的分子量.
㈧ 请教分子标记SSR标记(STMS)原理和步骤
SSR:微卫星DNA又叫简单重复序列,指的是基因组中由1~6个核苷酸组成的基本单位重复多次构成的一段DNA,广泛分布于基因组的不同位置,长度一般在200bp以下。研究表明,微卫星在真核生物的基因组中的含量非常丰富,而且常常是随机分布于核DNA中。
微卫星中重复单位的数目存在高度变异,这些变异表现为微卫星数目的整倍性变异或重复单位序列中的序列有可能不完全相同,因而造成多个位点的多态性。如果能够将这些变异揭示出来,就能发现不同的SSR在不同的种甚至不同个体间的多态性,基于这一想法,人们发展起了SSR标记。
SSR标记又称为sequence tagged microsatellite site,简写为STMS,是目前最常用的微卫星标记之一。由于基因组中某一特定的微卫星的侧翼序列通常都是保守性较强的单一序列,因而可以将微卫星侧翼的DNA片段克隆、测序,然后根据微卫星的侧翼序列就可以人工合成引物进行PCR扩增,从而将单个微卫星位点扩增出来。由于单个微卫星位点重复单元在数量上的变异,个体的扩增产物在长度上的变化就产生长度的多态性,这一多态性称为简单序列重复长度多态性(SSLP),每一扩增位点就代表了这一位点的一对等位基因。由于SSR重复数目变化很大,所以SSR标记能揭示比RFLP高得多的多态性,这就是SSR标记的原理。�
与其它分子标记相比,SSR标记具有以下优点:(1)数量丰富,覆盖整个基因组,揭示的多态性高;(2)具有多等位基因的特性,提供的信息量高;(3)以孟德尔方式遗传,呈共显性;(4)每个位点由设计的引物顺序决定,便于不同的实验室相互交流合作开发引物。因而目前该技术已广泛用于遗传图谱的构建〔11,12,18,19,33〕、目标基因的标定〔8,9,21,22,26〕、指纹图〔22〕的绘制等研究中。但应看到,SSR标记的建立首先要对微卫星侧翼序列进行克隆、测序、人工设计合成引物以及标记的定位、作图等基础性研究,因而其开发费用相当高,各个实验室必须进行合作才能开发更多的标记。由于SSR标记具有较大的应用价值,且种属特异性较强,目前在一些主要的农作物中SSR标记研究都进行了合作,共同进行STMS引物的开发。
操作步骤
1、在25μl反应体系中,加入
模板DNA 1μl(20ng);
SSR引物 1μl(0.15μM)
10×PCR缓冲液 2.5μl
MgCl2 2μl (25mM)
dNTP 2μl (0.2mM)
Tap 酶 1单位
加ddH2O至 25μl
2、反应在PE 9600热循环仪上进行。PCR反应先95℃变性4min,接着94℃ 45s、55℃ 30s和72℃ 60s,35个循环,最后在72℃下延伸5min。PCR扩谱产物在测序电泳仪上用5%聚丙烯酰胺凝胶分离。点样时,样品量为5μl,电泳缓冲液为1×TBE,电泳工作电流50mA,电压1500V,时间约2~3h。DNA染色采用银染法。电泳结束后,凝胶连同胶板一起,经过固定、染色、显影、固定等步骤染色。电泳和银染具体操作与AFLP相似。
3、数据分析:
用BIO-RAD公司的Quantity One 软件统计,再用NTSYS软件计算出遗传相似性系数,用UPGMA法进行聚类分析构建聚类图。
㈨ 同位素标记法的原理与特点
在放射性同位素实验中,所引用的放射性标记化合物的化学量是极微量的,它对体内原有的相应物质的重量改变是微不足道的,体内生理过程仍保持正常的平衡状态,获得的分析结果符合生理条件,更能反映客观存在的事物本质。 放射性同位素示踪法的优点如上所述,但也存在一些缺陷,如从事放射性同位素工作的人员要受一定的专门训练,要具备相应的安全防护措施和条件,在目前个别元素(如氧、氮等)还没有合适的放射性同位素等等。在作示踪实验时,还必须注意到示踪剂的同位素效应和放射效应问题。所谓同位素效应是指放射性同位素(或是稳定性同位素)与相应的普通元素之间存在着化学性质上的微小差异所引起的个别性质上的明显区别,对于轻元素而言,同位素效应比较严重。因为同位素之间的质量判别是倍增的,如3H质量是1H的三倍,2H是1H的两倍,当用氚水(3H2O)作示踪剂时,它在普通H2O中的含量不能过大,否则会使水的物理常数、对细胞膜的渗透及细胞质粘性等都会发生改变。但在一般的示踪实验中,由同位素效应引起的误差,常在实验误差内,可忽略不计。放射性同位素释放的射线利于追踪测量,但射线对生物体的作用达到一定剂量时,会改变机体的生理状态,这就是放射性同位素的辐射效应,因此放射性同位素的用量应小于安全剂量,严格控制在生物机体所能允许的范围之内,以免实验对象受辐射损伤,而得错误的结果。
二、标记实验的设计原则
设计一个放射性同位素的标记实验应从实验的目的性,实验所具备的条件和对放射性的防护水平三方面着手考虑。原则上必须从两个主要方面来设计放射性标记实验:一是必须寻求有效的、可重复的测定放射性强度的条件,二是必须选择一个合适的比活度λqδ(单位是原子/时间/分子,dpm/mol或ci/mol)。其中,λ=-dN’dt/N’为该处放射性原子核的衰变常数。q=N ’/n’,表示n’个该化学形式分子为N’个放射性原子所标记。δ=n’/n表示放射性标记的分子数n’与总分子数(标记的加未标记的)n之比。采用放射性同位素标记技术来实现所研究课题预期目的全部或一部分,一般须经过实验准备阶段,实验阶段和放射性废物处理三个步骤。
(一)实验准备阶段
1.标记剂的选择
选定放射性标记剂的比活度λqδ的值必须足够大,以保证实验所需要的灵敏度,而又要尽可能地小,使得在该实验条件下辐射自分解可忽略。一般情形是根据实验目的和实验周期长短,来选择具有合适的衰变方式,辐射类型和半衰期,且放射毒性低的放射性同位素。至今已确定的放射性核素包括天然的58种和人工制造的约1300种,其中大多数不常能用作放射性标记剂。主要原因是制备困难、半衰期不合适及放射性不足以定量。在任何一种生产方法中,生产步骤很可能包含或多或少的化学处理,因而标记实验人员需要了解某个核素及其周围的那些元素的化学性质,因为它们有可能成为此放射性同位素的杂质。
放射性同位素都衰变(经过或不经过中间状态)到处于基态的子体核素,衰变时伴随各种形式的能量辐射,如α、β-、β+、γ、X放射等。在选择标记剂时,标记实验人员要仔细研究衰变纲图,根据实验条件和计数条件来决定那一种辐射,在衰变纲变内,代表核能级的两条水平线之间和距离表示能量差,↑或↓表示能级同伴随原子序数增或减少的能量,↓表示从激发态至基态的同质异能跃迁。一般要选择最适宜的半衰期τ的放射性同位素,使τ足够长,从而使衰变校正有意义或干脆不必作衰变校正,同时又要足够短,能较安全地进行标记实验,并使得放射性废物容易处理,在实际工作中,使用的放射性同位素的半衰期应该与实验需要持续的时间t相适应,如对于某个实验,t/τ=0.04时,应所选放射性同位素的衰变校正为3.5%;而t/τ=0.10时,应选放射性同位素的衰变校正为6.6%。t/τ=0.15时,应选用其衰变校正为10%。
在体外标记条件,一般选用半衰期较长而射线强度适中,既利于探测,又易于防护和保存的放射性标记剂。体内标记条件下,若实验周期短,应选用半衰期短,且能放出一定强度r射线物放射性同位素,若实验周期长,如需要将动物活杀后对组织脏器分别测定的,则应选用半衰期较长放射性同位素。此外,根据实验目的来选用定位的或不定位的标记标记剂,例如研究氨基酸的脱羧反应,14C应标记在羧基上,只有这种定位标记的氨基酸,才能在脱羧后产生14CO2。而有些实验不要求特定位置标记,只须均匀标记即可。
选择放射性标记剂还必须同时满足高化学纯度,高放射性核纯度的要求。在标记剂制备期间、贮存期间以用试验体系中所使用的溶剂、化学试剂、酶等可能会产生化学杂质、放射化学杂质及辐射自分解引起的放射性杂质,这些杂质的存在,使得标记实验中使用的标记剂不“纯”,而或多或少影响实验的结果,甚至会导致错误结论。 氚标记的胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)和尿嘧啶核苷(3H-UR)是两种常用的标记剂,前者有效地结合到DNA中,后者则掺入到RNA中,它们的辐射分解速度随比较放射性的增高及保存时间的延长而增加,在不同温度和不同溶液中的稳定性也不同。经保存八年的3H-TdR约有35%辐射分解为3H-胸腺嘧啶,并导致二醇和水合物的形式,在实验中这杂质会很快掺入细胞并与大分子(很可能是蛋白质)结合,而不是与DNA和RNA相结合,这些杂质用DNA酶和RNA酶处理细胞都不除去。3H-TdR和3H-UR贮存在-20℃的冷冻溶液中辐射分离速度要比+2℃增加3-4倍,但低温度(-140℃)对贮存也有利,在允许对标记实验人员在选择保存放射性标记剂时会有所启发。
2.放射性同位素测量方法的选择
测量方法的选择取决于射线种类,对于α射线通常可用硫化锌晶体、电离室、核乳胶等方法探测;对能量高的β射线可用云母窗计数管、塑料闪烁晶体及核乳胶测定,对于能量低的β射线可用液体闪烁计数器测量:对于γ射线则用G-M计数管,碘化钠(铊)闪烁晶体探测。目前大多数实验室主要采用晶体闪烁计数法和液体闪烁计数法两种测量方式。
同一台探测仪器对不同量的标记剂具有不同的最佳工作条件,在实验准备阶段要检查探测器是否已调有所用标记同位素的工作条件,否则需要用一定量的标记剂作为放射源(或选用该同位素的标准源),把探测器的最佳工作条件调整好,并且要保证探测器性能处于稳定可靠的状态。
探测最佳工作条件的选择方法:一种是测“坪曲线”,另一种是找最好的品质因素。对于光电倍增管,在理论上不存在“坪”(plateau)。但随着高压的增加,在一定范围内,脉冲数变化较小,形成一段坡度较小的电压脉冲曲线,通常也称其为坪。测坪曲线的方法:固定放射源,根据其射线能量的大小,初选 一个广大器增益(放大倍数)和甄别器阈值。不断地改变高压(由低到高,均匀增加伏度),每改变一次高压,都测定一次本底和放射源的计数率,最后作出高压本底计数率和高压放射源计数曲线。用同样的方法,作另一个甄别阈值(放大倍数不变)下的高压计数率曲线,这样反复多作几条曲线。必要时,还可固定甄别阈值,改变放大倍数,求出高压计数率曲线。应选择“坪”比较平坦的曲线工作条件:甄别阈值和放大增益,作为正式测定时间的仪器工作条件,高压值应选择在该“坪”中点偏向起始段一边相应的高压值。品质因素,又称为优值,是指在一定条件下,要达到合适的统计数目所需要的时间是仪器的计数效率E和本底计数Nb的函数: 品质因素F=E2/Nb它是衡量一台计数器性能的指标,仪器的品质因素F应该越大越好,品质因素F越大,表示测量效率E越高而本底Nb越小。如果某放射性标记的标准源存在来源困难等问题的话,可以用相对品质因素f来代替。 相品质因素f=ns/nb 式中ns指某种放射性样品的计数率。找最好品质因素的方法与测坪曲线一样,作出几条高压-F(或f)的关系曲线,在几条曲线中选择峰值最高的曲线。这根曲线的峰值所对应的条件:高压,甄别阈,放大倍数等,就是该仪器对被测同位素的最佳工作条件。最佳品质因素不一定恰好落在“坪”上,有的在“坪”附近,有的却在“坪”的下端。着眼于把同位素的整个能谱峰都计下来的标记实验者主张取“坪”所对应的工作条件,而着眼于优值者,主张取最佳品质因素所对应的工作条件,也有人折衷。如果某仪器本底很低,光电倍增管噪音很低和能谱分辩高,二者应该相差不大。同一台仪器的最佳工作条件,随仪器的使用期延长而有所改变,不同的放射性同位素,其最佳工作条件不同。因此核探测仪器的最佳工作条件具有专属性,并且要经常通过选择其不同时期的最佳工作条件。更不能不问被测同位素的种类,而千篇一律地使用同一个工作条件。
为了达到准确地计数,可以长时间一次计数,或短时间多次测量,两者达到的标准误基本相同,为避免外界因素的影响,在实际工作中,取短时间多次测量较为合理适用。在测量样品的放射性时,本底是一个重要影响因素。本底高,则标准误和标准误差都增大,尤其在样品计数较低时,本底对标准误和标准误差的影响就愈大,从而影响实验结果的精度,而且为了达到一定的精度,势别要增加样品的测量时间。根据核衰变的统计规律,在实验中如果样品数量少,选择tN=1.4tb的比例(式中tN为样品放射性测量时间,tb为本底测量时间)较为合理;如果样品数量较多是一大批样品,则延长本底测量时间tb,取tb的时间均值,而tN则可相对短,这样可节省时间,有利于缩短实验周期。对于标记实验设计来说,样品中所含放射性强度的要求,是使其放射性计数率大于或等于本底计数的10-20倍。
3.进行非放射性的模拟实验,把实验全过程预演一遍
同位素标记实验要求准确、仔细,稍有疏忽或考虑不周就匆忙进行正式实验,既容易导致实验失败,又会造成标记剂和其它实验用品的浪费,还会增加放射性废物,增加实验室本底水平,使实验者接受不必要的辐射剂量,所以模拟实验不仅可以检查正式实验中所用器材,药品是否合格,又可以操作人员进行训练,以保证正式实验能顺利进行。
(二)正式实验阶段
1.选择放射性同位素的剂量
同位素必须能经得起稀释,使其最后样品的放射性不能低于本底,一般来说放射性同位素在生物体内不是完全均匀地被稀释,可能在某些器官、组织、细胞、某些分子中有选择性地蓄积,蓄积的部分放射性就会很强,在这种情况下,应以相关部位对标记剂的蓄积率来考虑标记剂用量。在细胞培养,切片保温,酶反应等标记实验中,应依据实验目的、反应时间及反应体积的不同来考虑标记剂的用量,通常小于一个微居里或几个微居里。 由于放射性同位素存在辐射效应,应该根据使用的放射性核素的种类,将用量控制在最大允许剂量之内(maximun permissible dose),以免因剂量过大所造成的辐射效应,给实验带来较大的误差。
2.选择标记剂给入途径
整体标记实验时,应根据实验目的,选择易吸收、易操作的给入途径,一般给予的数量体积小,要求给予的剂量准确,防止可能的损失和不必要的污染。体外标记实验时,应根据实验设计的实验步骤的某个环节加入一定剂量的标记到反应系统中去,力求操作准确,仔细。
3.放射性生物样品的制备
根据实验目的和标记剂的标记放射性同位素的性质制备放射性生物样品,其中放射性同位素的性质是生物样品制备形式的主要依据。若是释放r射线的标记剂,则样品制备比较容易,只要定量地取出被测物放入井型NaI(TL)晶体内就能测定;若是释放出硬β射线的标记剂,须将生物样品制成厚度较薄的液体,或将液体铺样后烘干,也可灰化后铺样,放入塑料晶体闪烁仪内测定,或用钟罩型盖一革计数管探测;若标记同位素仅释放软β射线,那么样品应制成液体闪烁样品(详见放射性测量”一章),在液体闪烁计数器内测量。不论采用何种测量方法,都应该对样品作定量采集。对某些放射性分散的样品,应当作适当浓集,如测定组织内蛋白质的放射性,应对蛋白质作提取处理然后制备成相应的测量样品。有些样品需采用灰化法,但灰化法对易挥发的同位素或易挥发的组织样品不合适。
4.放射性样品的测量
测量方法分为绝对测量和相对测量。绝对测量是对样品的实有放射性强度作测量,求出样品中标记同位素的实际衰变率,在作绝对测量时,要纠正一些因素对测量结果的影响,这些因素包括仪器探头对于放射源的相对立体角、射线被探头接收后被计数的几率、反散射、 放射源的自吸收影响等等。而相对测量只是在某个固定的探测仪器上作放射性强度的相对测量,不追求它的实际衰变率。在一般的标记实验中,大多采用相对测量的方法,比较样品间的差异。在相对测量时,要注意保持样品与探测器之间的几何位置固定。几何条件的影响是放射性测量中最重要的影响因素。当两个放射性强度相同的样品在测量中所置的几何位置不一,或样品制备过程造成的几何条件差异,其计数会相差很多,尤其当样品与探头之间距离较近时,两者计数率相差会很大。但是当样品与探头之间相距较远时,由于样品与探头之间形成的相对立体角较小,所以两者计数率的差异会显着减小。在用纸片法测量3H标记物的放射性强度时,要注意纸片在闪烁瓶中的位置,一批样品应该一致,如果是将滤纸剪成圆状作支持物,圆片的直径最好与闪烁瓶底的直径相等,保证滤纸在闪烁瓶内的位置固定。减小几何条件对放射性测量的影响可以从三方面入手:⑴选择探测窗大的探测器,如光电倍增管作探头的探测器;⑵在样品制备时,注意尽量将样品做成点状源,这样当样品的放射性强度较弱时,由于距离探测窗较近而有可能造成的水平位移的影响就可以忽略;⑶无论样品距离探测窗远近,样品都应置于探测窗的垂直轴线上,以减少样品与探测窗之间的相对立体角。
(三)放射性去污染和放射性废物处理
放射性实验,无论是每次实验或阶段性实验结束后,都可能有不同程度的放射性污染和放射性废物的出现,因此,在实验结束后,要作去污染处理和放射性废物处理。必要时在实验过程进行中,就要作除污染和清理放射性废物的工作。
三、同位素标记法在生物化学和分子生物学中的应用
放射性同位素标记法在生物化学和分子生物学领域应用极为广泛,它为揭示体内和细胞内理化过程的秘密,阐明生命活动的物质基础起了极其重要的作用。近几年来,同位素标记技术在原基础上又有许多新发展,如双标记和多标记技术,稳定性同位素标记技术,活化分析,电子显微镜技术,同位素技术与其它新技术相结合等。由于这些技术的发展,使生物化学从静态进入动态,从细胞水平进入分子水平,阐明了一系列重大问题,如遗传密码、细胞膜受体、RNA-DNA逆转录等,使人类对生命基本现象的认识开辟了一条新的途径。下面仅就同位素标记技术在生物化学和分子生物学中应用的几个主要方面作一介绍。
1.物质代放谢的研究
体内存在着很多种物质,究竟它们之间是如何转变的,如果在研究中应用适当的同位素标记物作标记剂分析这些物质中同位素含量的变化,就可以知道它们之间相互转变的关系,还能分辩出谁是前身物,谁是产物 ,分析同位素标记剂存在于物质分子的哪些原子上,可以进一步推断各种物质之间的转变机制。为了研究胆固醇的生物合成及其代谢,采用标记前身物的方法,揭示了胆固醇的生成途径和步骤,实验证明,凡是能在体内转变为乙酰辅酶A的化合物,都可以作为生成胆固醇的原料,从乙酸到胆固醇的全部生物合成过程,至少包括36步化学反应,在鲨烯与胆固醇之间,就有二十个中间物,胆固醇的生物合成途径可简化为:乙酸→甲基二羟戊酸→胆固醇 又如在研究肝脏胆固醇的来源时,用放射性同位素标记物3H-胆固醇作静脉注射的标记实验说明,放射性大部分进入肝脏,再出现在粪中,且甲状腺素能加速这个过程,从而可说明肝脏是处理血浆胆固醇的主要器官,甲状腺能降低血中胆固醇含量的机理,在于它对血浆胆固醇向肝脏转移过程的加速作用。
2.物质转化的研究
物质在机体内相互转化的规律是生命活动中重要的本质内容,在过去的物质转化研究中,一般都采用用离体酶学方法,但是离体酶学方法的研究结果,不一定能代表整体情况,同位素标记技术的应用,使有关物质转化的实验的周期大大缩短,而且在离体、整体、无细胞体系的情况下都可应用,操作简化,测定灵敏度提高,不仅能定性,还可作定量分析。 在阐明核糖苷酸向脱氧核糖核苷酸转化的研究中,采用双标记法,对产物作双标记测量或经化学分离后分别测量其放射性。如在鸟嘌呤核苷酸(GMP)的碱基和核糖上分别都标记上14C,在离体系统中使之参入脱氧鸟嘌呤核苷酸(dGMP),然后将原标记物和产物(被双标记GMP掺入的dGMP)分别进行酸水解和层析分离后,测定它们各自的碱基和戊糖的放射性,结果发现它们的两部分的放射性比值基本相等,从而证明了产物dGMP的戊糖就原标记物GMP的戊糖,而没有别的来源,否则产物dGMP的碱基和核糖的比值一定与原标记物GMP的两部分比值有显着差别。这个实验说明戊糖脱氧是在碱基与戊糖不分记的情况下进行的,从而证明了脱氧核糖核苷酸是由核糖核苷酸直接转化而来的,并不是核糖核苷酸先分解成核糖与碱基,碱基再重新接上脱氧杭核糖。无细胞的标记实验可以分析物质在细胞内的转化条件,例如以3H-dTTP为前身物作DNA掺入的标记实验,按一定的实验设计掺入后,测定产物DNA的放射性,作为新合成的DNA的检出指标。
3.动态平衡的研究
阐明生物体内物质处于不断更新的动态平衡之中,是放射性同位素标记法对生命科学的重大贡献之一,向体内引入适当的同位素标记物,在不同时间测定物质中同位素含量的变化,就能了解该物质在体内的变动情况,定量计算出体内物质的代谢率,计算出物质的更新速度和更新时间等等。机体内的各种物质都在有大小不同的代谢库,代谢库的大小可用同位素稀释法求也。
4.生物样品中微量物质的分析
在放射性同位素标记技术被应用之前,由于制备样品时的丢失而造成回收率低以及测量灵敏度不高等问题,使得对机体正常功能起很重要作用的微量物质不易被测定。近年来迅速发展、应用愈来愈广泛的放射免疫分析(radioimmunoassay)技术是一种超微量的分析方法,它可测定的物质300多种,其中激素类居多,包括类固醇激素,多肽类激素,非肽类激素,蛋白质物质,环核苷酸,酶,肿瘤相关的抗原,抗体以及病原体,微量药物等其它物质。
5.最近邻序列分析法(Nearest neighbour-sequence analysis method)
放射性同位素标记技术,是分子生物学研究中的重要手段之一,对蛋白质生物合成的研究,从DNA复制、RNA转录到蛋白质翻译均起了很大的作用。最近邻序列分析法应用同位素标记技术结合酶切理论和统计学理论,研究证实了DNA分子中碱基排列规律,在体外作合成DNA的实验:分四批进行,每批用一种不同的32P标记脱氧核苷三磷酸,32P标记在戊糖5'C的位置上,在完全条件下合成后,用特定的酶打开5'C-P键,使原碱基上通过戊糖5'C相连的32P移到最邻近的另一单核苷酸的3'C上 。用最近邻序列分析法首次提出了DNA复制与RNA转录的分子生物学基础,从而建立了分子杂交技术,例如以噬体T2-DNA为模板制成[32P]RNA,取一定量T2-DNA和其它一些DNA加入此[32P]RNA中,经加热使DNA双链打开,并温育,用密度梯度离心或微孔膜分离出DNA-[32P]RNA复合体测其放射性,实验结果只有菌体T2的DNA能与该[32P]RNA形成放射性复合体。从而证明了RNA与DNA模板的碱基呈特殊配对的互补关系,用分子杂交技术还证实了从RNA到DNA的逆转录现象。此外,放射性同位素标记技术对分子生物学的贡献还表现在:⑴对蛋白质合成过程中三个连续阶段,即肽链的起始、延伸和终止的研究;⑵核酸的分离和纯化;⑶核酸末端核苷酸分析,序列测定;⑷核酸结构与功能的关系;⑸RNA中的遗传信息如何通过核苷酸的排列顺序向蛋质中氨基酸传递的研究等等。为了更好地应用放射性同位素标记技术,除了有赖于标记剂的高质量和核探测器的高灵敏度外,关键还在于有科学根据的设想和创造性的实验设计以及各种新技术的综合应用
㈩ 如何在实验室用的玻璃仪器上作标记编号,有经验者请进,要求方法简单,且标记清晰易辩认!
外壁不接触有机溶剂的瓶子可以用油性记号笔字写。也可以用彩色铅笔写。