常用的母种分离方法有

㈠ 菌种鉴定常用的分离方法有哪些

菌种质量检测的目标包括菌丝形态、菌落特征以及子实体形态等方面。质量检测常用方法如下：

（1）建立标准的培养和观察方法

对于一个栽培品种各菌种的质量检测，实际上是以该品种典型的生物学特性（包括形态特征、生理生态特性、栽培习性）为参照标准进行比较，以检验菌种是否存在品种退化、菌种老化、病菌侵染、杂菌污染和品种混杂等质量问题。同时，菌种质量检测不仅要考虑从哪些方面来评价一个菌种的质量优劣，也要考虑用怎样的标准方法对菌种质量进行评价的问题。因为一定的结果来源于一定的方法和一定的条件。方法和条件不同，结果就失去了可比性，也就无法鉴别，因此，需要建立标准。这些标准包括：培养基、培养条件（温度、湿度、pH、光照等）、菌种的菌龄等。

（2）连续观察

在菌种生长过程中，要连续观察，一切不正常的现象只有在生长过程中才能表现出来。而当菌种长满培养基表面后，其不正常现象往往会被菌种的过龄而掩盖。

（3）宏观检查

对食用菌母种、原种及栽培种的宏观检查要根据其培养特征来进行（参见前述有关内容），这是菌种生产者及使用者普遍使用的方法，简单易行，但需要有多年的从业经验与技术沉淀。如被检菌种表现出菌落生长速度不一致、气生菌丝变稀疏或出现扇变菌落、菌落上过早出现色素、或不同特征的菌落混杂共存、或菌落上出现黑褐色、青灰色、黄褐色或红色的孢子堆，均可以确定该菌种存在质量问题。优质菌种外观菌丝洁白、密集粗壮，生长速度一致，齐发并进。

在生产实践中，广大菇农和专业工作人员总结出“纯、正、壮、润、香”的质量检查方法。这种应用感官识别菌种优劣，是经验的总结，能大致、快速地鉴定出菌种的优劣。具体方法是：

“纯”指菌种的纯度高，无杂菌感染，无斑块、无抑制线，无“退菌”、“断菌”现象等。

“正”指菌丝无异常，具有亲本正宗的特征，如菌丝纯白、有光泽，生长整齐，连结成块，具弹性等。

“壮”指菌丝发育粗壮，长势旺盛，分枝多而密，在培养基上恢复、定植、蔓延速度快。

“润”指菌种含水量适中，基质湿润，与瓶壁紧贴，瓶颈略有水珠，无干缩、松散现象。

“香”指具该品种特有的香味，无霉变、腥臭、酸败气味。

通过检测各种食用菌菌丝生长的色泽、速度、均匀度等特征是否正常，来判断菌种生长是否正常、是否可用，但辨别不了是否优质高产。

（4）显微镜检查

对菌丝体进行显微观察，可以确定菌丝粗细、分枝、隔膜、锁状联合等特性是否均一，是否与该栽培品种的典型特征一致（参见前述相关内容）。具有不同形态特征的菌丝体存在于同一菌种体中，表明该菌种存在质量问题；如果出现菌丝体重寄生现象，常表现出不同特征的菌丝体相互缠绕，或菌丝体中空变细，或在寄生点出现吸器等不正常现象。

镜检的方法是：挑取少量菌丝，置载玻片中央的水滴上，用解剖针或接种针拨散，盖上盖玻片，也可加碘酒或美蓝等染色后进行镜检。正常的菌丝一般透明、分枝状，有横隔和明显的锁状联合；异宗结合的食用菌，如仅有单核菌丝，不具结实性，不宜作菌种用；双核菌丝中，锁状联合多而密，则结菇力强，一般可认为是好菌种。如：

①双孢菇 观察双孢菇单孢子萌发后的菌丝生长形态。凡菌丝洁白、健壮，保存时间较长时菌丝颜色不变，较耐28℃以上气温，生长在基质上平贴培养基表面，气生菌丝不多的，为同化能力较强，产量较高的菌株。相反，菌丝生长初期好，很快变黄变稀，如蜘蛛丝一样，长出培养基表面菌丝较多的菌株产量较低。

②香菇 观察香菇的双核菌丝，在斜面培养基上生长速度达到1.2厘米/天以上的，菌丝不十分粗壮和洁白，锁状连合频繁，锁状连合在菌丝间相距较近，且在观察面上分布均匀，一般均是高产和抗杂能力较强的菌株。香菇出菇的密度与锁状连合有一定关系。

③草菇 观察草菇菌丝，发现菌丝分枝角度大的，出菇率高，产量高。菌丝分枝角度小、平行排列的，产量低。

各种食用菌的菌丝生长是否正常、是否可用，一般都以色泽、速度、均匀度等特征加以检测，但这并不能说明其是否优质高产。

（5）拮抗试验

也称对峙反应。同一种食用菌，经分离或杂交，将选育出许多不同的菌株，这些菌株的菌丝在形态上很难区别。如不同编号的香菇菌种，都是白色绒毛状菌丝，镜检时均具有锁状联合等。在当前菌种管理工作尚不十分健全的情况下，“同名异种”、“同种异名”的现象普遍发生，要识别异同，可采用“拮抗试验”加以区别。具体方法是：

用1支20毫米×200毫米的无底试管，中央部位装入长 5～7厘米的木屑麸糠培养基，两端压平并盖棉塞，灭菌后，两端各接入两株受检的菌种 1小块，25℃左右条件下培养，当两端菌丝往中央生长并相互接触后，把试管移至20℃、约300勒克斯的漫射光下继续培养，观察菌丝接触区有无对峙反应。若无褐色的带线出现，表示两个受检菌株的基因极相似或相同，是相同的菌株，仅编号不同，即同种异名。如果受检菌株间形成带线，则表示是不同的菌株。

用平板进行拮抗试验测试，方法是在无菌的PDA培养基平板上各接入2个或多个被检菌株的菌种，在上述条件下培养，观察菌丝相接触部分有无带线，以区别相同或不同的菌株。也可用菌种瓶（袋）进行拮抗测试（图2-11）。

图2-11 拮抗现象

（6）菌丝长速测定

在适宜的条件下，若菌丝生长迅速、粗壮有力、浓密整齐，一般为优质菌种。若菌丝生长缓慢、中断或长速极快、稀疏无力、参差不齐和易枯黄萎缩，则为不良菌种。菌丝生长速度测定，可在PDA平板中心接种培养，测量菌落两个直交直径，取其平均值。同理，还可在原种、栽培种瓶（袋）壁上划线测定。

（7）菌丝生长量测定

将等面积的菌苔接入无菌的液体培养基内，在相同的条件下，进行摇床振动培养，经过一定时间后，过滤收集菌丝，反复冲洗干净后置容器内，80～100℃烘箱中烘干至恒重后称重。凡菌丝增殖快、重量重的为优质菌株，而增殖慢、重量轻的为不良菌株。

（8）耐高温测定

以双孢菇为例，把菌种置于20～22℃下培养，待菌丝长到1/2试管斜面时，每一菌株取出2～3支试管，置于35℃温度下，经24小时作抗热性试验，然后放到22～23℃下培养，观察菌丝恢复情况。若菌丝恢复萌发快，仍健壮、旺盛生长，则表明该菌株具有耐较高温的优良性状；如果菌丝生长缓慢，出现发黄倒伏，萎缩无力，则为不良菌株。

（9）均一性测定

将母种接种于标准培养基的平板上，并置于标准的环境条件下，每批做30～50个重复，进行长势和长速的连续观察记录。均一性好的品种，每个重复之间长势和长速几乎没有肉眼可见的差异。如果长势和长速不一，则表明原始的母种的遗传均一性不良，不宜作生产用种。

（10）纯度测定

菌种纯度高低是鉴定菌种质量好坏的关键环节。优质菌种要求同一管、瓶或袋内只含有所需要的菌种菌丝体，而不能含有其他种类的杂菌。这里所说的杂菌包括细菌、放线菌、酵母菌和各种霉菌，以及含有两种食用菌菌丝体或同一种食用菌的两个品种菌丝。凡是被杂菌污染的菌种都是不纯菌种，必须予以淘汰。在三角瓶内装入浅层液体培养基，灭菌后接入经捣散的菌种，25℃条件下培养，约1周观察，若有气泡和菌膜发生，并具酸败味，说明菌种不纯，混有杂菌；如果无上述现象则菌种纯正无杂。

（11）长势测定

菌丝长势包括菌丝生长的状态和速度。凡是菌丝生长迅速、整齐浓密、健壮有力的菌种为优良菌种。如果菌丝生长缓慢，或长速特快、稀疏无力、参差不齐、易于衰老，则表明是劣质菌种。在鉴别菌丝长势时，必须注意，在不同培养基上、不同培养条件下，同一种食用菌菌丝的长势不同，因此，判断食用菌的菌种长势，应采用相同的培养基，这样，结果就可靠一些。在外界环境条件相同的情况下，菌丝生长旺盛、生长量多、生长速度快的要好于菌丝生长弱、生长量少、生长速度慢的菌种。还有一种方法是在三角瓶内装入浅层液体培养基，灭菌后接入经捣散的菌种，25℃条件下培养，约1周观察浮在液面的菌种。如果菌丝向旁边迅速生长、健壮有力、边缘整齐，且不断增厚，说明该菌株生长势强；若表面生长慢、稀疏、菌丝层薄，说明长势弱，不宜用于生产。

（12）抗霉性测定

以木耳为例：制备平板，在平板的一边分别接入不同的木耳菌株，每一菌株3个重复，在26～28℃下培养。待木耳菌丝长到平板一半左右时，在平板的另一边接上木霉菌丝，继续培养。之后注意观察木霉菌丝与木耳菌丝的交界处，出现拮抗线的表示木耳菌株抗霉能力强，木霉菌丝无法长过去，为抗霉能力强的菌株。如果木霉菌丝很快盖过木耳菌丝，说明这个木耳菌株的抗霉能力差或没有抗霉力。

（13）出菇试验

对引进或分离的同一品种的若干菌株进行出菇对比试验，必须是在各级菌种的培养基成分、培养温度、培养时间及栽培条件基本一致的情况下进行。出菇试验可按菇类的常规栽培方法进行，数量可少些。为使试验准确，每一菌株设3～4个重复，以避免试验的偶然性。在位置排放上尽可能按菌名拉丁文排列，以相同的措施管理，在管理过程中对环境因子的变化、管理措施及生长历程、品种本身性状等要详细全面记录。以香菇为例记载内容如下：

①母种菌丝生长情况，如菌丝浓淡、生长快慢、菌苔韧性等。

②原种、栽培种中菌丝生长情况，如菌丝萌动、吃料、生长快慢；菌种表面有无菌皮或菌皮厚薄，白色颗粒状物有无或多少；培养基转色情况等。

③栽培阶段应记载：菇木转色快慢、颜色深浅；出菇快慢、菇生长密度；子实体经济性状，包括菇的大小、厚度、色泽、圆整程度、菌柄长度、粗细等；转潮快慢；对水分的敏感程度；产量及产量分布；出口菇比例等。

通过对记载资料分析，选出综合性状符合要求的菌株，供大面积生产或出售。

出菇试验因季节推迟或其他原因，可采用一种较简单的方法来弥补，即直接将接有各菌株并已发好菌的瓶（袋）装菌种，小心地敲破瓶颈或打开塑料袋口，使培养料外露（如果是双孢菇，则要覆土调好土粒的湿度），置最适宜的温、湿度条件下进行出菇（耳）管理，观察记载各项指标，最后进行评比。但这种方法的结果只能提供参考。

（14）栽培指标

采用一定的栽培规模，通过不同地区、不同原料、不同栽培方式，进行多次反复栽培观察，详细记录、评比后，具有优质、高产、高抗、高效和遗传性、稳定性强的菌株，才是优质和可推广的品种。其鉴定的内容、方法和指标有：

①吃料能力鉴定 将菌种接入最佳配方的原种培养料中，置适宜的温、湿度条件下培养，1周后观察种菇（耳）菌丝的生长情况。如果菌种块能很快萌发，并迅速向四周和培养料中生长伸展，则说明该品种的吃料能力强；反之，菌种块萌发后生长缓慢，迟迟不向四周的料层深处伸展，则表明该品种对培养料的适应能力差。对菌种吃料能力的测定，不仅用于对菌种本身的考核，同时还可以作为对培养料选择的一种手段。

②成活率 将菌种接在适宜的培养基上，若菌丝能很快恢复、定植和蔓延生长，成活率很高，是质量好的菌种；反之，接种后恢复慢，成活率不高是质量差的菌种。

③出菇快慢 一般说，高温型的出菇快，低温型的出菇慢，中温型的介于两者之间。而以菇的质量来说，高温型的质量差，低温型的质量好。但同一温型食用菌品种的不同菌株，其菌种接种后若菌丝分解培养料能力强，培养前后培养料失重大，出菇快而多，总产高，即是好菌种；否则为劣质菌种。

④菇峰间隔 在一个生产周期中，子实体发生可分数潮次，产菇最多时称菇峰，最低时称菇谷，每个菇峰和菇谷构成一潮菇。凡菇潮多，间隔时间短，说明菌丝分解能力强，供子实体发生的养分积累多，因此转潮快，是好的菌种；反之，菇潮间隔时间长，或不明显，零星出菇，产量低，即为劣质菌种。

⑤干燥率 鲜菇经干制后干燥率高，说明转化率高，子实体含水分低，为优质菌种。

⑥生物学效率 生物学效率，指每100千克干料可产多少千克鲜菇。生物学效率高，则菌种质量好，反之为劣质菌种。

（15）经济指标

高产不一定高效、丰产不等于丰收，要占领市场，获得较高利润，还必须具备商品的要求，如产品的色、香、味、形，档次，上市时间，货架期和保质期等。凡是鲜菇上市时间早，产量高、品质好、档次高、含水量低，不易变色、变质、破碎、失重，无农药残毒、残臭，符合食品卫生标准和得到的利润高等，均表示经济指标高，则为优质菌株；而上市有效时间短，易变色、变味、变质，含水量高，失水严重，易破碎，利润低的菌种均为劣质菌种。如香菇以大小适中、肉厚、色深、边缘内卷，柄短细为优良；双孢菇以色白、子实体大小适中，菌柄短，不易开伞等为优良；银耳以色白、开片好、蒂头小、松泡率高为优良等。

㈡ 平菇的组织培养分离母种的方法是怎么的求大神指教，谢谢

如果你做不到很好的无菌条件的情况下，组织分离是很难成功的，即使分离出了母种，也可能不是纯菌种，对你后续使用有可能造成很大的损失。平菇的组织分离是选取生长旺盛的部位组织块转接到最适宜的培养基上，经一段时间的最适温度培养，得到的菌种即为母种试管。
建议：组织分离技术虽然容易操作，但分离过程中很多关键点的控制尤为重要，母种最好是由专业的技术人员制作或由研究院所购买，以避免造成不必要的经济损失。

㈢ 常用的分离技术有哪两类各包括哪些这些常用的分离技术的基本原理是什么

分离方法开始主要用于化工行业中化工产品的分离，但是随着生物工程技术下游技术的不断发展，结合传统的化工分离方法，新的高效的分离方法被人们高度重视起来。
常用到得分离方法：盐析、萃取分离法（包括溶剂萃取、胶团萃取、双水相萃取、超临界流体萃取、固相萃取、固相微萃取、溶剂微萃取等）、医学|教育|网搜集整理膜分离方法（包括渗析、微滤、超滤、纳滤、反渗透、电渗析、膜萃取、膜吸收、渗透汽化、膜蒸馏等）、层析方法（离子交换层析、尺寸排阻层析、疏水层析、固定离子交换层析IMAC、亲和层析等）。在这些方法中膜分离的方法和层析技术越来越受到人们的重视。
基本原理：
1、双水相萃取的原理：
   双水相萃取与水 -有机相萃取的原理相似 ,都是依据物质在两相间的选择性分配 ,但萃取体系的性质不同 。当物质进入双水相体系后 ,由于表面性质、电荷作用和各种力 (如憎水键、氢键和离子键等 )的存在和环境因素的影响 ,使其在上、下相中的浓度不同 .{主要:静电作用和疏水作用}
2、差速离心法原理：
   采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降速度不同的颗粒在不同的分离速度及不同的离心时间下分批离心的方法，称为差速离心法。当以一定离心力在一定的离心时间内进行离心时，在离心管底部就会得到和*重颗粒的沉淀，分出的上清液在加上加速转速下再进行离心，又得到第二部分较大、较重颗粒的“沉淀”及含小和轻颗粒“上清液”，如此，多次离心处理，即能把液体中的不同颗粒较好分开，这时所得沉淀是不纯的，需经再悬浮和再离心（2-3次），才能得到较纯颗粒。
3、速率-区带离心原理：
   不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定离心速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。介质梯度应预先形成，介质的密度要小于所有样品颗粒的密度。
4、等密度梯度离心原理:
   当不同颗粒存在浮力密度差时，在离心力场下，在密度梯度介质中，颗粒或向下沉降，或向上浮起，一直移动到与他们各自的密度恰好相等的位置上形成区带，从而使不同浮力密度的物质得到分离。

㈣ 平菇菌种（母种）如何使用

母钟使用方法：

母种培养基配制；

母种分离；

母种扩大培养。

㈤ 红菇的母种分离

Fries(1987）曾指出，红菇属孢子在一般条件下，包括在能够组织分离红菇菌丝的培养基上均不能萌发，并揭示能引发孢子萌发的活化因子有三类，外源微生物中酵母（尤其是红酵母）、孢子自体菌丝体和宿主植物根系浸出物。刘斌曾从红菇的分离及其培养特征观察发现，正红菇菌丝可用PDA加富培养基，蔡小玲等开展野生红菇的分离培养试验，PDA+腐殖土培养基，通过正红菇子实体组织分离技术获得，并用该培养基扩大培养和菌种保存。随着红菇驯化研发技术的深入，目前红菇纯菌种分离技术已被人们掌握。
(1)适用培养基 这里介绍两种配方。
配方1：马铃薯250克（取其提取液800毫升），红菇产地腐殖土300克（加水400毫升，煮沸20分钟，冷却后取澄清液200毫升），白糖25克，维生素B,10毫克，琼脂23克。按常规调料煮沸，装管、灭菌后制成斜面。
配方2：鲜松针100克（水煮过滤），麦芽汁（即84毫升水十16克糖）100毫升，磷酸二氢钾0.2%，硫酸镁0.15%，葡萄糖2%，维生素B,10毫克，琼脂2%，补水至1000毫升，pH5-5.5，灭菌后制成斜面。
(2)种菇分离部位 红菇菌肉的生殖菌丝是由球状胞（孢囊状菌丝）组成，埋在管状联络菌丝的基质中，再生能力较低，如采用以菌盖的菌肉作为分离材料成功率低。因此红菇分离部位应选取菌柄中间的组织块。
组织分离法属无性繁殖法。它是利用红菇菌柄的组织块，在适宜的培养基和生长条件下分离、培育纯菌丝的一种简便方法。具有较强的再生能力和保持亲本种性的能力。这种分离法操作容易，不易发生变异。但如果菇体染病，用此法得到的菌丝容易退化；若种菇太大、太老，此法得到的菌丝成活率也很低。
(3）分离操作技术规程
①灭菌消毒 切去菇体基部的杂质，放入0.1%升汞溶液中浸泡1-2分钟，取出用无菌水冲洗2-3次，再用无菌纱布擦干。
②切取种块 将经过处理的种菇及分离时用的器具，同时放人接种箱内，取一玻璃器皿，将3-5克高锰酸钾放人其中，再倒人8-10毫升甲醛，熏蒸30分钟后进行操作。或用气雾消毒剂灭菌。然后用手术刀把种菇纵剖为两半，在菌柄正中用刀切成3毫米见方的组织块，用接种针挑取，并迅速放人试管中，立即塞好棉塞。
③接种培养 将接人组织块的试管，置于24℃条件下恒温培养3天，菌丝开始萌发，经多次提纯，即可获得红菇母种。红菇菌丝长速较慢，接种10天后日平均长速为0.67厘米，在PDA培养基上菌丝外观白色至黄色，气生菌丝稀少，出现黄棕色素。10天后通过筛选，挑出菌丝发育快的试管继续培养，对污染有杂菌和长势弱的淘汰，经过20-25天的培养，菌丝才长满试管。

㈥ 什么是食用菌母种、原种和栽培种

母种:从蘑菇上直接分离得到的菌种(试管种,用培养基培养)。

原种:由母种扩大繁殖得到的菌种(瓶装种,用培养料培养,一般多拿罐头瓶或者小袋子培养)。

栽培种:由原种扩大繁殖得到的菌种(袋装种,用培养料培养,一般都拿蘑菇袋子培养)。

母种用来保存菌种,原种用来扩大菌种,栽培种用来生产的。

组织分离法组织分离法是通过切取菌索、子实体、菌核的新鲜幼嫩的组织进行分离，以获取纯菌丝的方法，是最常用的菌种分离法之一 。

子实体、菌索等实际就是双核菌丝的纽结物，具有很强的再生能力。因分离时所 选择的材料不同 ，该方法又可分为菌索组织分离法、子实体组织分离法及菌核组织分离法。

在实践中，子实体组 织分离法是最有效、最常用的方法。但对于胶质菌，由于其子实体中所含的菌丝量比较低 ，如黑木耳、银耳等，利用组织分离培养难度较大。

组织分离属于无性繁殖的范畴，能保持原菌株的特性，遗传稳定变异小，不仅适于孢子不易收集或萌发的食用菌，也适于稳定优良品种的遗传性。

孢子分离法 孢子分离法，是采取子囊果或子实体中成熟的子囊孢子或有性孢子萌发成纯菌丝，再进一步培养成菌种的方法。

由此法可以获得强活性、短菌龄的菌丝，该方法的另外一个优点是分离得到的有性孢子兼有双亲的遗传特性，可用于杂交育种和选育新种中。

只是孢子间不仅存在个体差异，还存在较普遍的自然分化现象，出现的变异较大，必须经过出菇试验后才能用于生产中团。对于产孢子的真菌，一般其分离法多采用孢子分离法。

以上内容参考：网络-食用菌菌种

㈦ 常用的分离方法有哪些

萃取

是用物理方法进行分离

要求:一,所使用的两种溶剂必须是不互容的
二,该溶质(就是你要萃取的物质)在两种溶剂中的溶解度大小必须有差别

分液

也是一种物理方法

是利用两种溶液不互容,将两种溶液放在一起是有分层
然后,用分液漏斗进行分液.

分馏
是利用各种物质的沸点不同,在不同的温度是把不同物质蒸发出来
比如,在进行石油加工是就是用分馏的方法进行的

蒸馏
是在溶液加热到沸点时 溶液汽化
再将蒸汽冷却,从而得到蒸馏后的液体
经过蒸馏后的液体是有一定纯度的纯净物

蒸发
利用蒸发溶剂使晶体析出的一种方法
比如蒸发硫酸铜溶液
就是让硫酸铜溶液中的溶剂减少
从而让硫酸铜晶体析出

㈧ 常用的分离方法有哪几种

1、分液：分离两种不互溶的液体，如分离油和水。

2、萃取：加入适当溶剂把混合物中某成分溶解及分离，如庚烷、取水溶液中的碘。

3、蒸馏：溶液中分离溶剂和非挥发性溶质，如海水中取得纯水。

4、分馏：离两种互溶而沸点差别较大的液体，如液态空气中分离氧和氮、石油的精炼。

5、升华：离两种固体,其中只有一种可以升华，如分离碘和沙。

6、吸附：去混合物中的气态或固态杂质，活性炭除去黄糖中的有色杂质。

(8)常用的母种分离方法有扩展阅读：

分离的原则

1、引入的试剂一般只跟杂质反应。

2、后续的试剂应除去过量的前加的试剂。

3、不能引进新物质。

4、杂质与试剂反应生成的物质易与被提纯物质分离。

5、过程简单，现象明显，纯度要高。

6、尽可能将杂质转化为所需物质。

7、除去多种杂质时要考虑加入试剂的合理顺序。

8、如遇到极易溶于水的气体时，要防止倒吸现象的发生。

㈨ 杨树菇菌种分离的方法有哪些

杨树菇和大多数木生型菇菌一样，其纯菌种可用孢子分离法、组织分离法或菇木分离法获得。通常以交叉使用前两种分离方法为主。前面已经说过，我国杨树菇的单孢子菌株具有结实能力，因此在进行孢子分离时，可采用单孢分离法获得纯菌种，经过出菇鉴定后，挑选优良菌株作母种使用。或在生产上使用的优良菌株中，选取生长健壮、形态正常、无病虫害的幼嫩子实体作为分离材料，按照组织分离的无菌操作程序分离接种。以下简要介绍单孢分离法和出菇鉴定要求。

1.单孢分离法

（1）单孢稀释分离法 将选择好的种菇置于孢子弹射分离装置内进行孢子弹射，收集孢子（弹射分离方法见黄伞有关部分）。然后对收集的孢子用无菌水进行稀释分离。将稀释后的孢子悬浮液滴在载玻片上，放在低倍镜下进行检查，至每滴中有4～5个孢子为合适。接种时，用注射器吸取孢子悬浮液，将试管棉塞拔松，沿试管壁插入注射器针头，每支试管注入1～2滴孢子悬浮液，转动试管，使孢子均匀地分布在培养基表面，静置1～2小时后，移入温箱培养。

也可将已稀释的孢子悬浮液注入培养皿内，每个培养皿加1～2滴即可，然后倒入已溶化并冷却到45℃的琼脂培养基，厚0.5厘米，在工作台上左右旋转混匀，静置1～2小时，倒转培养。孢子萌发后，将单孢菌落连同少许培养基移接到试管内培养。

（2）单孢定位切割分离法 浙江省农业科学院园艺研究所范雷法等（1996）曾介绍一种自制简易定位切割器，能快速、准确的分离单孢菌落。定位切割器制作方法如下：选用普通圆珠笔芯塑料空管一小段，长2～3厘米，用刀片将空管一端削成薄片，另一端用火熔化压成平头，用一只乳胶指套，在其中间打一孔，插上上述做好的塑料平头，将其固定在40或100倍显微镜的镜头上，使其紧密接触。

切割器的尖头部分，要削得薄、长而光滑，使之能切割完好，为粘连切割圈外的培养基；切割器与物镜固定要紧，且位置在正中，使物镜与笔芯空管处于同一轴心上。做成之后用以下方法进行校正：在载玻片或培养皿上倒入一薄层（厚2～3毫米）水样琼脂培养基，凝固后，用带有定位器的物镜镜头，轻轻转动上下调节器，使定位切割器下降，并切割到培养基的2/3处，勿切割到底，以免损坏定位器和琼脂培养基的表面；再转动调节器，使定位切割器上升，用低倍镜观察定位切割器切割后的培养基块是否在视野正中，如果不在正中，则应对乳胶指套的相对位置进行调节，至适合要求。如显微镜是以载物台作为上下调节的，也可用同样方法校正。一般普通笔芯内径在2毫米左右，约是低倍镜的2倍左右视野。定位切割器使用前浸泡在酒精内消毒备用。

按常规方法将孢子稀释后制成PDA琼脂平板，在低倍镜下检查，若确认为单孢，则可改用定位切割器进行切割，按上述方法在同一培养皿内将单孢切割完毕。再将金属针打扁，使尖端平而稍弯曲，用来在培养皿内挑取切割块，要尽量避免碰到圈外培养基，然后移置在斜面上培养。

（3）试管稀释点样法 用灭菌接种针在培养皿内蘸取少量担孢子，或用接种针直接从菌褶上轻轻刮取少量孢子，洗入试管内的无菌水中，充分摇动，使之均匀分散。然后用灭菌接种针蘸取1滴孢子液，放在载玻片上，用低倍镜检查，如果每滴水中仍有3～4个孢子，应继续稀释，至每滴中含1～2个孢子为止。将水滴滴在培养皿盖的边缘2厘米处，再用低倍镜检查，将只有1个担孢子的水滴用蜡笔在反面作标记，并加1滴营养液。为防止培养液过快蒸发，在培养皿内加少许无菌水，用纸包好进行培养。第二天，孢子萌发，经镜检，确认为只有1个芽管，可以在水滴上加一小片琼脂块，以便孢子萌发后继续生长。2～4天后，将菌丝连同琼脂块移到试管内培养。

（4）毛细管切割法 将不同稀释度的孢子悬浮液滴入培养皿的琼脂平板上，每个培养皿放1～1.5毫升，停留几分钟后，倒去多余的水，进行保温培养。孢子发芽后，在低倍镜下用毛细管割取只有1个芽管的单孢子，移接到琼脂斜面上培养。

2.多孢分离法 按常规方法准备好琼脂平板培养基，用灭菌纱布或滤纸吸去皿盖反面的冷凝水。从杨树菇子实体上剪下一小块菌盖，菌盖下约有6～7片菌褶，再将菌褶的前端和基部剪去，留下的菌褶长约1.5～2厘米，再盖到培养皿上，放到温室培养。6小时后，将培养皿盖按顺时针方向移动若干度（不得小于30度），以后每隔3～4小时按同样方向移动若干度，最后回复到原来位置。然后，移去分离材料，将培养皿放在适温下培养，在平板上会出现不同密度的菌落，挑选分散性较好，且又连接成片的菌落，转入试管内培养。用这种方法，能及时发现混入伞菌孢子内的杂菌。或将一小片菌褶贴附在试管壁上，使孢子直接散落在斜面上。

3.组织分离法 选取肉厚、朵大、无病虫害、六七分成熟的子实体作种菇用，已开始弹射孢子的不可作种菇。将选好的种菇用自来水冲洗数次，再用无菌水冲洗数次，然后用无菌纱布或滤纸吸干水分。在接种箱内按无菌操作方法进行组织分离。用手将种菇盖边轻轻撕开，手指不要接触撕开后露出的菌肉部门。将解剖刀在火焰上烧灼灭菌，待冷却后，在菌盖和菌柄或菌盖与幼嫩菌褶连接处挖取一小块（约绿豆粒大小），接种在斜面上。在切取组织块时，不要挖取接近菌盖边缘的部分，以减少杂菌污染。接种时，将组织块准确地接种在斜面的中央，切勿在斜面上到处移动，这样便于及时鉴别组织块是否有细菌污染，或当污染出现后便于进行纯化分离。接种后，将斜面置于23～25℃下培养，若组织块上有白色菌丝萌发，并向培养基上蔓延，1～2天后，及时用接种针挑取少量带有菌丝的培养基，接种到空白斜面上进行纯化培养，即可获得杨树菇母种。

组织分离时，组织块附近若出现霉菌污染，因霉菌丝与杨树菇菌丝生长速度相近或更快，故予淘汰。如果组织块附近出现灰白色或黄白色黏状物或水渍样物，则是细菌、酵母菌污染的表现。这时可降低培养温度，抑制污染菌落的生长，当杨树菇菌丝的菌落长到细菌（酵母）菌落之外时，则可采用切割菌落前端的方法进行纯化，也可得到杨树菇的纯培养物。当菌丝长满斜面时，检查培养基的背面，若在杨树菇菌丝的下面出现黄褐色的斑块，则是被菌丝覆盖的细菌（酵母）菌落，可用切割菌丝生长前端的方法再次进行纯化培养，有时这种纯化分离要连续进行多次才能获得纯菌种。这种方法只是一种辅助措施，只有当组织分离的绝大部分斜面都被污染时，才可以采用这种纯化分离法获得母种。

4.出菇鉴定 为了检验所分离单孢子菌株是否具有结实能力，出菇特性以及产量水平，对分离物要进行出菇鉴定。此工作可分别在液体培养基和固体培养基上进行。

（1）液体出菇 鉴于杨树菇易于在液体培养基中生长，出菇试验可采用液体培养。培养液的组成为：玉米粉25克，豆饼粉10克，葡萄糖10克，硫酸镁1克，磷酸二氧钾2克，蒸馏水（或自来水）1000毫升。将上述培养液分装于1000毫升三角瓶中，每瓶装量200～250毫升，按常规进行高压灭菌备用。

接种后于25℃静置培养，约15天左右，在培养液表面陆续开始分化原基，并形成正常子实体。在25℃有散射光条件下，绝大多数单孢菌株在15～20天均能分化原始，但出菇时间的早晚与产量没有正相关性。出菇早虽然是一个良好的生产性状，但在出菇较晚的菌株中，也可发现出菇密度高，菇潮集中，产量高的优良菌株，这些考核要在固体培养基上进行。

采用液体培养进行出菇试验，不但方法简单，便于观察，且便于比较在同一单位时间内，不同菌株间的生物量（将滤取菌丝用水淋洗干净，与子实体分别置于60℃烘干到恒重，用电子天平称量）。另一特点是在短时间内即可达到出菇试验的目的。

（2）袋式栽培 袋栽培养料组成为：阔叶树木屑37%，棉籽壳37%，麦麸20%，玉米粉5%，石膏1%，调含水量为65%。每袋装料300克，于称量后分装于塑料袋中，按常规方法进行高压或常压灭菌备用。

接种后在25℃培养，待菌丝满袋后，将菌袋移至供出菇试验的栽培室内，每个供试菌株一般不得少于20袋，随机排列在床架上，并在同一环境条件下进行栽培管理。待原基分化后，脱去塑料袋，随后进行水分、光照和通风管理。比较其生产性状和产量。

选择原基分化早，菇丛密，菇数多，单菇粗壮，生物学效率高，抗性好的优良菌株用于生产。

㈩ 获得灰树花的母种有几种方法

灰树花的母种，多数都是通过组织分离方法获取。母种性能的好坏，对灰树花生产影响非常重要，所以必须进行认真细致的挑选，并且通过试种，成功之后方可进行大面积推广和使用。选择有3种基本方法：（1）对生产、供应母种的单位或个人进行资格考察。

（2）查清楚母种的生产日期、品种、温型和地点。

（3）直接观察试管中的生长形态特征。

优良的母种是：试管内培养基表面均匀的长满菌丝。菌丝洁白，如白色棉絮状，表面不干燥，无其他颜色和隔断处。如有其他颜色、杂菌、表面干燥等不良现象，则弃之不用。保存时间过长，外地引进、未通过试种的母种，最好不要使用，以免造成经济损失。