常用的食用菌菌种保藏方法

A. 如何保藏草菇菌种

草菇是食用菌中需求温度最高的品种。草菇菌种不耐低温，较长时间保藏在10℃以下环境会失去活力，甚至死亡。所以，不能像其他品种的菌种一样利用冰箱在0～4℃条件下保藏，很多菌种生产者还未掌握这项技术。草菇菌种的保藏方法有：传代培养保藏法、液体石蜡覆盖保藏法、栽培保藏法、冷冻干燥液态氮超低温保藏法、悬液保藏法、自然基质简易保藏法等。生产上最常用的保藏方法是传代培养保藏法。根据培养基成分的不同，传代培养保藏有两种方式：

（1）试管斜面接种培养保藏

将需要保藏的草菇菌种接到PDA试管斜面，在30℃下培养，菌丝长满培养基后，在20℃左右温度下存放，最低不要低于15℃。为减少保藏过程中基内水分的散失，通常将菌种放在塑料袋中，亦可用橡胶塞封紧管口，并每隔2～3个月转管1次。

（2）稻草斜面接种培养保藏

稻草粉95%，石膏2%，麸皮或米糠3%，用石灰调节pH 8～9，含水量55%～60%。将配好的培养基装入直径25毫米、长250毫米的试管中，装料量为试管长度的2／3，用棉塞封管口。灭菌后，接上草菇菌种，33℃下培养，待菌丝长满试管时，用橡胶塞代替棉塞封紧管口。置15～20℃下保藏，每隔3～6个月转管1次。

B. 厌氧微生物菌种的保藏方法

厌氧是在封闭条件下，将污水或废水中的有机物，转化为CH4、CO2、H2O、NH3、H2S，并为细胞合成提供能量，少量有机物被转化、合成新的原生质。但是采用厌氧处理污水，极易受到碱度、溶解氧、挥发性脂肪酸（VFA）、氧化还原电位、有毒物质、温度、有机负荷、水力停留时间等对微生物生长繁殖的影响和抑制，设计人员往往采取加大厌氧池，增加污水或废水在池中的停留时间，来解决厌氧微生物生长繁殖不及造成数量不足等技术问题。
加大厌氧池给不但增加了占地面积和工程投资，而且无法解决春夏秋冬季节变化所引起的温差，影响厌氧微生物生存繁殖，进而造成污水处理效果不好，引发城市、医院、工业等污水处理升级改造，有的还升了又升，改了又改。
厌氧微生物发生器能在24小时内产生72代高密度的厌氧微生物菌群，这些高密度的厌氧微生物群能迅速将污水中的污染物分解成CH4和CO2，从而减少厌氧池体积、降低厌氧池投资，是理想的厌氧生物强化处理设备。
采用厌氧池+厌氧微生物发生器，对污水进行生物强化处理，在消化污染物的同时，脱除污水中的氮、去除污水中磷、消除污水中的味、吃掉污水中的淤泥。厌氧微生物发生器主要应用行业如下：
1、医院、疗养院、医院院校、农村卫生院、医疗诊所等含菌污水处理；
2、城镇、村镇、农村、住宅小区及开发区生活污水处理，宾馆、饭店、学校、商场及办公楼污水处理，车站、航空港、码头等污水处理；
3、化工、制药、印染、腌制、畜禽养殖、制糖、酿酒、石化、焦化、农药、味精、纸浆、毛纺、橡胶、餐饮废水处理；
4、城镇污水处理厂升级改造及中水回用处理；
5、有脱氮除磷需求的废水处理；
6、江河、湖泊等河道、景观治理；
7、湿地公园生态修复；
8、污水处理厂污泥减量，实现无泥外排处理。

C. 母种的保藏方法有哪些

母种保藏的方法有很多种，具体采用哪种方法应根据实际情况而定。常用的基础方法有：斜面继代低温保藏、自然基质保藏（麦谷粒保藏、发酵粪草保藏、木屑保藏、麦麸+木片保藏、木块+琼脂保藏、稻草粉保藏草菇菌种、枝条保藏）、液体保藏[矿油保藏、菌丝球生理盐水保藏、蒸馏水保藏、营养液保藏、液氮保藏（图2-12）]、孢子滤纸保藏、真空冷冻干燥保藏、液氮超低温保藏、孢子沙土管保藏、梭氏真空干燥保藏等方法。专门保藏菌种的机构为确保保藏效果，每一品种都要同时用至少三种方法保藏，即长期方法、中长期方法和短期方法。限于篇幅，不再一一介绍。下面仅针对菇农介绍常用的低温和基质保藏法及几种土法保藏方法。

图2-12 母种的液氮保藏法

（1）斜面继代低温保藏

这是一种传统的、普遍应用的简易保藏方法，它简单易行，不需特殊设备，并能随时观察所保藏菌种的情况。其缺点是转管频繁，营养生长过多，易发生退化，在操作中发生技术错误的机会多；可能会因未及时转接、培养基干缩而引起菌种老化、死亡等。

这种方法是根据低温能抑制菌丝生长的原理，将需要保藏的菌种接种在斜面培养基上，适温培养，当菌丝健壮地快长满斜面时取出，放2～5℃低温干燥处或冰箱、冰柜中保藏。每隔一定时间要移植转管、继代培养1次（一般4～5个月），具体应根据菌种特性来确定。食用菌中有的中高温和高温型品种，不适于该法，如毛木耳多数品种保藏的适宜温度在10℃左右，中华灵芝在6～10℃，草菇在10～12℃。可在草菇菌落上灌注3～4毫升的防冻剂（10%的甘油）。

用于保藏的培养基，不宜用营养过贫或过富的合成培养基，一般采用天然培养基，如马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、马铃薯综合培养基（CPDA）等。为防止产酸，糖应少加或不加，而需添加缓冲剂，如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、碳酸钙等，以中和菌种在保藏过程中产生积累的有机酸。同时，每1000毫升还需加 10毫克维生素 B₁，加大琼脂用量至25克，以防止培养基中水分蒸发过快。如保藏香菇和黑木耳菌种，把配方中的葡萄糖更换成麦芽糖更有利。棉塞稍长，入管内达3厘米左右，制成半高层培养基，即斜面小、短，管底1.5厘米的培养基呈柱状。

橡皮塞密封保藏：选用与试管口相应大小的白橡皮塞，清洗、晒干，放入低压聚乙烯袋内，于0.137兆帕下灭菌1小时。在无菌条件下，将培养合格的斜面菌种用无菌橡皮塞取代原棉塞，置4～6℃冰箱内保藏，保藏时间可达6个月以上。这种方法能隔绝空气，防止蒸发，达到液体石蜡相似的效果。而且放置、邮寄、携带等很方便。

注意事项：

①保藏菌种必须是发育健旺的菌种，培养时间不可过长，以免降低菌种生活力。

②制种时要贴好标签，每次移接时要细心核对菌种号及标明时间，做到准确无误，若发现错误，应立即纠正，无法确认的，剔除不要。

③定期检查保藏情况，一旦发现污染或培养基失水干缩现象，应立即移接、剔除。

④尽量少启用冰箱，以免产生冷凝水而引起污染，开启时应做到边开、边取、边关，最好设置一个永久性的保藏冰箱，与常用菌种的冰箱分开。

⑤保藏菌种在冰箱中不可过分拥挤；保藏温度控制在3～5℃，不宜过高或过低。

⑥冰箱要定期排霜，清除积水。保藏时要注意环境湿度不能太高，湿度太高，霉菌容易在棉塞上生长，并通过棉花纤维进入管内。所以，最好用橡皮塞或硅氧海绵塞代替。若用棉塞，可用干净的纸（硫酸纸、牛皮纸均可）包扎好，也能起到减少污染、延缓培养基干缩的作用。

⑦所保存的菌种在使用时，要提前12～24小时从冰箱取出，经适温培养恢复活力后，方能转管移接。

（2）自然基质保藏

即利用食用菌自然生长的培养基来保藏菌种的方法。常用的有麦粒、谷粒培养基、发酵粪草、木屑木片、麦麸米糠等基质。

①麦（谷）粒保藏 此法利用麦粒、谷粒或玉米粒（碾碎）等作为培养基，进入颗粒的菌丝体，在表皮的保护和谷粒中有限水分的供给下，保藏期可达1～2年。现以麦粒为例介绍如下：

先将麦粒洗净，用20℃左右温水浸泡5小时后捞出晾干表面的水分（或置水中煮沸5分钟至不破皮），装入试管长度的2/3～3/4，塞好棉塞，置于1.18×10⁵帕压力下灭菌30分钟。处理后麦粒的含水量不要超过25%，灭菌过程中勿使表皮破裂，以保护进入麦粒的菌丝体。灭菌后趁热摇散麦粒，冷却后，接种孢子液或菌丝悬浮液或菌丝块，然后置25℃下培养，当试管快发满菌丝后，即停止培养，保藏在干燥冷凉处。

②木屑保藏 用阔叶树木屑、麦麸加糖和石膏各1%，混合拌匀，加适量水后，装入试管长度的2/3，稍压紧，洗净管口，塞上棉塞，用纸包好，置1.18×10⁵帕压力下灭菌40分钟，冷却后接种，置25℃条件下培养，菌丝长满后将棉塞蜡封或换橡皮塞，再包扎塑料袋置4℃冰箱中可保藏1～2年。

（3）井底低温保藏

即利用井底具恒温且温度低的原理进行菌种保藏的方法，适用于不具备保鲜冰箱的菇农。将要保藏的试管母种，用无菌橡皮塞醮石蜡封口，装入密闭的广口瓶或塑料袋中，扎紧，沉入井底贮藏，可保藏2～5个月。

（4）石蜡封口保藏

把蜡纸裁成6～8厘米见方，放75%酒精中浸泡1分钟。将已培养好试管种的管口在酒精灯火焰上方旋转灭菌后，用镊子取出蜡纸，扎紧管口。再将包好蜡纸的管口浸入熔化的石蜡中，将蜡纸完全浸入为止，使蜡纸紧紧封包在管壁上，绝不漏气。待石蜡冷却凝固后，置冰箱或室温下保存。

（5）玻璃纸封口保藏

用明胶15克（粘合剂），硫酸铜2克，美蓝1～2滴（指示剂），溶于100毫升热水中，配制成封口剂。将新长满的母种拔去棉塞，管口朝下，蘸上封口剂，贴上用95%酒精浸泡过的玻璃纸（赛珞璐），再用石蜡熔封。在室温下，菌种至少可保存8个月，并能防止霉菌或螨的侵染。在斜面注入无菌矿油（液体石蜡），可大大延长保藏时间。

（6）厩肥保藏

此法适合保藏双孢菇等草腐菌类。将腐熟牛粪等堆肥晒干、打碎，取300克干堆肥，用5毫米孔径筛过筛，加1000毫升水调湿，装入试管，占管深1/3～1/2，在0.15兆帕压力下灭菌2小时。确认无菌后，接种，菌丝长满后，放在3℃冰箱内保藏，每隔2年移植一次。在长期保藏中，如培养基失水，应将保藏菌种及时接种在琼脂斜面上进行活化，再继续保存。此法连续保藏4年后，其生产性状未出现明显变化。

D. 为什么要进行菌种的保藏工作

菌种保藏是食用菌菌种生产中的一项必不可少的重要环节。获得一株优良的菌株是很不容易的，但又不可能一劳永逸。因为一个优良菌株在长期保存和应用过程中，如果保藏设备和手段不适宜，或传代次数过多，培养时间过长，或因受不利外界环境条件的影响，常会导致种性衰退甚至死亡。因此，需在一定时间内使菌种的生活力、纯度和优良性状稳定地保存下来，就必须采取相应的措施，认真做好菌种的保藏工作。菌种保藏前，必须种性清楚、来源正宗、名称准确，具一整套有关技术数据和资料，并处于良好状态。

菌种保藏工作要有专人负责，每个生产单位都要有自己的菌种档案，详细记录菌种来源、移植经过、保藏情况和在生产上使用的结果。管理人员要定期检查保藏情况，及时清除已被污染的菌种。使用菌种时，在任何情况下，都不应将保藏的菌种全部用完。菌种的标签，要字迹清楚，可长期保留，字迹模糊或没有标签的菌种最好不要使用。对保藏的菌种，至少两年要做1次出菇试验，从生长情况和经济性状上综合考察保藏效果。

作为普通菌种生产企业和食用菌栽培者，由于条件、设备和技术水平的限制，常常只是菌种的贮藏。

E. 食用菌菌种的基本要求是什么

使优良菌种的性状保持稳定，人为地创造条件，使菌种的新陈代谢活动处于不活泼状态。

食用菌菌种为食用菌菌丝体及其生长基质组成的繁殖材料，菌种分为母种（一级种）、原种（二级种）和栽培种（三级种）三级。使优良菌种的性状保持稳定，人为地创造条件，使菌种的新陈代谢活动处于不活泼状态即选取优良菌种的休眠体或富有生命力的悬浮液在低温或脱水状态下保存。

通过切取菌索、子实体、菌核的新鲜幼嫩的组织进行分离，以获取纯菌丝的方法，是最常用的菌种分离法之一 。子实体、菌索等实际就是双核菌丝的纽结物，具有很强的再生能力。因分离时所 选择的材料不同 ，该方法又可分为菌索组织分离法、子实体组织分离法及菌核组织分离法。

(5)常用的食用菌菌种保藏方法扩展阅读：

食用菌菌种的相关要求规定：

1、菌种经营单位和个人应当建立菌种经营档案，载明菌种来源、贮存时间和条件、销售去向、运输、经办人等内容。经营档案应当保存至菌种销售后2年。

2、菌种生产单位和个人应当按照农业部《食用菌菌种生产技术规程》生产，并建立菌种生产档案，载明生产地点、时间、数量、培养基配方、培养条件、菌种来源、操作人、技术负责人、检验记录、菌种流向等内容。生产档案应当保存至菌种售出后2年。

F. 食用菌栽培有哪几种方法

微生物的培养方法有三种，即纯培养法、选择性培养法和优势培养法。
一、 菌种制作的基本设备
1、 食用菌菌种制作的工艺流程 培养料的贮备和预处理------- 容器、工具的洗涤------ 配料、培养基制作------ 灭菌------ 冷却------ 接种------ 培养------- 贮存 2、 基本设施 ① 厂房：② 原料库③原料预处理场地④ 洗涤室：5配料室⑥ 灭菌室⑦ 接种室⑧ 化验室 ⑨ 培养室⑩贮存室 二、 纯种分离 菌种的分离方法主要有：孢子分离法、组织分离法、基内菌丝分离法和土中菌丝分离法。
1、 孢子分离法：属有性繁殖。对于香菇、平菇异宗结合的菇类，为避免产生单孢不孕现象，必须采用多孢分离法。单孢分离法主要用于杂交育种的研究。
⑴ 种菇的选择和处理 种菇选择的标准：必须纯正，具有本菌株性状，发育健壮，无病虫害，成熟度适当。种菇选定后，首先除去附着在菇体表面的杂物，如蘑菇、草菇可用0.1%升汞浸泡消毒2-3分钟，然后用无菌水漂洗3次，以洗除表面附着的药物，最后用无菌纱布吸干水分。香菇、平菇可用75%酒精进行表面消毒。
（2）多孢分离法 ① 整菇播种法② 钩悬法③ 贴附法 4菌褶上抹取孢子法⑤ 孢子印分离法 ⑥ 空中孢子捕捉法
（3）单孢子分离法 一般采用方法：平板稀释法、连续稀释法、毛细管法等。
2、 组织分离法
（1） 子实体分离法
（2）菌核分离法
（3）菌索分离法：对一些不易找到子实体及菌核的菌类
3、基内菌丝分离法 对于子实体只有在特定的季节下出现，平时不易采到，或子实体小而薄或呈胶质状态
（1）菇木（或耳木）分离法 在食用菌繁殖旺盛期
（2） 代料基质分离法 分离前，选择一批子实体发生早、产量高、菇体尚幼嫩且生活力强而无病虫害的栽培袋，待子实体将近成熟时，去掉子实体，然后用75%酒精将培养袋进行消毒后，在培养料下1.5cm处挑取0.3cm的培养料小方块组织，接入试管培养基的中央，置于恒温下培养。
3、 土中菌丝分离法： 用于采集生长在土中的菇类菌丝体
三、制种技术 采用孢子分离、组织分离和基内菌丝分离等方法分离培养而获得的纯菌丝，经过原种的扩大培养和母种、栽培种的制作，即可作为食用菌生产用的菌种。
1、 菌种的类型 母种、原种、生产种
2、 培养基的种类 天然培养基、合成培养基、半合成培养基
3、 原种制作 从担孢子或菇体组织直接分离培养获得的原种或引进的原种
4、 母种及生产种制作 将原种菌丝体移植到由粪、草、木屑、棉籽壳或麦粒等原料配制成的培养基上，而制成的菌种称母种。将母种再扩大繁殖制成的菌种，称栽培种或生产种。
5、 培养基灭菌
（1）高压蒸汽灭菌法 琼脂培养基采用1.05kg/cm2 压力，温度121℃ ，灭菌45-60分钟；母种和栽培种固体培养基采用1.2-1.5kg/cm2 压力，温度123-129℃ ，灭菌1-1.5 小时。 （2） 常压蒸汽灭菌
6、 接种室消毒灭菌 熏蒸消毒法：甲醛与高锰酸钾混合熏蒸法
（2）紫外线消毒：（3）石碳
酸灭菌
7、 接种 在无菌条件下，将原种或母种菌种移接到经过严格灭菌的培养基上，称为接种。 8、 菌种培养
四、菌种保藏方法及复壮技术
1、 菌种保藏方法 菌种保藏的基本手段是采用低温、冷冻、干燥、减少供氧量等方法，终止其繁殖，降低其代谢强度，使之处于休眠状态。

G. 常用的食用菌菌种分离方法有哪几种各有何优缺点

1. 组织分离法：简便、易成功，保持原菌种性状，重复易退化，不适于耳类。

2. 孢子分离法：菌龄小，生命力强，变异率高。

3. 基内菌丝分离法

H. 食用菌制种技术的菌种保藏

一个优良菌株被选育出来以后，必须保
持其优良性状，防止杂菌污染，才不致降低生产性能。因此保藏好菌种，对研究和生产食用菌都具有十分重要的意义。菌种保藏的方法有斜面低温、沙土管、液体石蜡封藏、冷冻真空及液氮超低温等。
斜面低温保藏法
这是最简单最普通的保藏方法，即将菌种在适宜的斜面培养基上培养成熟后，置于4—5'C的低温下保藏，以后每隔2～3个月转管一次。此法适用于除草菇外的所有食用菌菌种。草菇对低温忍耐力差，它的菌丝体在5 0C下即易死亡，因此草菇菌种应保藏在lo～13'(2的环境中。若需置于4～5℃的低温下保藏，应在草菇菌苔上灌注3～4mL的防冻剂。一般生产上，草菇多采用室内常温保藏。
低温保藏菌种的培养基一般用营养丰富的天然培养基，如马铃薯—葡萄糖—琼脂培养基等。为防止菌种在保藏过程中产生酸过多，在配制保藏用培养基时需添加少许缓冲盐，如磷酸二氢钾(KH2P04)或碳酸钙等。
斜面低温保藏菌种虽然简便，但保藏时间较短，需经常转管，故容易发生退化现象。为了弥补这一缺点，在生产上，最好把斜面低温保藏法与其他保藏法结合起来，以减少转管次数。母种在第一次转管时，尽量多移斜面试管，部分用第一次生产，取几管作矿油保藏(或冷冻干燥、液氮低温保藏)，其余则作为以后几批生产用的母种，暂存于4～6'C低温处，待低温保存的菌种用完后(或超过储存期后)，再从第一代矿油保存的菌种移出殖。这样做能使每批生产使用的菌种都保持在前几代的水平上，有利于菌种优良性状的保持(图3—1)。
液体石蜡保藏法
食用菌菌丝均可用石蜡保藏，一般可保存3年以上，但最好1—2年移接一次，即使不移接，室温下可保藏6～8个月。用此法保藏的菌种不必置于冰箱内，室内比冰箱内保藏效果更好。
液体石蜡又名矿油，是一种导泻剂，在医药商店有售。分装于三角瓶中加棉塞封口，高压蒸汽灭菌2～3次(每次30min)，然后经无菌检查合格后方可使用。由于高压蒸汽灭菌常有水蒸气渗入，需在4'C温箱或烘箱中烘烤8～10h，使水分蒸发。用无菌吸管将灭菌石蜡加入要保藏菌种斜面试管内，用量要高出斜面尖端约lcm。将棉塞齐口剪平，再用蜡密封管口。
使用矿油保藏菌种时，不必倒去矿油，用接种工具从斜面上取一小块菌丝先在无菌水
中洗涤，然后移接于斜面培养基上即可。原母种可重新封口继续保藏。
沙土保藏法
此法是将食用菌孢子保藏于干燥的无菌沙土中，保藏期为2一10年。具体方法如下：
1．取河沙过筛(60～80目筛子)，除去大沙粒，用10%的盐酸浸泡以除去有机物。盐
酸用量以淹没沙面为宜。浸泡2～4h后，倒去盐酸，用水洗几次，直到接近中性，烘干或晒
干。
2．沙与土比例以2 ：l～4 ：1为宜，沙过多影响菌种保藏质量，土过多时易结块，接
种后抽干困难。
3．把干沙、土按比例混合压装于安瓿管或小试管，装入量以0.5～lcm为宜，加棉塞，
高压蒸汽灭菌(压力在0．15MPa)灭菌3次，每次30min，干热灭菌(160℃，2h)。待无菌检
查合格后(取少许干沙土放入牛肉汤培养液中，无菌生长)方可使用。
4．用接种环将孢子接于沙土管中拌匀即可。或将孢于接于5mL无菌水的试管中，
充分播匀成孢于悬液，然后用lmL无菌吸管吸取孢子悬液加入沙土管中(每管加0.2mL)
即可。
5．将接种后的沙土管置于盛有干燥剂(生石灰、氯化钙或硅胶)的容器内，接上
0．5KW的真空泵抽气约8h，使沙土基本干燥。
6．经抽样检查，证明无杂菌生长，即可封口进行保藏。
四，真空冷冻干燥保藏法
此法是采用真空、干燥和低温三种手段来保藏菌种，因此菌种保藏期长达10～20年 后仍不降低其原有性能。
冷冻干燥保藏的基本方法是将需要保藏的孢子悬液装在特制的安瓿管中，然后骤然 冰冻，并立即抽成真空，使培养物以固体形态升华脱水，熔封后在低温或室温下保藏。
试验证明，用此法保藏蘑菇、香菇、侧耳和金针菇等食用菌的孢子和银耳的芽孢子3 年，全部存活，直至8年后仍有90%存活。可见用此法保藏食用菌孢子至少可存活8年。 但此法不能用来保藏不长孢子的菌类。
其他保藏方法
（一）液体超低温保藏法
试验证明，用一130～一196℃液体氮超低温冰箱能保藏所有食用茵菌种，包括一些不 能用冷冻干燥保藏的菌种，甚至“怕冷”的草菇以10%甘油和5%～10%二甲基砜做保护 剂，居然也能在超低温冰箱中保藏。由于超低温能使代谢水平降到最低限度，因此菌种基 本上不发生变异。
在启用液氮超低温保藏的菌种时，应先将安瓿管置于35～40℃的温水中，使管中的 冰块迅速溶解，然后再启安瓿管，取悬浮的菌丝块移植在培养基上活化培养。
（二）菌丝球生理盐水法
先将食用菌菌种用液体振荡培养3～7天，然后将形成的菌丝球吸入装有5mL无菌 生理盐水的试管中，每管约移人4—5个菌丝球。试管用无菌橡皮塞塞上，并用蜡封口，置 室温或4℃下保藏。一般可保藏1～2年。
（三）麦粒菌种保藏法
麦粒菌种保藏法是利用麦粒作培养料。用于保藏菌种的麦粒，含水量在25%左右， 这样的麦粒，在灭菌后种皮不破裂。制作方法；先将小麦浸水5h，滤去水后晾干麦粒表面 的水分，装入小试管，装入量为试管高的l/3；高压蒸汽灭菌(压力0.15MPa)灭30min；冷却后接人孢于液或菌丝悬浮液，摇匀后置于适温培养。当试管中的麦粒发满菌丝后，放人 装有氯化钙的干燥器内，进行抽气干燥，干燥后，将干燥器放于低温(20℃以下)处保藏。 此法保藏菌丝，经1～2午后，再接到培养基上，菌丝生长仍然良好。

I. 常用的菌种保存方法有哪些

菌种保藏是食用菌产业的一项基础工作，是确保野生种质资源基因留存和现有生产用种遗传性能相对稳定的必要手段。菌种保藏的方法多种多样，有的虽然保藏效果好，但投资高或操作繁杂。在生产实践中，更需要设备投入少，能保障菌种不死亡、不污染、最大限度地保持优良种性的简便方法，如斜面低温短期保藏和自然基质较长期保藏相结合的方法。

一般而言，对母种进行长期保存，对原种进行短期保存。须保证优良菌种的性状和活力不发生变异，不死亡，不被污染，确保其纯度。因此，保存方法应具备取材容易、操作方便、菌种不易退化、长期保存不污染杂菌等优点。常用的菌种保存方法如下：

（一）斜面低温保藏 该法的优点是保藏方便且所占空间较小。具体做法是：菌丝长满斜面后，放在0～5℃保存。以后每隔一定时间（2～3个月）转管一次。转管保存不能长期用PDA培养基，否则种性易退化，灰树花降解木质纤维素的能力减弱。因此隔一定时间（1年左右）须把菌种转接到木屑培养基上复壮，之后挑选健壮无污染的菌丝再转回PDA培养基保存。在长期保存过程中，要防棉塞受潮滋生杂菌。菌种试管口最好用蜡烫封，以防培养基内水分过快蒸发。增加琼脂用量（2.5%～3%）可减缓水分蒸发。还要防止菌种管上的标签脱落而造成种系混杂。

斜面低温保藏方法简便易行，能随时观察保藏菌株的活力和纯度，一旦染杂，肉眼能及时发现。

（二）自然基质保藏 此法是根据灰树花的特性，利用自然基质保藏其菌种的方法。灰树花是木腐菌，可以采用以木屑为主料的培养基。自然基质营养全面，且大部为缓释养分，不易产生营养过剩或饥饿；其次，培养基理化性状好，可吸收或缓冲菌丝代谢出的有害物质，水分与通气协调平衡，部分菌丝扎入基质内生长，不裸露于空气中，菌丝呼吸强度低，生命力强。

1.原料与配方 粗、细木屑比例适当，采用板栗树木屑最佳，粗木屑粒径为2毫米左右，细木屑为一般圆盘锯屑，粗、细的比例为1∶2，添加干木屑重量20%的麸皮和1%的糖，含水率为60%左右。这样的基质通气性好，营养丰富且供菌丝分解利用的时间长，长到基质内部的菌丝比包裹在基质外部暴露于空气中的菌丝耐受性强。不同粒径的基质比例适当，还能协调气与水的矛盾。粗粒过多，架空菌丝多；细粒过多，透气性差，菌丝生长慢。应用配方如下：

栗木屑78%，麸皮20%，石膏1%，蔗糖1%，水65%配料，装入较粗大的试管中，装料量为试管的1/3～1/2，1.5千克/厘米2灭菌1.5小时。冷却后，接入需保藏的菌种，在28℃下培养，待菌丝长满木屑培养基时取出换上无菌橡皮塞，在0～5℃冰箱内保藏1～2年转管一次。

2.容器与装量 采用容量250毫升的葡萄糖玻璃瓶，清洗洁净，装量一般不超过玻璃瓶容量的3/5，填料不能过满，瓶壁所残留的颗粒须擦拭干净，否则保藏的菌种易引起污染。

3.灭菌和冷藏 灭菌时若采用棉塞封口，基质表层易失水，接种成活率低，即使菌丝复活，生长也很缓慢，所以最好采用聚丙烯膜封口，接种后换用无菌棉塞培养，待菌丝长满后再换成有孔灭菌胶塞冰箱保藏。

用上述方法保藏的菌种经3年贮放后，接出成活率均达90%以上，出菇验证产量及子实体形态特征均无明显变化。因此，自然基质保藏法具有保存期长，菌种遗传性能相对稳定的特点。

（三）木粒PDA斜面保藏 灰树花在自然状态下易发生于栗树根部，这说明其营养需求较为特殊。根据灰树花这种习性，在PDA基础上添加适量的栗树木粒制成母种培养基。在多年的使用中发现，用该培养基培养的母种生长势好，在转接原种时，适应能力强，萌发定植快；用作菌种保藏基质时，保藏时间长，并能很好保持菌种的优良性状。

1.木粒PDA的制作 选取栗树边材，加工成0.3～0.5厘米的颗粒，及时烘干或晒干备用。称取葡萄糖10克，KH2PO41克，1溶解于1升清水中配制成营养液。将营养液倒入盛有木粒的小铝锅中，营养液以完全浸没木粒为准。煮沸10分钟，以加快木粒对营养液的吸收速度，起锅静置30分钟让木粒吸足营养液。捞出木粒，沥掉表面的水，装入试管，装量为试管长的1/6，最多不得超过试管长的1/5，否则在摆制斜面时，不易使木粒均匀分散于斜面的表面上。

选取新鲜的马铃薯，去皮并切成薄片，称取200克放入小铝锅中，加入1升清水，文火煮沸30分，趁热过滤取汁，并补足1升的体积。称取琼脂20克，葡萄糖20克，KH2PO4 2克，MgSO47H2O 2克。先将琼脂剪碎，加入到马铃薯滤液中，继续用文火加热，使琼脂溶化。待琼脂完全溶化后，加入称好的其他3种营养成分，搅拌使这些物质溶解均匀，趁热装入已装有木粒的试管中，装至试管长的1/3处，塞上棉塞。

在0.8～1千克/厘米2蒸气压下灭菌40分，待气压降至0时，开盖取出，趁热轻轻抖拍试管，使木粒分散后即可摆制斜面，并使木粒呈半裸状分布于斜面上，待凝固后便制成了木粒PDA培养基。

2.生长及保藏效果 木粒PDA斜面上培养的灰树花母种，菌丝生长迅速、良好，12天即可长满试管，但菌丝的后期生长势更为粗壮、浓密，后劲足。转接原种时，菌种适应力强，定植快。这表明，灰树花菌丝的生长速度、生长势不仅取决于本身的遗传性，而且很大程度上取决于培养基的营养。常规PDA的营养成分，主要是可溶性的速效性营养，前期营养丰富，营养利用直接，因而前期菌丝生长迅速、良好，后期营养则不足，菌丝生长不良，长势欠佳。木粒PDA由于在增添了木粒这一缓效性营养，就木腐性的灰树花而言，营养配伍合理，补充了菌丝生长后期所需的营养，因此后劲足。

菌丝体对基质的分解利用是通过菌丝细胞分泌的胞外酶，将基质中的大分子营养分解成小分子营养后才被吸收利用的，而这些胞外酶大多为诱导酶，其合成与分泌受基质的诱导和分解产物阻遏机制调节。就纤维素酶而论，许多易代谢碳源（如葡萄糖等）具有引起酶合成阻遏作用，同时伴随着菌丝体的旺盛生长，酶的大量合成则出现在易代谢碳源基本耗尽之后，且受到基质纤维素的诱导，常规PDA基质，到葡萄糖等易代谢碳源基本耗尽的后期，由于营养的缺乏，菌丝生理机能下降，酶的合成量减少。而木粒PDA不仅含有易代谢碳源——葡萄糖，又含有木粒这一缓效性营养，前期葡萄糖促进了菌丝体旺盛生长，获取了大量的菌丝体，表现为菌丝粗壮、浓密。到了易代谢碳源耗尽的后期，木粒一方面补充了后期所需的营养，使菌丝的生埋机能维持在一定的水平；另一方面木粒的纤维素激活菌丝细胞纤维素酶的诱导机制，合成了大量的酶，保持了木腐生性灰树花较强的分解木材的能力，因此，用该培养基培养的母种在转接原种时适应力强，萌发定植快。因部分菌丝长入木粒内部，抵抗不良环境的生存能力增强，种质不易退化。木粒PDA灰树花菌种，在0～5℃保藏2～3年再转管活化，成活率仍达到90%左右。此外，木粒PDA应用于木腐性灰树花种的提纯复壮，效果也较理想。

（四）石蜡隔氧封藏 具体做法是将液态石蜡分装入三角瓶内，装量达瓶空间的1/3，塞好棉塞，于121℃灭菌2小时，然后置40℃温箱中，使其水分蒸发，或置于干燥器内数日以除去水分，石蜡呈透明状为宜。在无菌条件下，用无菌吸管装入已长好菌丝的斜面试管，使液面高出斜面顶部1厘米左右。塞上无菌橡皮塞，竖直保存。此法可使菌种存活3年以上，但以1～2年移植一次为好。移植时不必倒出石蜡，用接种钩取一块菌丝即可。因转移时带有石蜡，菌丝生长弱，需要再转管1～2次，方能复壮。