制备转基因动物常用的方法

A. 转基因动物基因转移方法

1. 哺乳动物的基因转移技术主要通过显微注射等手段，将改造后的基因或基因组片段注入受精卵或早期胚胎细胞，然后将这些细胞植入受体动物的输卵管或子宫，以培育出转基因动物。
2. 目前，常用的转基因动物制作技术包括显微注射法、反转录病毒法、胚胎干细胞法、电脉冲法以及精子载体导入法等。显微注射法因其高成功率而成为最常用的方法之一。
3. 制备转基因小鼠的过程包括：首先，选择适宜年龄的雌性小鼠，通过注射PMSG和HCG促进排卵，与雄性小鼠交配。次日，取出受精卵并培养。其次，在显微镜下选择核清晰的受精卵，注入DNA溶液。最后，将2细胞受精卵移植到假妊娠雌性小鼠的输卵管中，完成转基因小鼠的培育。
4. 转基因动物是指将外源重组基因转染并整合到受体细胞基因组中，使其表达外源基因的动物。转基因动物表达系统包括外源基因、表达载体和受体细胞等。基因组的转移是细胞核移植和动物克隆技术的基础，同时也是合成生物学中人工合成与设计基因、全基因乃至基因组的转基因技术的关键。

B. 转基因动物的制备方法有哪些

根据外源基因导入的方法和对象的不同，制作转基因动物的方法主要有显微注射法、反转录病毒法、胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES细胞）法、电脉冲法、精子载体导入法等。

1、显微注射

是最常用且成功率较高的方法。基因显微注射法的特点是外源基因的导入整合效率较高，不需载体，直接转移目的基因，目的基因的长度可达lOOkb（10万个碱基对）。

它可直接获得纯系，所以实验周期短。但需要贵重精密仪器，技术操作难度大，并且外源基因的整合位点和整合的拷贝数都无法控制，易造成宿主动物基因组的插入突变，引起相应的性状改变，重则致死。

2、反转录病毒感染法

该法整合率较高，目的基因不易破坏，多是单拷贝、单位点整合，适合于难以观察到原核的禽类受精卵。由于病毒衣壳大小的限制，目的基因不宜超过10kb，否则影响活性和稳定。此外，病毒DNA可能影响外源基因在宿主动物的表达。

3、胚胎干细胞法

胚胎干细胞（ES细胞）指从囊胚期的内细胞团中分离出来的尚未分化的胚胎细胞，具有发育全能性，能进行体外培养；扩增、转化和制作遗传突变型等遗传操作。

本法外源基因整合率高，植入囊胚前筛选合适的转化的ES细胞，克服了以前只能在子代选择的缺点，并能充分利用分子生物学发展起来的各种先进方法，是很有前途的技术。缺点是不易建立ES细胞系。并且由于通过嵌合体途径，所以实验周期长。

4、电脉冲法

电脉冲法（electroporation）又称电穿孔法，是将供体DNA与受体细胞充分混匀，在外界的高电压短脉冲下改变细胞膜结构，使细胞膜产生瞬间可逆性电穿孔，从而使一定大小的DNA可以通过细胞膜进入细胞，运送到细胞核。

5、精子导入法

利用精子作为外源基因载体，借助受精作用把外源基因导入受精卵，整合到受精卵的基因组中，称之为精子载体导入法，是构建转基因动物的一种新尝试。

该法简单、方便，依靠生理受带过程，免去了对原核的损伤。但在实践中成功率较低，对于精子是否可作为外源DNA载体也存在争论。这项技术尚处在探索阶段。该法可以将人工授精、体外受精与转基因结合起来。

安全管理

在我国，先后颁布了《农业转基因生物安全管理条例》、《农业转基因生物安全评价管理办法》等法律法规。在管理范围、安全性评价、管理措施等方面做了一系列规定，以确保使用安全。

转基因技术正在领导一场新的农业科技革命。我国公众对转基因技术和转基因食品还存在一些疑虑，应该采用多种形式进行普及生命科学知识的教育，使公众对转基因技术有一个较为科学的认识，主动地接受转基因食品。使转基因技术贴近民众，造福于人类。

以上内容参考：网络-转基因动物、网络-动物转基因技术

C. 转基因动物基因转移方法

哺乳类动物基因转移方法主要涉及将改建后的目的基因或基因组片段通过显微注射等技术注入实验动物的受精卵或着床前胚胎细胞中，随后将这些细胞植入受体动物的输卵管或子宫，以实现转基因动物的产生。

当前，制作转基因动物的技术手段包括显微注射法、反转录病毒法、胚胎干细胞法、电脉冲法以及精子载体导入法等。其中，显微注射法是最为常用且成功率较高的方法之一。

在转基因小鼠制备过程中，具体步骤如下：

一、采集受精卵

• 超数排卵：选择适宜年龄的雌性小鼠，通过注射PMSG和HCG促进排卵，随后与雄性小鼠交配。雌性小鼠阴道栓的出现是交配成功的标志。


• 取受精卵：次日上午，剖杀雌性小鼠，取出输卵管，置于培养液中。小心切开壶腹部，用酶液冲洗，分离受精卵至培养液。在显微镜下筛选出核清晰的受精卵，移入装有培养液的胚胎培养皿，覆盖矿物油并放入CO2孵箱培养。

二、向受精卵注入DNA溶液

通常向较大、能容纳更多外源DNA的雄性原核注入DNA溶液。在琼脂糖凝胶电泳法测定DNA纯度后，将含有受精卵和DNA溶液的培养液滴共同放置在载玻片上，固定在显微注射仪的载物台上，通过吸管将DNA溶液注入雄性原核。为确认注入情况，观察雄性原核是否膨大。随后收集未受损的卵子，继续在CO2孵箱中培养。

三、移植2细胞受精卵

选择发育成2细胞的受精卵，移植到假妊娠雌性小鼠的输卵管中，以完成转基因小鼠的培育过程。

将外源重组基因转染并整合到动物受体细胞基因组中，从而形成在体表达外源基因的动物，称为转基因动物。转基因动物表达系统，包括外源基因、表达载体和受体细胞等，基因组的转移则是细胞核移植和动物克隆技术，人工合成与设计基因、全基因乃至基因组的转基因技术是合成生物学。