蛋白质测序的常用方法

1. 蛋白测序技术有哪几种

Sanger法：用于鉴定蛋白质和多肽的N－末端氨基酸残基。
Edman降解：是氨基酸序列的测定技术，但是它不能测超过40个残基的序列。

2. sanger 求蛋白质测序法的原理，越详细越好！

sanger 法是指 用二硝基氟苯(DNFP)与多肽链上的 N端 氨基酸 的氨基反应 生成DNP-氨基酸 在酸性条件下水解 多肽链, DNP-氨基酸断裂下来,其余的是多肽链,然后通过纸层析DNP-氨基酸,确定是那种氨基酸.(当然某些氨基酸中的R基上氨基和羟基也可与 DNFP反应,但可通过有机溶剂除去).
ps 1953年 英国人sanger用测定了牛胰岛素的氨基酸序列,闻名于世.

3. 常用的蛋白质含量测定方法有哪些

①凯氏定氮法
原理：蛋白质平均含氮量为16%。当样品与浓硫酸共热，蛋白氮转化为铵盐，在强碱性条件下将氨蒸出，用加有指示剂的硼酸吸收，最后用标准酸滴定硼酸，通过标准酸的用量即可求出蛋白质中的含氮量和蛋白质含量。
②双缩脲法
原理：尿素在180℃下脱氨生成双缩脲，在碱性溶液中双缩脲可与Cu2+形成稳定的紫红色络合物。蛋白质中的肽键实际上就是酰胺键，故多肽、蛋白质等都有双缩脲（biuret）反应，产生蓝色或紫色复合物。比色定蛋白质含量。
缺点：灵敏度低，样品必须可溶，在大量糖类共存和含有脯氨酸的肽中显色不好。其 精确度 较差 (数mg)，且会受样品中 硫酸铵 及 Tris 的干扰，但 准确度 较高，不受蛋白质的种类影响。
③Folin酚法(Lowry)
Folin酚法是biuret 法的延伸，所用试剂由试剂甲和乙两部分组成。试剂甲相当于双缩脲试剂（碱性铜试剂），试剂乙中含有磷钼酸和磷钨酸。
在碱性条件下，蛋白质中的巯基和酚基等可将Cu2+还原成Cu+， Cu+能定量地与Folin－酚试剂反应生成蓝色物质，600nm比色测定蛋白质含量。
灵敏度较高(约 0.1 mg)，但较麻烦，也会受 硫酸铵 及 硫醇化合物 的干扰。 步骤中各项试剂的混合，要特别注意均匀澈底，否则会有大误差。
④紫外法
280nm光吸收法：利用Tyr在280nm在吸收进行测定。
280nm-260nm的吸收差法：若样品液中有少量核酸共存按下式计算：
蛋白质浓度(mg/ml)=1.24E280-0.74E260 （280 260为角标）
⑤色素结合法（Bradford 法）
直接测定法：利用蛋白质与色素分子（Coomassie Brilliant Blue G-250）结合物的光吸收用分光光度法进行测定。
考马斯亮兰（CBG）染色法测定蛋白质含量。CBG 有点像指示剂，会在不同的酸碱度下变色；在酸性下是茶色，在中性下为蓝色。当 CBG接到蛋白质上去的时候，因为蛋白质会提供 CBG一个较为中性的环境，因此会变成蓝色。当样本中的蛋白质越多，吸到蛋白质上的CBG也多，蓝色也会增强。因此，蓝色的呈色强度，是与样本中的蛋白质量成正比。
间接测定法：蛋白质与某些酸性或碱性色素分子结合形成不溶性的盐沉淀。用分光光度计测定未结合的色素，以每克样品结合色素的量来表示蛋白质含量的多少。
⑥BCA法
BCA（Bicinchoninc acid procere，4,4’-二羧-2,2’-二喹啉）法与Lowry法相似，主要差别在碱性溶液中，蛋白质使Cu2+转变Cu+后，进一步以BCA 取代Folin试剂与Cu+结合产生深紫色，在波长562 nm有强的吸收。
它的优点在于碱性溶液中BCA 比Folin试剂稳定，因此BCA与碱性铜离子溶液结合的呈色反应只需一步骤即完成。灵敏度Lowry法相似。
本方法对于阴离子、非离子性及二性离子的清洁剂和尿素较具容忍度，较不受干扰，但会受还原糖 及EDTA的干扰。
⑦胶体金测定法
胶体金(colloidal gold)是氯金酸(chloroauric acid)的水溶胶，呈洋红色，具有高电子密度，并能与多种生物大分子结合。
胶体金是一种带负电荷的疏水胶体遇蛋白质转变为蓝色，颜色的改变与蛋白质有定量关系，可用于蛋白质的定量测定。
⑧其他方法
有些蛋白质含有特殊的 非蛋白质基团，如 过氧化物酶含有 亚铁血红素基团，可测 403 nm 波长的吸光来定量之。 含特殊金属的酶 (如镉)，则可追踪该金属。

4. 请教蛋白质质谱测序

蛋白质谱一般来讲是用来对某个蛋白质进行鉴定的方法
而蛋白质测序实际上就是检测蛋白质的多肽链数目，不一定要用到质谱技术

简单说，蛋白质测序的方法有很多，一般是在构建完成后，通过测序来对比之前的预测的序列是否正确。
而质谱检测一般是用在蛋白质表达纯化完成后，用来鉴定是否是最初设计的那个蛋白。

5. 蛋白质测序的测序要求

●1 样品必需纯（>97%以上）；
●2 知道蛋白质的分子量；
●3 知道蛋白质由几个亚基组成；
●4 测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。
●5 测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。

6. 蛋白质测序的测定步骤

1 多肽链的拆分。由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基).
2 测定蛋白质分子中多肽链的数目。通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。
3 二硫键的断裂。几条多肽链通过二硫键交联在一起，可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。
二硫键的切割与保护（元素后数字为下标）
a 过甲酸〔performic acid〕 不可逆
－CH2SO3H
b、还原+氧化 不可逆
[ 巯基乙醇，DTT ] + 碘乙酸等
－S-CH2-COOH
c、亚硫酸分解〔Sulfitolysis〕 可逆
－R1-S-S-R2 + HSO3-
R1-S- + R2-S-SOH3
可以通过加入盐酸胍的方法解离多肽链之间的非共价力；应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间的二硫键。
巯基（-SH）的保护

作用：这些反应(见右图）可用于巯基的保护。
4 测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比（如右图）
5 分析多肽链的N-末端和C-末端
多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸(Carboxyl-terminal) 。在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。N末端分析法（Sanger法；Edman法；DNS-Cl；酶降解法），C末端分析法（肼解法；酶降解法；硼氢化锂法）。
6 多肽链断裂成多个肽段。可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。
7 测定每个肽段的氨基酸顺序
8 确定肽段在多肽链中的次序。
利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。
9 确定原多肽链中二硫键的位置
一般采用胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链，再利用双向电泳技术分离出各个肽段，用过甲酸处理后，将可能含有二硫键的肽段进行组成及顺序分析，然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置。

7. 蛋白质测序的概念

当前，所谓蛋白质测序，主要指的是蛋白质的一级结构的测定。蛋白质的一级结构(Primary structure)包括组成蛋白质的多肽链数目。很多场合多肽和蛋白质可以等同使用。多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。
蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经知道约十万个不同蛋白质的一级结构。

8. 蛋白质N端测序的测定蛋白质N端序列的方法

目前对蛋白N端测序主要分类两大类，其一为非质谱技术，例如经典的Edman降解法、利用反转录RT-PCR得到对应蛋白的cDNA，再来反推得到蛋白序列；其二为质谱技术。各自都有其使用的长处和制约之处，目前，市面上采用的，依然是基于经典的Edman降解法原理，利用美国ABI公司Procise491蛋白序列测序系统进行蛋白N-端测序。

9. 蛋白质序列测定的原理与方法

网络"蛋白质测序"词条下有详细介绍
1肽链的拆开和分离
●2测定蛋白质分子中多肽链的数目
●3二硫键的断裂
●4测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比
●5N端、C端的测定
●6多肽链断裂
●7测定每个肽段的氨基酸顺序。
●8确定肽段在多肽链中的次序。
●9确定原多肽链中二硫键的位置。

10. 蛋白质测序的介绍

所谓蛋白质测序，主要指的是蛋白质的一级结构的测定。蛋白质的一级结构(Primary structure)包括组成蛋白质的多肽链数目。很多场合多肽和蛋白质可以等同使用。多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。