简述食用菌菌种保藏原理及方法

A. 为什么要进行菌种的保藏工作

菌种保藏是食用菌菌种生产中的一项必不可少的重要环节。获得一株优良的菌株是很不容易的，但又不可能一劳永逸。因为一个优良菌株在长期保存和应用过程中，如果保藏设备和手段不适宜，或传代次数过多，培养时间过长，或因受不利外界环境条件的影响，常会导致种性衰退甚至死亡。因此，需在一定时间内使菌种的生活力、纯度和优良性状稳定地保存下来，就必须采取相应的措施，认真做好菌种的保藏工作。菌种保藏前，必须种性清楚、来源正宗、名称准确，具一整套有关技术数据和资料，并处于良好状态。

菌种保藏工作要有专人负责，每个生产单位都要有自己的菌种档案，详细记录菌种来源、移植经过、保藏情况和在生产上使用的结果。管理人员要定期检查保藏情况，及时清除已被污染的菌种。使用菌种时，在任何情况下，都不应将保藏的菌种全部用完。菌种的标签，要字迹清楚，可长期保留，字迹模糊或没有标签的菌种最好不要使用。对保藏的菌种，至少两年要做1次出菇试验，从生长情况和经济性状上综合考察保藏效果。

作为普通菌种生产企业和食用菌栽培者，由于条件、设备和技术水平的限制，常常只是菌种的贮藏。

B. 食用菌制种技术的菌种保藏

一个优良菌株被选育出来以后，必须保
持其优良性状，防止杂菌污染，才不致降低生产性能。因此保藏好菌种，对研究和生产食用菌都具有十分重要的意义。菌种保藏的方法有斜面低温、沙土管、液体石蜡封藏、冷冻真空及液氮超低温等。
斜面低温保藏法
这是最简单最普通的保藏方法，即将菌种在适宜的斜面培养基上培养成熟后，置于4—5'C的低温下保藏，以后每隔2～3个月转管一次。此法适用于除草菇外的所有食用菌菌种。草菇对低温忍耐力差，它的菌丝体在5 0C下即易死亡，因此草菇菌种应保藏在lo～13'(2的环境中。若需置于4～5℃的低温下保藏，应在草菇菌苔上灌注3～4mL的防冻剂。一般生产上，草菇多采用室内常温保藏。
低温保藏菌种的培养基一般用营养丰富的天然培养基，如马铃薯—葡萄糖—琼脂培养基等。为防止菌种在保藏过程中产生酸过多，在配制保藏用培养基时需添加少许缓冲盐，如磷酸二氢钾(KH2P04)或碳酸钙等。
斜面低温保藏菌种虽然简便，但保藏时间较短，需经常转管，故容易发生退化现象。为了弥补这一缺点，在生产上，最好把斜面低温保藏法与其他保藏法结合起来，以减少转管次数。母种在第一次转管时，尽量多移斜面试管，部分用第一次生产，取几管作矿油保藏(或冷冻干燥、液氮低温保藏)，其余则作为以后几批生产用的母种，暂存于4～6'C低温处，待低温保存的菌种用完后(或超过储存期后)，再从第一代矿油保存的菌种移出殖。这样做能使每批生产使用的菌种都保持在前几代的水平上，有利于菌种优良性状的保持(图3—1)。
液体石蜡保藏法
食用菌菌丝均可用石蜡保藏，一般可保存3年以上，但最好1—2年移接一次，即使不移接，室温下可保藏6～8个月。用此法保藏的菌种不必置于冰箱内，室内比冰箱内保藏效果更好。
液体石蜡又名矿油，是一种导泻剂，在医药商店有售。分装于三角瓶中加棉塞封口，高压蒸汽灭菌2～3次(每次30min)，然后经无菌检查合格后方可使用。由于高压蒸汽灭菌常有水蒸气渗入，需在4'C温箱或烘箱中烘烤8～10h，使水分蒸发。用无菌吸管将灭菌石蜡加入要保藏菌种斜面试管内，用量要高出斜面尖端约lcm。将棉塞齐口剪平，再用蜡密封管口。
使用矿油保藏菌种时，不必倒去矿油，用接种工具从斜面上取一小块菌丝先在无菌水
中洗涤，然后移接于斜面培养基上即可。原母种可重新封口继续保藏。
沙土保藏法
此法是将食用菌孢子保藏于干燥的无菌沙土中，保藏期为2一10年。具体方法如下：
1．取河沙过筛(60～80目筛子)，除去大沙粒，用10%的盐酸浸泡以除去有机物。盐
酸用量以淹没沙面为宜。浸泡2～4h后，倒去盐酸，用水洗几次，直到接近中性，烘干或晒
干。
2．沙与土比例以2 ：l～4 ：1为宜，沙过多影响菌种保藏质量，土过多时易结块，接
种后抽干困难。
3．把干沙、土按比例混合压装于安瓿管或小试管，装入量以0.5～lcm为宜，加棉塞，
高压蒸汽灭菌(压力在0．15MPa)灭菌3次，每次30min，干热灭菌(160℃，2h)。待无菌检
查合格后(取少许干沙土放入牛肉汤培养液中，无菌生长)方可使用。
4．用接种环将孢子接于沙土管中拌匀即可。或将孢于接于5mL无菌水的试管中，
充分播匀成孢于悬液，然后用lmL无菌吸管吸取孢子悬液加入沙土管中(每管加0.2mL)
即可。
5．将接种后的沙土管置于盛有干燥剂(生石灰、氯化钙或硅胶)的容器内，接上
0．5KW的真空泵抽气约8h，使沙土基本干燥。
6．经抽样检查，证明无杂菌生长，即可封口进行保藏。
四，真空冷冻干燥保藏法
此法是采用真空、干燥和低温三种手段来保藏菌种，因此菌种保藏期长达10～20年 后仍不降低其原有性能。
冷冻干燥保藏的基本方法是将需要保藏的孢子悬液装在特制的安瓿管中，然后骤然 冰冻，并立即抽成真空，使培养物以固体形态升华脱水，熔封后在低温或室温下保藏。
试验证明，用此法保藏蘑菇、香菇、侧耳和金针菇等食用菌的孢子和银耳的芽孢子3 年，全部存活，直至8年后仍有90%存活。可见用此法保藏食用菌孢子至少可存活8年。 但此法不能用来保藏不长孢子的菌类。
其他保藏方法
（一）液体超低温保藏法
试验证明，用一130～一196℃液体氮超低温冰箱能保藏所有食用茵菌种，包括一些不 能用冷冻干燥保藏的菌种，甚至“怕冷”的草菇以10%甘油和5%～10%二甲基砜做保护 剂，居然也能在超低温冰箱中保藏。由于超低温能使代谢水平降到最低限度，因此菌种基 本上不发生变异。
在启用液氮超低温保藏的菌种时，应先将安瓿管置于35～40℃的温水中，使管中的 冰块迅速溶解，然后再启安瓿管，取悬浮的菌丝块移植在培养基上活化培养。
（二）菌丝球生理盐水法
先将食用菌菌种用液体振荡培养3～7天，然后将形成的菌丝球吸入装有5mL无菌 生理盐水的试管中，每管约移人4—5个菌丝球。试管用无菌橡皮塞塞上，并用蜡封口，置 室温或4℃下保藏。一般可保藏1～2年。
（三）麦粒菌种保藏法
麦粒菌种保藏法是利用麦粒作培养料。用于保藏菌种的麦粒，含水量在25%左右， 这样的麦粒，在灭菌后种皮不破裂。制作方法；先将小麦浸水5h，滤去水后晾干麦粒表面 的水分，装入小试管，装入量为试管高的l/3；高压蒸汽灭菌(压力0.15MPa)灭30min；冷却后接人孢于液或菌丝悬浮液，摇匀后置于适温培养。当试管中的麦粒发满菌丝后，放人 装有氯化钙的干燥器内，进行抽气干燥，干燥后，将干燥器放于低温(20℃以下)处保藏。 此法保藏菌丝，经1～2午后，再接到培养基上，菌丝生长仍然良好。