筛选单抗的常用方法

1. 抗原抗体反应的应用

（1）抗原：免疫动物是制备抗血清的第—步。免疫所用的抗原可用病毒、细菌或者其他蛋白质抗原，如果使用半抗原如小分子激素等，必须与大分子载体连接。抗原的用量视抗原种类及动物而异，—次注射小鼠可以少至几个微克，免、羊甚至更大的动物每次注射的量就相应增加，从几百μg/次至几mg/次。
〔2）佐剂及乳化：佐剂可以帮助抗原在注射部位缓慢释放，以增加免疫刺激的效果。佐剂有完全和不完全佐剂之分。完全佐剂加有灭活的分枝杆菌（如卡介苗）或棒状杆菌。福氏佐剂可从试剂公司购买，也可用羊毛脂和石蜡油按1：2—4混合自行制备。佐剂与抗原按1：1的比例混合乳化为均匀的乳液，放置后不会发生油水分离。
（3）免疫动物：常用于制备抗血清的动物打豚鼠、家免、小鼠、大鼠等，如果大量生产可用动物羊、马等，动物接受免疫的乳液量小鼠为1．0—2．0 mL，家兔为2—4mL。抗原免疫动物的途径取决于动物种类、抗原特性和是否使用佐剂。腹腔注射（i．p），肌肉注射（i．m），皮内注射（i．d．）和皮下注射(s．c．）适合于任何抗原，这些途径主要刺激局部淋巴结发生免疫应答，初次免疫和免疫加强注射均可使用。静脉注射（i.v.）则只适合于可溶性抗原及分散的单细胞悬液，且不能使用佐剂，其诱发的免疫应答主要发生在脾脏。此外，在单克隆抗体制备时，亦可用脾脏直接注射或体外免疫方法，尤其对微量抗原比较实用。体外免疫方法也常用于人源单克隆抗体的制备。体外免疫时将脾细胞或外周血淋巴细胞（包括B细胞，T细胞及抗原递呈细胞）与抗原一起作体外培养，然后再与骨髓瘤细胞融合。初次免疫后要经过2—3次以上的免疫加强以保证能形成较高水平的IgC抗体。两次免疫注射之间的时间间隔，一般3—4周比较适合大部分动物，小动物可间隔10—14d，大动物则在2月左右。在免疫加强最后一次注射后的一周内采集抗血清，可获得高水平的抗体。 （1）采血：加强免疫的动物2—3次后，可通过耳静脉或眼球（小鼠）采血，进行抗血清效价测定。当效价达到理想的高度后，可以采血。采血方式可以从心脏直接取血，也可通过动脉放血。待血液凝固后用针筒或吸管吸取血清。
（2）抗血清的纯化与保存：除抗体外血清中含有多种其他蛋白成分。为了避免这些蛋白质干扰抗体（免疫球蛋白）标记反应和抗原抗体反应，抗血清可经过纯化以获得单一的机体（常为IgG）组分。常用的纯化IgG的方法为饱和硫酸胺盐析和层析法。蛋白质在不同的盐浓度的溶液中，其溶解度不一样，盐离子干扰蛋白质和水分子间氢键形成，因为水—盐结合比水—蛋白质结合更稳定，蛋白质即可从溶液中沉淀出来。蛋白质分子越大，沉淀时所需盐离子浓度越低。免疫球蛋白（Mr 1.5×105）比血清中主要蛋白质白蛋白（M r 6.7×104）的分子大得多，抗体在30%—50%饱和度的硫酸盐中析出，而白蛋白需在70%—80%饱和度才析出，因此常用33%饱和度的硫酸胺纯化血清中的IgG。盐析时为了减少抗体变性，需在4℃进行，同时用pH8.0缓冲液稀释抗血清，以减少蛋白浓度过高而发生共沉淀。铵盐的溶解度不随温度变化而明显改变，0℃和25℃仅差3%，而钠盐则相差5倍，因此常在低温沉淀时用铵盐，室温沉淀用钠盐。铵盐对抗体的标记反应（如FITC和biotin标记时）有一定的干扰作用。
盐析法只能部分纯化抗体，更高纯度的抗体制剂可用层析法制备。IgM五聚体相对分子质量达9.7×10，比血清中任何其他蛋白都大，用分子筛层析很容易将其纯化。IgG在PH 8．0时带负电荷，能与DEAE纤维素上的阳离子结合，因此可用离子交换层析来纯化IgG。IgG纯化最常用的方法为亲和层析。IgG与葡萄球菌A蛋白和链球菌G蛋白具合高度的亲和性，可用这两种蛋白质交联亲和层析柱将IgG纯化。大部分IgG与蛋白A结合PH为8—9，洗脱PH为2—4；而与蛋白G的结合PH为5—7，洗脱PH为9—10。C蛋白更适合于IgG的纯化，不但反应条件为温和的弱酸性或弱碱性，并且与IgG的结合力高于A蛋白。G蛋自能与大部分动物种类的IgG结合，而A蛋白对小鼠IgG1、大鼠IgG2b、人IgG3、马和绵羊IgG结合力弱或不能结合G蛋白和A蛋白均不能与鸡IgG结合。
抗血清或纯化的抗体在低温保存可维持活性数年，反复冻融使抗体很快失活，被细菌或霉菌污染的抗血清或IgG制品也易失去活性。稀释的抗血清加入防腐剂叠氮化钠和保护剂如BSA等可于4℃保存。长期保存常用等量甘油于—20℃以下冷藏。也可置于 50%饱和硫酸铵中4℃保存，还可以冷冻干燥保存。 根据不同目的制备的抗血清，对其中所含抗体的浓度，特异性及免疫球蛋白种类的要求也不一样。为了获得质量和数量上合符要求的抗血清，在收集动物血清前必须对免疫效果进行检测，对收获后的抗血清也必须对—些参数进行分析，如效价、亲和力及交叉反应等。根据不同的抗原性质选用合适的检测方法。最常用的为免疫沉淀，ELISA，放射免疫等。
效价又称滴度（titer），是常用于表达抗血清中特异性抗体相对含量的—个半定量指标，即在给定的条件下，结合—定量抗原的抗血清的稀释度。抗血清经一系列稀释后（如倍比稀释）与定量的抗原反应，以能检测抗血清最大稀释倍数即为该抗血清的效价。不同的检测方法测定同一种抗血清的效价，灵敏度不一样，抗血清的效价也不一样，如沉淀反应（琼脂双扩散）与ELISA二者的效价相差甚大，后者远高于前者。放射免疫分析（RIA）常用于标记小分子抗原来检测抗血清的效价。
亲和力（affinity）表示抗血清与相应抗原的结合强度，是描述抗体持异性的重要指标，
常用亲和常数K表示。亲和常数K与抗原抗体反应的平衡常数有关：
抗体特异性与交叉反应：抗体是特异的。只与相应抗原反应。实际制备的抗体却常有非特异性反应，这是因为抗原不纯造成的。多组分抗原之间存在共同的抗原决定簇，或者两个抗原决定簇结构类似能与同一抗体结合，均可出现抗体与异源抗原的交叉反应。用琼脂双扩散能简便直观地反映不同抗原与同一抗血清，或不同抗血清与同一抗原的交叉反应。 原理1：单克隆抗体（MAb）与抗血清（又称多克隆抗体，PAb）最主要的区别是MAb为单一种B细胞克隆所产生的一种均一的免疫球蛋白分子。所以MAb是B细胞克隆的标志，是一种独特型的抗体，它的特异性是针对一个抗原决定簇的。制备单克隆抗体不能用化学分离的方法从多克隆抗体中去分离纯化得到它，而是用分离产生抗体的B细胞克隆的方法得到它。为了使B细胞克隆能在体外人工培养下长期存活并产生完全均一的MAb，G．KÖhler合Milstein于1975年创立了杂交瘤方法。所以制备单克隆抗体的技术又称杂交瘤技术（hybredoma technique）。
杂交瘤技术的基本原理是用分泌抗体但不能长期培养的B细胞与能在体外长期培养并可低温保存的肿瘤细胞进行杂交。筛选得到的杂交瘤细胞应该是既能分泌抗体又有瘤细胞的特性，可长期传代培养，又可在液氮中保存的细胞。把这些细胞单克隆化，用单克隆化的杂交瘤细胞进行单克隆抗体的生产。
原理：最常用的单克隆抗体是小鼠的单抗，此外也有大鼠的和人源的单抗。人源单抗制备比较复杂。小鼠单抗的制备通常是使用Balb/c小鼠的B细胞和它的骨髓瘤细胞。大鼠的单抗制备通常用Lou/c大鼠及其骨髓瘤和Y3/AO大鼠及其骨髓瘤细胞。B细胞是从免疫动物的脾脏中分离出来的。动物免疫方法与抗血清制备相同，只是在制备脾脏前3d必须进行一次静脉加强注射以保证得到的B细胞有旺盛的分泌抗体的活性。骨髓瘤细胞有许多细胞株是经过诱变和筛选得到的缺陷型。筛选的标准是①瘤细胞本身不产生抗体或者产生抗体的某种链，但不能分泌；②是次黄嘌呤鸟嘌呤核苷酸转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶激酶（TK）的缺陷型。因为这种缺陷型的瘤细胞正常的核酸合成途径被氨基喋吟（aminopterin）阻断后，由于缺失这些酶，即使补充它的底物次黄嘌呤（H）和胸腺嘧啶（T），核酸合成的旁路也不能起到救援的作用，结果导致瘤细胞死亡（图7—2）。而杂交瘤细胞因带有B细胞的全套基因，在HAT存在的条件下借助于HGPRT和TK的作用通过替代的核酸合成途径能正常合成DNA和RNA。所以杂交瘤能正常地生长繁殖而被选择出来。未被融合的游离的B细胞只能存活3d而后自行死亡。这就是用HAT培养基进行选择的原理。 （1）融合：细胞杂交之前，要分别准备好脾脏的B细胞悬液和小鼠骨髓瘤细胞（如SP2/0—Agl4细胞株）。免疫后的小鼠脾脏在无菌条件下破碎，将B细胞悬浮在没有血清的培养液中（通常使用RPMIl640商品配制），并洗涤3次去掉小鼠的血清。SP2/0细胞是用加有10%胎牛或小牛血清培养的，每天更换新鲜培养液使成为对数分裂期生长旺盛的细胞。细胞用RPMIl640洗涤2—3次，把两种细胞合并在同—试管中，用50%的聚乙二醇（相对分子质量为1000—1500）作为融合剂，在37℃条件下融合l—2min。然后用1640培养液缓慢稀释，然后除去PEG，将细胞分散至HAT选择培养板中。电融合方法也可用于单克隆抗体制备，虽融合率较高，但一次融合的细胞数少，且需专门设备，故限制了其广泛使用。融合时脾细胞和骨髓瘤细胞的比例在5：1—10：1均可获得满意结果，每次融合细胞数量在10—10较为合适。融合后的细胞在40或96孔板上的HAT培养液(RPMIl640含10%—20%胎牛或小牛血清和HAT）中37℃，5%CO2条件下培养。融合后的细胞悬液中只有脾细胞和骨髓瘤细胞形成的杂交瘤细胞能在HAT培养基中生长，其他形式的融合细胞均不能生长．未融合的细胞也不能在HAT培养液中生存。
在融合后的细胞培养过程中，饲养细胞（feeder cell）有助于杂交瘤细胞的生长。饲养细胞可用同种动物的腹腔细胞或胸腹细胞。腹腔细胞中的吞噬细胞能清除死亡细胞碎片。使背景更为清洁“干净”。同时饲养细胞分泌的细胞因子或活性物质有助于杂交瘤细胞的生长。现有商品“杂交瘤细胞生长因子”可用于替代饲养细胞。
（2）阳性杂交瘤细胞的筛选与单克降化：杂交细胞经约10—14d培养后，形成可用的细胞集落（克隆）。经过几次更换培养液（HT培养液）后进行抗体活性检测。常用的筛选枪测方法是ELISA和凝集试验，前者常用于可溶性抗原，后者适用于细胞、细菌等表面抗原。此外，Dot－ELISA、免疫印迹及免疫荧光试验均可用于杂交瘤细胞的筛选。
使许多细胞克隆混合生长的细胞分离为单个的细胞克隆的过程称克隆化（colonization）最常用的单克隆化方法是有限稀释法（limited dilution），即将混合细胞经稀释后分装于培养板上，使培养板的大部分孔中只出现一个细胞。为了确保抗体分泌细胞来源于单个细胞，克隆化过程可重复进行，称为亚克隆化（subclonization）。除有限稀释法外，荧光激活细胞分拣法（FACS）也用于杂交瘤细胞的克隆化过程。 产生特异性抗体的单克隆杂交瘤细胞株应立即扩大培养，以获得足够的细胞用于保存和生产可供应用的抗体。生产大量单克隆抗体的方法目前常用的有3种：小鼠腹水制备、大瓶培养和中空纤维反应器，前者多用于实验室制备，后二者适应于工厂化生产。
腹水制备：杂交骨髓瘤细胞在腹腔中定植，并产生大量腹水。选用与单克隆抗体制备所用相同的动物品系或者含有相同基因的Fl代杂交品系。杂交F1代品系更适合于腹水制备，如果用异源动物制备腹水时可选用无MHC限制性的裸鼠。用小鼠制备腹水时，先用矿物油或Pristane致敏，以抑制其免疫功能，利于腹水的形成。腹腔注射10—10个杂交瘤细胞，经过7—10 d后形成腹水。每只小鼠可获得3—5mL腹水，每mL含IgG抗体可达5—10mg。腹水中含有较多的杂蛋白和非特异性IgG，并且含有许多蛋白酶，易使抗体失活，因此腹水收集后应尽快纯化，以防止降解。
大瓶培养：采用1000mL或更大的摇瓶培养。大瓶培养上清体积大，但抗体浓度低，给抗体纯化带来很大困难，消耗人力和培养液，增加生产成本。
中空纤维反应器：是比较经济的单克隆抗体生产方法。该装置由具有半透膜性质的成束的微孔纤维组成，杂交瘤细胞位于纤维外部的小量培养液中，培养液在纤维的微孔中循环，供给营养和带走废物，抗体大分子和小分子化合物被隔开。高密度的杂交瘤细胞能在此系统中维持数月，每天可产生数百毫克的抗体，抗体浓度高，体积小易于纯化。
胎（小）牛血清一直是细胞培养所必须的，在单克隆抗体生产过程中培养液中的血清蛋白使抗体的纯化增加了困难，近年开发的无血清培养技术已逐渐用于单克隆抗体的生产中。 小鼠的单克隆抗体蛋白应用于人体后，作为抗原能引起人的免疫应答，大大降低其生物活性，并可能导致变态反应。因此人源单克隆抗体在临床治疗上有广泛应用前景，引起人们的普遍兴趣。但是人单克隆抗体制备存在许多技术上和伦理上的障碍，如人杂交瘤细胞系不稳定，有些抗原不能对人进行人工免疫，人B细胞只能从外周血中分离而无法从脾脏取得等。尽管如此，一些人源单克隆抗体已经获得，技术上也在逐步完善起来。
人的瘤细胞株U—266常用来与人外周血B细胞融合以获得人源单克隆抗体。另一些淋巴母细胞抹（LCL）则来源于EB病毒转化的淋巴细胞，如GMl500，W1—L2和ARH77等也用于杂交瘤细胞的制备。这些细胞系表现ED病毒核抗原（EBNA）阳性，且形成的杂交瘤细胞抗体的分泌水平不高。
获得人单克隆抗体的另一方法是用EBV直接转化某些抗体分泌细胞，使之成为“不死”的细胞在体外培养。EBV感染人B细胞后，病毒基因插入人B细胞基因组中，有1%的细胞转化为“不死”的细胞。B细胞转化可通过“病毒驱动”和“细胞驱动”两种方法获得。前者是将B细胞与分泌EBV的B95—8细胞系一同培养，后者则是与EBNA阳性的LCL细胞一同培养。“细胞驱动”转化的B细胞比较稳定，抗体分泌能力也较强。
人淋巴母细胞系和人杂交瘤细胞较难获得，人单克隆抗体也可以通过异源杂文的办法制备，即将EBV转化的B细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，将获得的异源杂交瘤细胞再与免疫后的B细胞融合，得到人单克隆抗体分泌细胞，不产生自身免疫球蛋白，EBVA也是阴性。 抗体的化学修饰：
抗体Fc段用双功能连接剂与荧光素，同位素，酶，发光化合物，稀土元素以及药物，毒素等连接后，并不影响其Fab功能区与特异性抗原结合。根据交联物的性质不同，标记的抗体可用作诊断试剂，也可作为药物的定向载体，引导药物或毒素到达抗原存在部位使药物或使毒素发挥更有效的作用，即俗称“生物导弹”。从而减少药物、毒素、同位素、酶在肿瘤治疗过程中引起严重的副作用，大大提高治疗肿瘤的效果。
许多毒素如蓖麻毒素，白喉毒素，天花粉，红豆毒素等均为蛋白质或糖蛋白，可用双功能剂与抗体相连；吗啡，前列腺素，氨甲喋吟，磷酸酯酶C等含有羧基能用碳二亚胺（EDC），混合酸酐法与抗体的氨基形成酰胺键；同样，含脂肪胺的药物如庆大雷素，阿霉素在水溶性EDC的作用下与抗体的羧基连接；而含芳香胺的药物则先在低温下与亚硝酸作用形成重氮化合物，再与抗体分子上的酪氨酸或组氨酸残基形成偶氮键。总之通过抗体的化学修饰把抗体的特异性用到定向给药和定位检测上。 抗体基因文库（antibody recombination library）是将不同的重链和轻链基因随机组合，克隆到合适的表达载体中，在原核细胞表达不同的抗体，形成一个抗体库，从这个抗体库中，用抗原可以筛选到相应的抗体基因。抗体基因来源于杂交瘤细胞或动物B细胞（免疫或未免疫）的DNA和mRNA。
用质粒作为抗体文库的载体，虽然也可能表达有活性的抗体分子或片段，但由线状噬菌体表达更为方便有效。M13、fd、F1等噬菌体的外壳蛋白由5种蛋白组成：pⅢ、pⅥ、pⅦ、pⅧ和pⅨ。每种含量不一，其中pⅧ含量最多，每个噬菌体有2700个pⅧ亚基，其余4种蛋白仅5个拷贝。增加噬菌体外壳蛋白的长度并不影响噬菌体的装配，抗体以融合蛋白的形式表达于噬菌体表面。噬菌体表达质粒常用的有fd－CAT1、fd－tet－DOG1、PHEN1、pComb3和pComb3H等。抗体融合蛋白构建多用pⅢ和pⅧ，pⅧ拷贝数高，低亲和力的抗体蛋白容易筛选出来。
在噬菌体表达抗体时，常常不表达完整的抗体分子，（因为CH2上不能进行糖基化）。根据不同的引物得到重链的VH或VHCH1区，轻链的VL或VLCL区。VL和VH两个片段用一短肽作连接片段，形成单链可变区（single－chain fragment variable，scFv）；VHCH1和VLCL两片段则形成Fab片段。另外，单独的VH和VL也能结合抗原，如果二者形成同源或异源二聚体（dAb），则稳定性和亲和性明显提高（图7—4）。此外在抗体片段DNA末端加上一些功能蛋白（如碱性磷酸酶和蛋白毒素）的基因，则表达的抗体就带有一定生物活性功能片段，可用于检测或治疗。如果在抗体基因末端加上终止子（TAG）则表达的抗体片段是可溶性的，而不是结合在噬菌体表面。
用特异性抗原免疫的动物B细胞构建抗体的噬菌体文库，抗体亲和性高，用与免疫抗原不同的抗原筛选得到的抗体亲和性普遍较低。可用模拟天然体细胞突变的方法来提高亲和力。如混杂重组法，即将己获得的轻链或重链的V片段切下，再克隆至随机的文库中的V区构成二级文库，使H链和L链混杂，可以使抗体片段的亲和性提高。利用PCR错配将随机突变引人至抗体的抗原结合区，也能提高对抗原的亲和力。先用低亲和力的载体在噬菌体的PⅧ表达，筛选后、将抗体基因片段PCR扩增转至PⅢ上表达，可获得高亲和力的抗体片段。
抗体基因文库有两个优点，一是从不适合进行人工免疫的物种获得单克隆抗体，如人源单克隆抗体；二是可快速方便获得单克隆抗体。 将鼠源抗体的V区基因与人源抗体C区基因重组，获得的嵌合抗体（chimericalantibody），可保留鼠抗体对抗原的高亲和性，又减弱鼠源抗体对人的免疫原性，提高治疗性抗体的效果。
重组的嵌合抗体基因转化骨髓瘤细胞或中国地鼠卵细胞（CH0），可在其中表达。为了进一步地消除鼠抗体V区框架区（FW）的异源性，可实行CDR移植（CDR grafting），以获得与鼠FW类似的人FW结构的嵌合抗体。
噬菌体表达的抗体仅含V区（scFv）或Fab片段，缺乏Fc区，使抗体的稳定性下降，半衰期缩短，与Fc受体结合功能也消失。因此在抗体功能片段的末端连接A蛋白、酶、细胞因子、CD4和毒素等分子，既可增加抗体片段的稳定性，又可发挥某些生物学活性功能。
用抗体基因工程方法获得的抗体与效应分子交联物比用化学交联法具有优点：可以大量生产，不会因修饰作用影响抗体及效应分子的活性，效应分子还可根据需要进行改造。
此外在抗体片段的末端连接一段特异的双亲性螺旋（amphiphilic helixes）结构，如亮氨酸拉链结构（leucine zipper），可使单价的scFv或Fab片段在体内或体外形成稳定的双分子聚合体，从而提高抗体片段的亲和力。此法也可用于制备双特异性抗体。 噬菌体表达的抗体片段常常是在原核细胞（E.coli）中完成。原核系统表达抗体片段产量
高，成本低，快速易于操作。但抗体片段在原核表达系统中不能进行CH2糖基化，从而影响抗体的活性。因此重组抗体基因片段可转移至适合的骨髓瘤细胞系或哺乳动物细胞系（如CHO），甚至于植物细胞中表达，可以得到与淋巴细胞表达相同的抗体分子。免疫球蛋白IgA的重链和轻链及分泌片基因可以分别转化不同的植株，将表达这些蛋白的植株进行有性杂交，在杂交后代中可以装配成完整的IgA双分子。以植物作为生物反应器进行抗体的表达已有许多成功的研究报道，与动物细胞相比更为经济，具有广泛的应用前景。 抗体酶是抗原决定簇处于转换态结构的抗体。因为转换态分子极不稳定无法制备抗体，所以催化性抗体的获得主要是通过设计稳定的转换态的类似物作为半抗原，与载体蛋白交联后，免疫动物，获得针对半抗原的抗体，从中筛选具有催化活性的抗体。筛选催化性单克隆抗体所用的ELISA与筛选一般抗体的方法不完全一样，应根据催化反应的特点而进行适当的修改。经典的方法是先筛选出与底物或半抗原结合的抗体，然后从中再筛选出有催化活力的抗体，这种方法费时费力。利用催化性抗体对底物的催化活性，对底物进行适当修饰，使催化反应的产物可直接表现抗体的催化活性，这样可以简化检测步骤。
转换态类似物半抗原的设计，必须了解催化反应的转换态模型的结构特点。催化抗体的抗原结合位点上与转换态互补的某些催化基团的形成，能稳定转换态分子。此外有人把单克隆抗体分子用化学修饰方法引入一些活性基团，提高催化性抗体的催化与亲和效率。应用噬菌体抗体文库也可以筛选催化性抗体，可省去制备转换态类似物的复杂过程，直接用底物从文库中筛选有催化活性的抗体片段。如用半抗原免疫后制备的文库或文库经过多次混杂重组，则可以得到更高的亲和力的催化性抗体。抗独特型抗体也用于催化性抗体的制备，用酶作为抗原免疫小鼠获得能够封闭酶活性位点的单克隆抗体，将这个抗体用蛋白酶除去Fc片段，用Fab免疫其他品系的小鼠或家兔，得到的抗体具有相应的酶催化活性。
从理论上看，B细胞具有全套免疫球蛋白的多样性的胚系基因，当然也包括有催化作用的自身抗体在内。然而1989年Paul W.首次报道了人体的一种能催化蛋白质水解的免疫球蛋白。它是—种自身抗体，能水解血管活性肠肽（vasoactive intenstinal peptide，VIP）的Glnl6—Met17键。用VIP作为抗原能得到有催化作用的单克隆抗体，也能催化Glnl6—Met17键。大约有17%的人有这种自身抗体酶，但患有气喘的病人中该抗体与VIP的亲和力比健康人高50倍。由于VIP是一种气管松弛剂，因此有人认为这种VIP自身抗体的长期作用可能与气喘的过敏应答有一定关系。由此推测除了人工设计催化抗体以及发现的自身催化抗体外，用筛选单抗的方法，也有可能找到所需要的催化抗体。

2. 单克隆抗体的制备过程中，检验阳性是什么意思

单抗的制备中，经筛选后的杂交瘤细胞产生的抗体是不一样的，其中有些是我们所需要的单克隆抗体，所以要把筛选后的杂交瘤细胞在多孔板上培养，每个小孔中只有一个细胞，然后用抗原去试，呈阳性的就是能产生特定抗体的杂交瘤细胞。

3. 什么是单克隆抗体有何特点及应用价值

分类：分子生物学知识 字号： 大大 中中 小小 1975年Kohler和Milstein首先报道，用细胞杂交技术，使经绵羊红细胞(SRBC)免疫的小鼠的脾细胞，与小鼠的骨髓瘤细胞融合，并由此创建了第一个B细胞杂交瘤细胞株，获得了抗SRBC的单克隆抗体。他俩首先创立了将能分泌特异性抗体的B淋巴细胞同无限繁殖的骨髓瘤细胞融合技术,为单克隆抗体的制备奠定了基础。这是免疫学，乃至医学史上的一个里程碑。

所谓的单克隆抗体是指由单一克隆杂交瘤细胞产生的只识别某一特定抗原表位的同源抗体。

单克隆抗体是经过人工制备的一类特殊抗体,它具有一般抗体的性质;它是B细胞增殖分化为浆细胞所产生的一类球蛋白,存在于体液中,具有免疫功能 ,介导体液免疫;它能与相应抗原(如病原体)特异性结合,在其他免疫分子和细胞的参入下发挥免疫效应.

单克隆抗体的本质是球蛋白,具有球蛋白的理化性质,空间结构和生物学活性.球蛋白对热和化学物质敏感,加热和加入化学试剂易破坏其结构,具有一定的半衰期.它和球蛋白一样具有可变区和恒定区,可变区结合抗原,形成抗原抗体复合物;恒定区有补体结合位点,介导补体发挥作用,形成攻膜复合物,杀伤变异的细胞.

单克隆抗体除了具有抗体的一般性质外,还具有其特殊性.它在结构和组成上高度均一,其类型抗原结合特异性和亲和力完全相同,易于体外大量制备和纯化,可以广泛的应用于医学和微生物学领域.单克隆抗体有小鼠免疫脾细胞(B细胞)和无限繁殖的骨髓瘤细胞融合在一起形成一个杂交瘤细胞.而这个杂交瘤细胞不仅具有无限繁殖的能力,还具有分泌抗体能力,因此在体外培养后,可无限的分泌抗体.

单克隆抗体的制备比较复杂,其中涉及多种生物学技术,在此简述其过程.用特定的抗原免疫纯系动物(如BALA--C小鼠),多次反复经背部皮下多点注射,每次注射应定量,也要注重接种的时间间隔,可适当的添加弗氏佐剂.经过一段时间的饲养后,选择血清抗体高的接种动物在无菌的情况下处死,取出脾脏剪碎,分离,离心取其悬浮细胞置入培养皿中,备用.在另取纯系小鼠的骨髓瘤细胞放进培养皿中,加入一些饲养细胞(如胸腺细胞,巨噬细胞)促使其生长,在该混合液中有多种细胞,为了提取目的细胞--杂交瘤细胞,必须进行HAT选择,培养获得纯代杂交瘤细胞.在众多的杂交瘤细胞中,有的不表达免疫球蛋白,有的表达其他类型的球蛋白,因此,要用特异性的检测方法从众多的细胞中筛选出阳性杂交瘤细胞.将目的细胞分离成单个细胞让其克隆化形成细胞株,再转移至其他培养基中扩大培养.为了大量的获得抗体,还需要经过小鼠腹腔接种,然后从腹水中分离提纯抗体.

单克隆抗体的分离,提纯,检验.将体外扩大培养液或者小鼠腹腔接种的腹水装入离心管中置于离心机上高速离心,取其上清液置于玻片上,加入相应的抗原,看是否有凝聚现象.

单克隆抗体问世后取得了辉煌的成就,如应用白喉外毒素单克隆抗体治疗白喉棒状杆菌;应用抗内毒素类脂A的单克隆抗体治疗G~菌败血症等.单克隆技术也因此获得了1984年的诺贝尔医学奖.它的主要作用是:用单克隆抗体代替多克隆抗体克服了交叉反应,提高了免疫学实验的特异性和敏感性,从而促进了医学检验学的发展;用单克隆作亲和柱,可分离提纯含量极底的可溶性的抗原,如激素,细胞因子和难以纯化的肿瘤抗原等;为物质提纯开辟了一条新途径;制备的单克隆抗体识别细胞表面特异性受体,若将抗肿瘤药物(如毒素或放射性物质)偶连到其上,构建生物导弹,有望攻克人类顽疾--肿瘤.

单克隆抗体有广阔的发展前景,但有其局限性.单克隆抗体作为外源性的抗原,多次反复的注射后能促使机体发生免疫应答,产生相应的抗抗体,产生排斥现象,因此单克隆抗体应用于临床有其风险性,在紧急预防的情况下,可以慎用.

总之,单克隆抗体为人类在检验疾病,治疗疾病方面取得了重大突破,尽管它还有些弊端,相信在不久的将来人类会制备出更加优良的单克隆抗体,为攻克肿瘤作出更大的贡献!

单克隆抗体的特点是：理化性状高度均一、生物活性单一、与抗原结合的特异性强、便于人为处理和质量控制，并且来源容易。这些优点使它一问世就受到高度重视，并广泛应用于生物学和医学研究领域。

1 作为亲合层析的配体

单克隆抗体能与其相应的抗原特异性结合，因而能够从复杂系统中识别出单个成分。只要得到针对某一成分的单克隆抗体，利用它作为配体，固定在层析柱上，通过亲合层析，即可从复杂的混和物中分离、纯化这一特定成分。如用抗人绒毛膜促性腺激素(hCG)亲合层析柱，就可从孕妇尿中提取到纯的hCG。与其它提取方法(沉淀法、高效疏水色谱法等)相比，具有简便、快速、经济、产品活性高等优点。

2 作为生物治疗的导向武器

脂质体是由既亲水又亲油的两亲磷脂组成的连续双分子层微囊，内含水相空间，可包裹水溶性物质。包有细胞毒剂的脂质体膜上偶联抗体，可定向攻击靶细胞，称为免疫脂质体。这种“导向治疗”，在动物试验与体外试验中已获得满意效果。如热敏免疫脂质体，由抗人乳癌细胞抗体经疏水长链脂肪酸修饰，抗体带上长的疏水碳链，部分插入脂质体的脂双层膜中，抗体Fab段仍暴露在膜表面，因而保持了抗体活性。热敏免疫脂质体可特异识别靶细胞(人乳癌细胞)，并通过相变温度引起脂质体破裂，从而定向释放药物。另外，可将化疗药物、细菌毒素、植物毒素或放射性同位素等细胞毒剂与抗肿瘤抗原的单克隆抗体直接交联，利用其导向作用，使细胞毒剂定位于肿瘤细胞把它直接杀伤。这不仅提高了抗体的疗效，也可降低细胞毒剂对正常细胞的毒性反应。如应用抗T细胞单抗和柔红霉素结合物，在体外对非T淋巴细胞就无杀伤作用。但是，要把这种方法应用于临床，目前还存在不少技术难关，包括人体对鼠源单抗的排异问题等。

3 作为免疫抑制剂

抗人T淋巴细胞单抗(McAb)作为一种新型免疫抑制剂，已广泛应用于临床治疗自身免疫疾病和抗器官移植的排斥反应。其作用机理有赖于McAb的种类及其免疫学特性。注射抗小鼠Thy-1抗原的单抗，可以抑制小鼠同种皮肤移植的排斥反应。此外，对用于同种骨髓移植的供体骨髓，在体外经抗T细胞单抗加补体处理，能减轻移植物抗宿主病的发生。

4 作为研究工作中的探针

单克隆抗体只与抗原分子上某一个表位(即抗原决定簇)相结合，利用这一特性就可把它作为研究工作中的探针。此时，可以从分子、细胞和器官的不同水平上，研究抗原物质的结构与功能的关系，进而并可从理论上阐明其机理。如用荧光物质标记单抗作为探针，能方便地确定与其结合的相应生物大分子(蛋白质、核酸、酶等)在细胞中的位置和分布。

5 增强抗原的免疫原性

抗体对抗原免疫原性的增强作用由来已久，60年代就已发现幼猪对破伤风类毒素难以产生抗体，注射相应特异性抗体IgG，就能有效地提高对委内瑞拉马脑炎病毒的免疫应答。1984年以来，Celis等发现，抗乙肝病毒(HBs)IgG可增强HBs抗原对特异性人T细胞克隆的刺激增殖，并可诱生干扰素。在小鼠中发现，当低剂量的HBs抗原不产生免疫反应时，加入抗HBs抗体组成的复合物，则可有效地诱生免疫反应。根据这一作用，现已研制出乙肝的抗原—抗体复合物型治疗性疫苗。

6 作为医学检验试剂

单克隆抗体作为医学检验试剂，更能充分发挥其优势。单克隆抗体的特异性强，大大提高了抗原—抗体反应的特异性，减少了和其它物质发生交叉反应的可能性，使试验结果可信度更大。单抗的均一性和生物活性的单一性，使抗原—抗体区应结果便于控制，利于标准化和规范化。目前已有许多检验试剂盒用单抗制成，其主要用途如下：

(1)诊断各类病原体

这是单抗应用最多的领域，已有大量诊断试剂商品供选择。如用于诊断乙肝病毒、丙肝病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒和各种微生物、寄生虫感染的试剂等。单抗所具有的灵敏度高、特异性好的特点，使其在鉴别菌种的型及亚型、病毒变异株，以及寄生虫不同生活周期的抗原性等方面更具独特优势。

(2)肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原的检测

用于肿瘤的诊断、分型及定位。尽管目前尚未制备出肿瘤特异性抗原的单抗，但对肿瘤相关抗原(如甲胎蛋白、肿瘤碱性蛋白和癌胚抗原)的单抗早就用于临床检验。

随着淋巴细胞杂交瘤技术的应用，许多抗人肿瘤标记物的杂交瘤细胞株已经建立，这为肿瘤的早期诊断及其阐明肿瘤的发生、发展，了解肿瘤细胞的生物学活性及其定量研究奠定了基础。用抗肿瘤单抗检查病理标本，可协助确定转移肿瘤的原发部位。以放射性核素标记单抗可用于体内诊断，再结合X-线断层扫描技术，可对肿瘤的大小及其转移灶作出定量诊断。

(3)检测淋巴细胞表面标志

用于区分细胞亚群和细胞的分化阶段。例如检测CD系列标志，有利于了解细胞的分化和T细胞亚群的数量和质量变化，这对多种疾病诊断具有参考意义。细胞表面抗原的检测，将对白血病患者的疾病分期、治疗效果、预后判断等方面有指导作用。组织相容性抗原检测是移植免疫学的重要内容，应用单抗对其进行位点检测可得到更可信的结果。

(4)机体微量成分的测定

应用单抗结合其它技术，可对机体的多种微量成分进行测定。如放射免疫分析，即是利用了同位素的灵敏性和抗原-抗体反应的特异性而建立起来的方法，它可以测至10-9～10-12g，使原来难以测定的激素能够进行定量分析。除了激素，还可检测诸多酶类、维生素、药物和其它生化物质。这对受检者健康状态判断、疾病检出、指导诊断和临床治疗均具有实际意义。

综上所述，单克隆抗体在理论和实践上的应用成为解决生物学和医学等许多重大问题的重要手段。但是，上述应用的单抗属于鼠源性，用于人类疾病的预防和治疗时会产生异种蛋白变态反应，大大限制了其临床应用价值。而且，鼠源性抗体在人体内半衰期缩短，生物活性降低。因此，人们一直致力于人源性抗体的研究，如用人脾细胞与鼠骨髓瘤细胞杂交；用EB病毒转化人的B淋巴细胞；用基因工程法制备嵌合抗体等。但都遇到相当的困难。以分子生物学技术提取、扩增编码人抗体的DNA，构建质粒，建立组合抗体文库，再利用供者文库建立针对某一特定抗原的子文库是近年来形成的最新方法。以该技术制备的抗体片段(Fab)是人源抗体，具有建库简单、抗体表达稳定等特点。迄今已有多种抗体产生。可以预见，该技术具有良好的发展和应用前景。

单克隆抗体综述

一、抗体的定义和第一代单克隆抗体（经杂交瘤细胞生产）

抗体是在对抗原刺激的免疫应答中，B淋巴细胞产生的一类糖蛋白。它是能与相应抗原特异的结合、产生各种免疫效应（生理效应）的球蛋白。国际卫生组织将具有抗体活性及化学结构与抗体相似的一类蛋白统一命名为免疫球蛋白，它与抗体都是指同一类蛋白质。70000之间，称为“重链”（H链）。轻、重链之间和两重链之间由二硫桥连接，这样的四链结构（L2H2）组成一个免疫球蛋白分子。550个氨基酸残基，相对分子质量在55000;抗体的基本结构如图所示，由四条肽链组成，其中两条相对分子质量较低的肽链约含210个氨基酸残基，相对分子质量约24000，称为“轻链”（L链）；另两条相对分子量较高的肽链约含450，其相应的抗体分别命名为IgG、IgM、IgA、IgE和IgD。以重链抗原性差异来进行抗体的血清学分类：用分离纯化的各种重链免疫动物获得相应的抗血清，再通过免疫交叉反应等血清学检测方法，分析其结构的异同，反复的验证，最后发现人类有5类不同的重链，分别为）与多种细胞结合，(5)可能造成免疫损伤。IgG占成人血清中抗体总量的75%以上，是人类血清中主要的一类抗体，由B细胞产生，其功能结构也是研究最清楚的。它主要的生理功能有：(1)中和毒素和病毒，(2)凝集和沉淀抗原，(3)激活补体，(4)通过特异的膜受体（Fc单克隆抗体技术的应用是现代生物科学领域中的重要进展之一。单克隆抗（Monoclonalantibody，简称McAb）具有广泛的应用价值，它为生物学和医学等自然科学的研究开辟了新的途经。

二、 第二代单克隆抗体：经过基因重组的嵌合或人源化单克隆抗体

嵌合抗体：指用人的恒定区取代小鼠的恒定区，保留鼠单抗的可变区序列，形成一个人-鼠杂合的抗体。其研制程序快，可大幅度降低异源抗体的免疫原性，却几乎保持亲本鼠单抗全部的特异性和亲和力。另外，它还具有人抗体的效应功能，如补体固定、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用（ADCC）等。嵌合抗体成功的例子有：

Rituxan：Idec Pharmaceutical/Genentech的小鼠抗CD20抗体，含人IgG1κ恒定区，用于治疗B淋巴瘤。它的抗淋巴瘤作用主要可能来自于补体作用、ADCC和诱导肿瘤细胞凋亡。

Remicade：Centocor公司的抗TNF-α抗体，用于治疗风湿性关节炎和节段性回肠炎。

Simulect: Novartis公司的抗CD25抗体，用于抗移植排斥。

Erbitux：美国Imclone公司的抗EGFR（Her-1）单克隆抗体，目前FDA已批准其用于治疗结直肠癌。

人源化抗体：利用现有的无数已详细分析过的小鼠抗体，取其与抗原直接接触的那段抗体片段（互补决定区，CDR）与人的抗体框架嫁接，经亲和力重塑，可维持其特异性和大部分的亲和力，同时几乎去除免疫原性和毒副作用。

成功的例子：

Herceptin：Genentech公司的抗HER2/neu抗体，用于治疗乳腺癌。

Synsgis：Medimmune公司的抗F抗体，用于治疗呼吸道病毒感染。

Zenapax：Protein Design Labs（PDL）/Roche的抗CD25抗体，用于抗移植排斥。

h-R3：古巴分子免疫学中心的抗EGFR（Her-1）单克隆抗体，用于治疗头颈癌。

三、 噬菌体展示抗体和全人抗体

（1）噬菌体显示技术制备人源性抗体

基于噬菌体可把抗体片段表达在外膜的能力而建立一系列的抗体文库，然后用目的抗原来筛选文库中相应的抗体片段，再经体外加工可形成有功能的完全人抗体。用此方法可制备针对简单或复杂抗原的单抗，并得到中等亲和力的抗体，但该方法需用高通量筛选。现有一些已进入临床II/III期研究，如Cambridge Antibody Technology（CAT）的D2E7和CAT-152，分别用于治疗风湿性关节炎和青光眼。D2E7是抗TNF-α单抗，现正由Abbott Laboratories开发。从其2002年6月份提供的临床III期数据看，有望于近期进入市场。

（2）转基因动物制备人源性抗体

抗体衍生物：有的研究者正在开发更容易生产和使用的单抗衍生物，最成功者当属宾夕法尼亚大学的Mark Greene。他在寻找抗体互补决定区CDR衍生的多肽小分子[16]，并成立了CDR Therapeutics（现属Xcyte Therapies）以加速其多肽生产的商业化。他的多肽有亲本单抗的亲和力和选择性，但作为小分子，多肽应无免疫原性，且更容易制备。

4. 单克隆抗体技术的程序

(1) 抗原制备。制备单克隆抗体的免疫抗原，从纯度上说虽不要求很高，但高纯度的抗原使得到所需单抗的机会增加，同时可以减轻筛选的工作量。因此，免疫抗原是越纯越好，应 根据所研究的抗原和实验室的条件来决定。一般来说，抗原的来源有限，或性质不稳定，提纯时易变性，或其免疫原性很强，或所需单抗是用于抗原不同组分的纯化 或分析等，免疫用的抗原只需初步提纯甚至不提纯，但抗原中混杂物很多，特别是如果这些混杂物的免疫原性较强时，则必须对抗原进行纯化。检测用抗原可以是与 免疫抗原纯度相同，也可是不同的纯度，这主要决定于所用筛检方法的种类及其特异性和敏感性。
(2) 免疫动物的选择。根据所用的骨髓瘤细胞可选用小鼠和大鼠作为免疫动物。因为，所有的供杂交瘤技术用的小鼠骨髓瘤细胞系均来源于BALB/c小鼠，所有的大鼠骨髓瘤细胞都来 源于LOU/c大鼠，所以一般的杂交瘤生产都是用这两种纯系动物作为免疫动物。但是，有时为了特殊目的而需进行种间杂交，则可免疫其他动物。种间杂交瘤一 般分泌抗体的能力不稳定，因为染色体容易丢失。就小鼠而言，初次免疫时以8-12周龄为宜，雌性鼠较便于操作。
(3) 免疫程序的确定。免疫是单抗制备过程中的重要环节之一，其目的在于使B淋巴细胞在特异抗原刺激下分化、增殖，以利于细胞融合形成杂交细胞，并增加获得分泌特异性抗体的杂交 瘤的机会。因此在设计免疫程序时，应考虑到抗原的性质和纯度、抗原量、免疫途径、免疫次数与间隔时间、佐剂的应用及动物对该抗原的应答能力等。没有一个免 疫程序能适用于各种抗原。现用的免疫程序中多数是参照制备常规多克隆抗体的方法。表6-1列举了目前常用的免疫程序。免疫途径常用体内免疫法包括皮下注 射、腹腔或静脉注射，也采用足垫、皮内、滴鼻或点眼。最后一次加强免疫多采用腹腔或静脉注射，目前尤其推崇后者，因为可使抗原对脾细胞作用更迅速而充分。 在最后一次加强免疫后第3天取脾融合为好，许多实验室的结果表明，初次免疫和再次免疫应答反应中，取脾细胞与骨髓瘤细胞融合，特异性杂交瘤的形成高峰分别为第4天和第22天，在初次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌IgM抗体，再次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌IgG抗 体。笔者体会阳性杂交瘤出现的高峰与小鼠血清抗体的滴度并无明显的平行关系，且多在血清抗体高峰之前。因此，为达到最高的杂交瘤形成率需要有尽可能多的浆 母细胞，这在最后一次加强免疫后第3天取脾进行融合较适宜。已有人报道采用脾内免疫，可提高小鼠对抗原的免疫反应性，且节省时间，一般免疫3天后即可融合。 （1）杂交瘤细胞的冻存。在建立杂交瘤细胞的过程中，有时一次融合产生很多“阳性”孔，来不及对所有的杂交瘤细胞作进一步的工作，需要把其中一部分细胞冻存起来；另一方面，为了防 止实验室可能发生的意外事故，如停电、污染、培养箱的温度或CO2控制器失灵等给正在建立中的杂交瘤带来灾难，通常尽可能早地冻存一部分细胞作为种子，以 免遭到不测。在杂交瘤细胞建立以后，更需要冻存一大批，以备今后随时取用。
（2）杂交瘤细胞的复苏。杂交瘤细胞、骨髓瘤细胞或其他细胞在液氮中保存，若无意外情况时，可保存数年至数十年。复苏时融解细胞速度要快，使之迅速通过最易受损的-5℃—0℃，以防细胞内形成冰晶引起细胞死亡。 ⑴ 单克隆性的确定 包括杂交瘤细胞的染色体分析、单抗免疫球蛋白重链和轻链类型的鉴定和单抗纯度鉴定等。
⑵ 单抗理化特性的鉴定。从实用意义上说，单抗对温度和PH变化的敏感性以及单抗的亲合力都是理化特性鉴定的主要项目，它们可为单抗的使用和保存提供重要依据。
⑶ 单抗与相应抗原的反应性测定。单抗与相应抗原的反应性决定于它所识别的抗原表位，确定单抗针对的表位在抗原结构上的位置，是单抗特性鉴定的关键环节，同时，进一步分析这类表位的差别， 可正确评价单抗的特异性和交叉反应性。