细菌常用的保存方法及优缺点

A. 菌种保藏

菌种保藏方法大全

基本原理
微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。

低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。

保藏方法大致可分为以下几种：

1．传代培养保藏法

又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4—6℃冰箱内保存。

2．液体石蜡覆盖保藏法

是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。

3．载体保藏法

是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。
4．寄主保藏法

用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法与冷冻干燥保藏法进行保藏。

5．冷冻保藏法

可分低温冰箱（-20—-30℃，-50—-80℃）、干冰酒精快速冻结（约-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。

6．冷冻干燥保藏法

先使微生物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥）。

有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。

三、器材

细菌、酵母菌，放线菌和霉菌；

肉膏蛋白胨斜面培养基，灭菌脱脂牛乳，灭菌水，化学纯的液体石蜡，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黄土或红土，冰块、食盐，干冰，95％酒精，10％盐酸，无水氯化钙；

灭菌吸管，灭菌滴管，灭菌培养皿，管形安瓿管，泪滴形安瓿管（长颈球形底），40目与 100目筛子，油纸，滤纸条（0．5×1．2cm），干燥器，真空泵，真空压力表，喷灯，L形五通管，冰箱，低温冰箱（-30℃），液氮冷冻保藏器。
四、操作步骤、各保藏法的应用范围及优缺点

下列各法可根据实验室具体条件与需要选做。

1．斜面低温保藏法

将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至2—8℃的冰箱中保藏。

保藏时间依微生物的种类而有不同，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2—4个月，移种一次。酵母菌两个月，细菌最好每月移种一次。

此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法，优点是操作简单，使用方便，不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。缺点是容易变异，因为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的，屡次传代会使微生物的代谢改变，而影响微生物的性状；污染杂菌的机会亦较多。
2．液体石蜡保藏法

（1）将液体石蜡分装于三角烧瓶内，塞上棉塞，并用牛皮纸包扎，1．05kg/cm2>，121．3℃灭菌30分钟，然后放在40℃温箱中，使水汽蒸发掉，备用。

（2）将需要保藏的菌种，在最适宜的斜面培养基中培养，使得到健壮的菌体或孢子。

（3）用灭菌吸管吸取灭菌的液体石蜡，注入已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1cm为准（图Ⅶ-12），使菌种与空气隔绝。

（4）将试管直立，置低温或室温下保存（有的微生物在室温下比冰箱中保存的时间还要长）。
此法实用而效果好。霉菌、放线菌、芽孢细菌可保藏2年以上不死，酵母菌可保藏1—2年，一般无芽孢细菌也可保藏1年左右，甚至用一般方法很难保藏的脑膜炎球菌，在37℃温箱内，亦可保藏3个月之久。此法的优点是制作简单，不需特殊设备，且不需经常移种。缺点是保存时必须直立放置，所占位置较大，同时也不便携带。从液体石蜡下面取培养物移种后，接种环在火焰上烧灼时，培养物容易与残留的液体石蜡一起飞溅，应特别注意。
3．滤纸保藏法

（1）将滤纸剪成0．5×1．2cm的小条，装入0．6×8cm的安瓿管中，每管1—2张，塞以棉塞，1．05kg/cm2>，121．3℃灭菌30分钟。

（2）将需要保存的菌种，在适宜的斜面培养基上培养，使充分生长。

（3）取灭菌脱脂牛乳1—2ml滴加在灭菌培养皿或试管内，取数环菌苔在牛乳内混匀，制成浓悬液。

（4）用灭菌镊子自安瓿管取滤纸条浸入菌悬液内，使其吸饱，再放回至安瓿管中，塞上棉塞。

（5）将安瓿管放入内有五氧化二磷作吸水剂的干燥器中，用真空泵抽气至干。

（6）将棉花塞入管内，用火焰按图Ⅶ-13熔封，保存于低温下。

（7）需要使用菌种，复活培养时，可将安瓿管口在火焰上烧热，滴一滴冷水在烧热的部位，使玻璃破裂，再用镊子敲掉口端的玻璃，待安瓿管开启后，取出滤纸，放入液体培养基内，置温箱中培养。
细菌、酵母菌、丝状真菌均可用此法保藏，前两者可保藏2年左右，有些丝状真菌甚至可保藏14—17年之久。此法较液氮、冷冻干燥法简便，不需要特殊设备。

4．沙土保藏法

（1）取河沙加入10％稀盐酸，加热煮沸30分钟，以去除其中的有机质。

（2）倒去酸水，用自来水冲洗至中性。

（3）烘干，用40目筛子过筛，以去掉粗颗粒，备用。

（4）另取非耕作层的不含腐植质的瘦黄土或红土，加自来水浸泡洗涤数次，直至中性。

（5）烘干，碾碎，通过100目筛子过筛，以去除粗颗粒。

（6）按一份黄土、三份沙的比例（或根据需要而用其他比例，甚至可全部用沙或全部用土）掺合均匀，装入10×100mm的小试管或安瓿管中，每管装1g左右，塞上棉塞，进行灭菌，烘干。

（7）抽样进行无菌检查，每10支沙土管抽一支，将沙土倒入肉汤培养基中，37℃培养48小时，若仍有杂菌，则需全部重新灭菌，再作无菌试验，直至证明无菌，方可备用。

（8）选择培养成熟的（一般指孢子层生长丰满的，营养细胞用此法效果不好）优良菌种，以无菌水洗下，制成孢子悬液。

（9）于每支沙土管中加入约0．5ml（一般以刚刚使沙土润湿为宜）孢子悬液，以接种针拌匀。

（10）放入真空干燥器内，用真空泵抽干水分，抽干时间越短越好，务使在12小时内抽干。

（11）每10支抽取一支，用接种环取出少数沙粒，接种于斜面培养基上，进行培养，观察生长情况和有无杂菌生长，如出现杂菌或菌落数很少或根本不长，则说明制作的沙土管有问题，尚须进一步抽样检查。

（12）若经检查没有问题，用火焰熔封管口，放冰箱或室内干燥处保存。每半年检查一次活力和杂菌情况。

（13）需要使用菌种，复活培养时，取沙土少许移入液体培养基内，置温箱中培养。

此法多用于能产生孢子的微生物如霉菌、放线菌，因此在抗生素工业生产中应用最广，效果亦好，可保存2年左右，但应用于营养细胞效果不佳。
5．液氮冷冻保藏法

（1）准备安瓿管用于液氮保藏的安瓿管，要求能耐受温度突然变化而不致破裂，因此，需要采用硼硅酸盐玻璃制造的安瓿管，安瓿管的大小通常使用75×10mm的，或能容1．2mm液体的。

（2）加保护剂与灭菌保存细菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的细胞时，则将空安瓿管塞上棉塞，1．05kg/cm2，121．3℃灭菌15分钟：若作保存霉菌菌丝体用则需在安瓿管内预先加入保护剂如10％的甘油蒸馏水溶液或10％二甲亚砜蒸馏水溶液，加入量以能浸没以后加入的菌落圆块为限，而后再用1．05kg/cm2>，121．3℃灭菌15分钟。

（3）接入菌种将菌种用10％的甘油蒸馏水溶液制成菌悬液，装入已灭菌的安瓿管；霉菌菌丝体则可用灭菌打孔器，从平板内切取菌落圆块，放入含有保护剂的安瓿管内，然后用火焰熔封。浸入水中检查有无漏洞。

（4）冻结再将已封口的安瓿管以每分钟下降1℃的慢速冻结至-30℃。若细胞急剧冷冻，则在细胞内会形成冰的结晶，因而降低存活率。
（5）保藏经冻结至-30℃的安瓿管立即放入液氮冷冻保藏器（图Ⅶ-14）的小圆筒内，然后再将小圆筒放入液氮保藏器内。液氮保藏器内的气相为-150℃，液态氮内为-196℃。

（6）恢复培养保藏的菌种需要用时，将安瓿管取出，立即放入38—40℃的水浴中进行急剧解冻，直到全部融化为止。再打开安瓿管，将内容物移入适宜的培养基上培养。

此法除适宜于一般微生物的保藏外，对一些用冷冻干燥法都难以保存的微生物如支原体、衣原体、氢细菌、难以形成孢子的霉菌、噬菌体及动物细胞均可长期保藏，而且性状不变异。缺点是需要特殊设备。

6．冷冻干燥保藏法

（1）准备安瓿管用于冷冻干燥菌种保藏的安瓿管宜采用中性玻璃制造，形状可用长颈球形底的，亦称泪滴型安瓿管（图Ⅶ-15），大小要求外径6—7．5mm，长105mm，球部直径9—11mm，壁厚0．6—1．2mm。也可用没有球部的管状安瓿管。塞好棉塞，1．05kg/cm2>，121．3℃灭菌30分钟，备用。

（2）准备菌种，用冷冻干燥法保藏的菌种，其保藏期可达数年至十数年，为了在许多年后不出差错，故所用菌种要特别注意其纯度，即不能有杂菌污染，然后在最适培养基中用最适温度培养，使培养出良好的培养物。细菌和酵母的菌龄要求超过对数生长期，若用对数生长期的菌种进行保藏，其存活率反而降低。一般，细菌要求24—48小时的培养物；酵母需培养3天；形成孢子的微生物则宜保存孢子；放线菌与丝状真菌则培养7—10天。

（3）制备菌悬液与分装以细菌斜面为例，用脱脂牛乳2ml左右加入斜面试管中，制成浓菌液，每支安瓿管分装0．2ml。
（4）冷冻冷冻干燥器有成套的装置出售，价值昂贵，此处介绍的是简易方法与装置，可达到同样的目的。

将分装好的安瓿管放低温冰箱中冷冻，无低温冰箱可用冷冻剂如干冰（固体CO2>）酒精液或干冰丙酮液，温度可达-70℃。将安瓿管插入冷冻剂，只需冷冻4—5分钟，即可使悬液结冰。

（5）真空干燥为在真空干燥时使样品保持冻结状态，需准备冷冻槽，槽内放碎冰块与食盐，混合均匀，可冷至-15℃。装置仪器如图Ⅶ-16，安瓿管放入冷冻槽中的干燥瓶内。

抽气一般若在30分钟内能达到93．3Pa（0．7mmHg）真空度时，则干燥物不致熔化，以后再继续抽气，几小时内，肉眼可观察到被干燥物已趋干燥，一般抽到真空度26．7Pa（0．2mmHg），保持压力6—8小时即可。

（6）封口抽真空干燥后，取出安瓿管，接在封口用的玻璃管上，可用L形五通管（图Ⅶ-17）继续抽气，约10分钟即可达到26．7Pa（0．2mmHg）。于真空状态下，以煤气喷灯的细火焰在安瓿管颈中央进行封口。封口以后，保存于冰箱或室温暗处。

此法为菌种保藏方法中最有效的方法之一，对一般生活力强的微生物及其孢子以及无芽胞菌都适用，即使对一些很难保存的致病菌，如脑膜炎球菌与淋病球菌等亦能保存。适用于菌种长期保存，一般可保存数年至十余年，但设备和操作都比较复杂。

B. 常用的灭菌方法有哪些，各有哪些优缺点

（1）加热灭菌法

利用高温来杀死微生物（超过最高生长温度）的方法。加热灭菌的原理：当高温作用于微生物时，首先引起细胞内生理生化反应速率加快，机体内对温度敏感的物质如蛋白质、核酸等，随着温度的增高而遭受不可逆的破坏，尽而导致细胞内原生质体的变化、酶结构的破坏，从而使细胞失去了生活机能上的协调，停止了生长发育。随着高温的继续作用，细胞内原生质便发生凝固，酶结构完全破坏，活动消失，生化反应停止，渗透交换等新陈代谢活动消失，细胞死亡。加热灭菌可分干热灭菌和湿热灭菌两大类。

1）干热灭菌 利用灼烧或干热空气灭菌而没有饱和水蒸气参加的灭菌法称为干热灭菌法。由于干热灭菌使用方便，方法简单，故在生产上广泛应用。如火焰灭菌法：直接利用火焰把微生物烧死，故又称焚烧灭菌法。采用此法灭菌既彻底又迅速，但只适用于金属制的接种工具、试管口及污染物品等的处理。热空气灭菌法：即在电热恒温干燥箱中利用干热空气来灭菌。

2）湿热灭菌 即利用蒸汽进行灭菌的方法。湿热灭菌又分为高压、常压、间歇灭菌和巴氏灭菌4种。

①高压蒸汽灭菌 由于高压蒸汽具有较强的穿透力和较常压高的温度，能大大缩短灭菌时间，提高工作效率，加之蛋白质在湿热条件下容易变性，在热蒸汽条件下，细菌的芽孢在120℃，经20～30分钟可全部被杀死。如灭菌材料体积较大，不易被穿透时，可将压力增加到0.152兆帕，延长至1～2小时。在高压蒸汽灭菌中，灭菌温度随蒸汽压力的增加而升高（图2-6）。

图2-7 简易常压灭菌法

③常压间歇蒸汽灭菌法 这是利用常压蒸汽反复几次灭菌的方法。具体做法是将待灭菌物品放在锅内，100℃处理1小时左右，杀死微生物的营养细胞，让其冷却至30℃左右，此时芽胞会萌发，再以同样方法加热处理，反复3次，可达到灭菌目的。该方法可用于不耐高温的药品、营养物、特殊培养基的灭菌。

④低温巴氏灭菌法 即在60～70℃下，经一定时间，杀死有害微生物的方法。适应于不耐高温的物品消毒。有些培养基，在高温下遭到破坏，用此法既可杀死致病微生物的营养体，又能使培养基的成分不致受到严重破坏。食用菌生产中培养料堆积发酵工艺，就是利用这个原理杀死其中的病虫、杂菌。

（2）过滤除菌法

又分液体过滤和空气过滤两种，就是采用机械的方法，设计一种滤孔比细菌还小的筛子，做成各种过滤器，通过机械过滤，只让液体培养基或空气从筛孔流出，各种微生物菌体则留在筛子上，从而达到除菌的目的。这种方法适用于对热不稳定的体积小的液体培养基（如动物血清、蛋白质、酶、维生素等）及气体的灭菌。超净工作台的工作原理就是将带菌空气通过过滤灭菌形成无菌空气，从风洞中吹出，来造成工作台范围的无菌状态。过滤灭菌的最大优点是不破坏培养基中各种物质的化学成分。常用的过滤器有用硅藻土制的、石棉制的、陶瓷土制的，也有用火棉胶、硝化纤维素滤膜制成的。

（3）辐射灭菌法

利用辐射产生的能量进行杀菌的方法称辐射灭菌。辐射可分电离辐射和非电离辐射两种，α-射线、β-射线、γ-射线、X-射线、中子和质子、微波等属电离辐射，紫外线、臭氧、日光为非电离辐射。

1）紫外线灭菌 紫外线杀菌的原理是利用紫外线的辐射作用。用灯管直接照射细菌使其发生光化学反应，将细菌细胞质诱导形成胸腺嘧啶双聚体，从而抑制DNA的复制而发生变性、致死。另一方面，空气在紫外线照射下产生的臭氧（O₃），也具有一定的杀菌作用。紫外线的有效作用距离为1.2～2.0米。紫外灯一般悬吊在接种室或培养室的上方，个数依房间大小而定，容1～2个人操作的接种室，安装一个30瓦的紫外灯就可以了。在每次接种前，应将所需的器具一起放入接种室（箱）内，然后打开紫外灯照射。如果接种室体积较大，开灯照射2小时才能达到灭菌效果；如果较小，只需开灯半小时左右既可达到灭菌效果。由于紫外线穿透力弱，即使是普通玻璃也不能滤过，因此，只适于空气或物体表面的灭菌。紫外线对人体皮肤，尤其是眼睛有杀伤作用，应避免直视，工作时应将紫外灯关闭。紫外线消毒时工作场所如果处在稍暗无光的情况下，能提高杀菌效果。细菌接受致死量紫外线照射后，随即给予可见光照射，部分细菌有复活的可能。干细胞比湿细胞对紫外线的抗性强，孢子比其营养细胞对紫外线更具抗性。

2）微波灭菌 由于微生物的细胞中都含有70%～90%的水分，水分子在微波电场中被极化，并随着电场方向的改变而转动，在转动过程中分子之间高速度摩擦产生热能，这种热能不同于外部加热，可在短时间里使细胞爆破而物体本身的温度却只有极微增加，从而达到灭菌效果。用YM7601型微波炉只需60秒钟就能杀死食品中192万个大肠杆菌。

3）臭氧发生器消毒 臭氧（O₃）具有强烈的氧化作用，能破坏微生物的细胞膜与核酸。O₃也是一种暂态物质，常温下能自然分解，还原成氧。其灭菌原理实际上和紫外线消毒极相似。

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D. 1组织培养常用的灭菌方法各有哪些优缺点

1、比如能发生质壁分离及复原
2、培养基用湿热灭菌，原理是在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在0.1mpa的压力下，锅内温度达121℃。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。
采用干热灭菌，由于在干热条件下，细菌的营养细胞的抗热性大为提高，接近芽孢的抗热水平，通常采用170℃持续90分钟来灭菌。
不耐热的物质采用过滤灭菌，一些化学成分在高温高压下回发生降解而失去效能或降低效能。
植物材料表面用消毒剂灭菌