组织分离法中哪种方法最常用

A. 食用菌制种技术的分离与培养

食用菌菌种分离方法有四种，即组织分离法、孢子分离法、耳木分离法和土中菌丝分离法。
（一）组织分离法
组织分离法是利用子实体内部组织来获得纯菌种的方法，根据不同的分离材料大体可分为三种。
1、子实体组织分离
①、种菇的选择 从优良的品系中选取优良的个体作种菇，以单生菇、菇形圆整、无病虫害菇作分离材料。
②分离 把种菇带入接种箱内，用75%酒精表面消毒，用解剖刀在菌柄中部纵切一刀，然后撕开，挑取菌盖与菌柄交界处的一小块组织，接种到PDA培养基上，数天后就可看到组织块及培养基上有白色菌丝，即表明分离成功。
2、菌核组织分离 茯苓、猪苓、雷丸等药用菌，常利用菌核分离得到菌种。分离方法是将菌核表面消毒后，用解剖刀切开，取中间组织1小块，接入PDA培养基上，20℃—25℃培养。
3、菌索分离 密环菌，假密环菌常用菌索来分离。方法是将菌索表面消毒后，去掉菌鞘，把白色菌髓部分用无菌剪刀剪成小段。移接在PDA培养基上，20℃—25℃培养，有白色菌丝长出且无污染，即表明分离成功。
（二）孢子分离法
孢子分离法是利用菌类的成熟孢子能自动弹射的原理，在无菌操作条件下，使孢子在适宜的培养基上萌发长成菌丝体而获得菌种。
1、种菇的选择 孢子分离用的形态不同，孢子分离的方法也不同。
①整菇插种法：是将整只成熟度适当的种菇，经表面消毒后，插入孢子采集器内，放在适当的温度下，让其弹射孢子的方法。蘑菇、香菇、草菇等食用菌常用此法采集孢子。
②钩悬法：将新鲜的成熟度适当的耳片用无菌水冲洗后悬挂在无菌的三角瓶内或有孔钟罩内，在一定温度下让其弹射孢子。木耳、银耳常用此法采收孢子。
（三）、耳木（菇木）分离法
耳木（菇木）分离法是利用耳木或菇木中的菌丝体得到菌种的方法。
1、耳木的采集与选择 一般在该菌的生长季节里，选取生长的子实体大、肉质厚、成熟度适当、无杂菌感染的耳木或菇木进行分离。
2、分离方法 在所选耳棒长有子实体的部位，横断面锯下锯成1cm厚薄的木片，带入已经消毒的接种箱（或接种室）内。将上述木片浸入0.1%升汞溶液中30s—60s，用无菌水冲洗数次，以冲去残留的升汞液，放在无菌纱布上吸干水分，多面手用灭过菌的榔头，解剖刀切去树皮部分，把木片劈成小块，随后用镊子将小木块放入PDA培养基上，每管放一块，放适宜温度下培养。
（四）土中菌丝分离法
它是利用菌类地下的菌丝体来分离得到菌种的一种方法。主要用于腐殖质腐生菌的分离，用前述三种方法能分离得到菌种，一般不采用这一方法。但在野外采集时，菇类子实体已腐烂，而又十分需要该菌种时，就要用此法分离。具体操作如下：
①取菇体下与菇根相连的菌丝体，尽可能取较清洁的菌丝束。
②由于土壤中含有各种微生物，如细菌、放线菌、霉菌等，因此分离时要用无菌水反复冲洗菌丝束，把附着的泥土等杂物冲洗干净，把无菌棉花或纱布吸干水分。
③取菌丝束尖端部分，接入有细菌抑制剂的培养基中，25℃左右培养，无杂菌污染即分离成功。
④菌丝的鉴定。在土中获得的菌丝，其可靠性较小，必须经过出菇鉴定，才能确认是该菌的菌种。 接种后的原种或栽培种全部拿出培养箱或培养室，根据不同食用菌菌丝发育最适温 度进行培养。培养2～3天后，菌丝开始生长时，要每天定期检查，如发现黄、绿、橘红、黑色杂菌时，要及时拣出清理。尤其是塑料袋菌种，检查工作到菌丝长满为止。培养室切忌阳光直射，但也不要完全黑暗；注意通风换气，室内保持清洁，空气相对湿度不要超过65%；同时菌种瓶、袋不要堆叠过高，瓶间要有空隙，以防温度过高造成菌丝衰老，生活力降低。特别是对加温的培养室要注意：一要保持室内温度的稳定，因在温差较大的情况(特别是母种培养)会形成冷凝水，而使菌丝倒伏变黄。有条件的话，可根据菇类的菌丝生长对温度的要求，按品种分开放在不同温度的培养室(箱)内培养。同时要注意经常调换原种、栽培种排放的位置以使同一批菌种菌丝生长一致。二要注意通风换气，以免室内二氧化碳浓度过高而影响菌丝生长。

B. 实验室微生物菌种纯化方法

1、倾注平板法
首先把微生物悬液通过一系列稀释，取一定量的稀释液与熔化好的保持在40~50°左右的营养琼脂培养基充分混合，然后把这混合液倾注到无菌的培养皿中，待凝固之后，把这平板倒置在恒箱中培养。单一细胞经过多次增殖后形成一个菌落，取单个菌落制成悬液，重复上述步骤数次，便可得到纯培养物 2、涂布平板法
首先把微生物悬液通过适当的稀释，取一定量的稀释液放在无菌的已经凝固的营养琼脂平板上，然后用无菌的玻璃刮刀把稀释液均匀地涂布在培养基表面上，经恒温培养便可以得到单个菌落。3、平板划线法
最简单的分离微生物的方法是平板划线法。用无菌的接种环取培养物少许在平板上进行划线。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。当接种环在培养基表面上往后移动时，接种环上的菌液逐渐稀释，最后在所划的线上分散着单个细胞，经培养，每一个细胞长成一个菌落。
4、富集培养法
富集培养法的方法和原理非常简单。我们可以创造一些条件只让所需的微生物生长，在这些条件下，所需要的微生物能有效地与其他微生物进行竞争，在生长能力方面远远超过其他微生物。所创造的条件包括选择最适的碳源、能源、温度、光、pH、渗透压和氢受体等。在相同的培养基和培养条件下，经过多次重复移种，最后富集的菌株很容易在固体培养基上长出单菌落。如果要分离一些专性寄生菌，就必须把样品接种到相应敏感宿主细胞群体中，使其大量生长。通过多次重复移种便可以得到纯的寄生菌。
5、厌氧法
在实验室中，为了分离某些厌氧菌，可以利用装有原培养基的试管作为培养容器，把这支试管放在沸水0浴中加热数分钟，以便逐出培养基中的溶解氧。然后快速冷却，并进行接种。接种后，加入无菌的石蜡于培养基表面，使培养基与空气隔绝。另一种方法是，在接种后，利用N2或CO2取代培养基中的气体，然后在火焰上把试管口密封。有时为了更有效地分离某些厌氧菌，可以把所分离的样品接种于培养基上，然后再把培养皿放在完全密封的厌氧培养装置中。

C. 解离组织制片的常用方法有哪些

解离组织制片的常用方法有：质量分数15%的盐酸和体积分数95%的酒精，盐酸能杀死细胞，使其停止在各个分裂时期；还能溶解细胞之间的中胶层（破坏胞间连丝）。

保护组织位于植物的植物体幼嫩的根、茎、叶、花、果实的表面、直接接触外界环境的细胞层，而输导组织则是贯穿于植物体的根茎叶等器官为他们提供营养，掐去一根枝条的顶端就不会向上长了，因为植物生长靠的是细胞分裂，顶端的分生组织被破坏。

解离就是用要药液

使组织的细胞相互分离开来，便于最后制片时能被压成一薄层进行显微观察。解离液中酒精的作用是迅速杀死细胞，固定细胞的分裂相（将洋葱根尖剪下后，如果不立即投入固定液中将其杀死并令其各种细胞结构凝固，那么，整个根尖将一个分裂期细胞也找不到！）；而盐酸能溶解果胶，从而使洋葱细胞的细胞壁软化，并使细胞间的中胶层物质溶解，从而达到分离细胞的目的。

D. 组织分离的常用分离方法

种菇要选朵大盖厚，柄短，八九分成熟的优良品种。切去菇两基部，在无菌箱内以0.1%的升汞水浸几分钟，再用无菌水冲洗并揩干或用75%酒精棉球擦拭菌盖与菌柄2次，进行表面消毒。
接种时，只要将种菇撕开，在萌盖和菌柄交界处或菌褶处，挑取一小块组织；移接 到PDA培养基上。置25℃左右温度下培养3-5天，就可以看到组织上产生白色绒毛状菌丝，转管扩大即得到菌种。
如香菇、平菇等可以用此方法。 茯苓、猪苓、雷丸等菌的子实体不易采集。而常见的是它贮藏营养的菌核。用菌核分离，同样可以获得菌种。方法是将菌核表面洗净，用酒精或升汞消毒后，切开菌核，取中间组织一小块，约黄豆大小，接种在PDA 培养基斜面上，保温培养。
应注重的是，菌核是贮藏器官，大部分是多糖类物质，只含有少量的菌丝，因此挑取的组织块要大一些，假如组织块过小，则不易分出菌种。 有一部分子实体不易找到，也没有菌核，可以用菌素进行分离。如蜜环菌、假蜜环菌。
其操作方法是先用酒精或升汞将菌素表面黑色皮层轻轻擦拭2～3次， 然后去掉黑色外皮层（菌鞘），抽出白色菌髓部分；用无菌剪刀将菌髓剪一小段，接种在培养基上，保温培养，即得该菌菌种。
菌素分离要注重：因菌素比较细小，分离素也比较细小，分离时极易污染杂菌，所以要严格操作。 1.着名的黑木耳菌种“菊三”、“冬梅1号”、“雪梅1号”、“雪梅3号”、“984”就是黑龙江省柴河食用菌学会冬梅食用菌厂，通过对野生木耳组织分离，驯化选育成功的。
2.香菇组织分离方法
选用的子实体先经0.1%开汞水或70%酒精表面消毒后。用无菌水冲洗并用无菌纱布擦去表面水分。
分离香菇时，用无菌解剖刀自菌柄处切开少许，再用手将子实体掰开为二，在菌盖与菌褶交界处，切取0.3～0.4立方厘米的一小块菌肉，移放在斜面培养基中央。如已开伞的种菇、则选菌盖与菌柄交界处的菌肉。
分离草菇时，用无菌解剖刀把菌蕾纵切少许；再用手把菌盖轻轻剥开，在菌柄上方和菌盖交界处，切取1～5毫米的细块，接在斜面培养基中。如种菇已受雨淋，吸水较多，应取菌褶作为接种材料。组织分离后将试管外面放在恒温箱中培养。待组织块周围萌发出菌丝，并向 培养基蔓延生长后，再挑取生长健壮的菌丝进行转管培养。
组织分离法操作简便，又不易带入杂菌，容易获得纯菌种。但对银耳、黑木耳等胶质菌；因其子实体中菌丝的含量极少，如用组织分离培养，则往往不易成功。

E. 什么是食用菌母种、原种和栽培种

母种:从蘑菇上直接分离得到的菌种(试管种,用培养基培养)。

原种:由母种扩大繁殖得到的菌种(瓶装种,用培养料培养,一般多拿罐头瓶或者小袋子培养)。

栽培种:由原种扩大繁殖得到的菌种(袋装种,用培养料培养,一般都拿蘑菇袋子培养)。

母种用来保存菌种,原种用来扩大菌种,栽培种用来生产的。

组织分离法组织分离法是通过切取菌索、子实体、菌核的新鲜幼嫩的组织进行分离，以获取纯菌丝的方法，是最常用的菌种分离法之一 。

子实体、菌索等实际就是双核菌丝的纽结物，具有很强的再生能力。因分离时所 选择的材料不同 ，该方法又可分为菌索组织分离法、子实体组织分离法及菌核组织分离法。

在实践中，子实体组 织分离法是最有效、最常用的方法。但对于胶质菌，由于其子实体中所含的菌丝量比较低 ，如黑木耳、银耳等，利用组织分离培养难度较大。

组织分离属于无性繁殖的范畴，能保持原菌株的特性，遗传稳定变异小，不仅适于孢子不易收集或萌发的食用菌，也适于稳定优良品种的遗传性。

孢子分离法 孢子分离法，是采取子囊果或子实体中成熟的子囊孢子或有性孢子萌发成纯菌丝，再进一步培养成菌种的方法。

由此法可以获得强活性、短菌龄的菌丝，该方法的另外一个优点是分离得到的有性孢子兼有双亲的遗传特性，可用于杂交育种和选育新种中。

只是孢子间不仅存在个体差异，还存在较普遍的自然分化现象，出现的变异较大，必须经过出菇试验后才能用于生产中团。对于产孢子的真菌，一般其分离法多采用孢子分离法。

以上内容参考：网络-食用菌菌种