Ⅰ 如何用PCR方法检测基因的多样性
多态性（polymorphism）是指处于随机婚配的群体中，同一基因位点可存在2种以上的基因型。在人群中，个体间基因的核苷酸序列存在着差异性称为基因（DNA）的多态性(gene polymorphism)。这种多态性可以分为两类，即DNA位点多态性(site polymorphism)和长度多态性 (longth polymorphism)。
基因多态性的主要检测方法简述如下：
1．限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）：由DNA 的多态性，致使DNA 分子的限制酶切位点及数目发生改变，用限制酶切割基因组时，���钠�问�亢兔扛銎�蔚某ざ染筒煌��此�降南拗菩云�纬ざ榷嗵�裕�贾孪拗破�纬ざ确⑸�谋涞拿盖形坏悖�殖莆�嗵�晕坏恪W钤缡怯肧outhern Blot/RFLP方法检测，后来采用聚合酶链反应（PCR）与限制酶酶切相结合的方法。现在多采用PCR-RFLP法进行研究基因的限制性片段长度多态性。
2．单链构象多态性（SSCP）：是一种基于单链DNA构象差别的点突变检测方法。相同长度的单链DNA如果顺序不同，甚至单个碱基不同，就会形成不同的构象。在电泳时泳动的速度不同。将PCR产物经变性后，进行单链DNA凝胶电泳时，靶DNA中若发生单个碱基替换等改变时，就会出现泳动变位（mobility shift），多用于鉴定是否存在突变及诊断未知突变。
3．PCR-ASO探针法（PCR-allele specific oligonucleotide, ASO）：即等位基因特异性寡核苷酸探针法。在PCR扩增DNA片段后，直接与相应的寡核苷酸探杂交，即可明确诊断是否有突变及突变是纯合子还是杂合子。其原理是：用PCR扩增后，产物进行斑点杂交或狭缝杂交，针对每种突变分别合成一对寡核苷酸片段作为探针，其中一个具有正常序列，另一个则具有突变碱基。突变碱基及对应的正常碱 基匀位于寡核苷酸片段的中央，严格控制杂交及洗脱条件，使只有与探针序列完全互补的等位基因片段才显示杂交信号，而与探针中央碱基不同的等位基因片段不显示杂交信号，如果正常和突变探针都可杂交，说明突变基因是杂合子，如只有突变探针可以杂交，说明突变基因为纯合子，若不能与含有突变序列的寡核苷探针杂交，但能与相应的正常的寡核苷探针杂交，则表示受检者不存在这种突变基因。若与已知的突变基因的寡核苷探针匀不能杂交，提示可能为一种新的突变类型。
4. PCR-SSO法：SSO技术即是顺序特异寡核苷酸法（Sequence Specific Oligonucleotide, SSO）。原理是PCR基因片段扩增后利用序列特异性寡核苷酸探针，通过杂交的方法进行扩增片段的分析鉴定。探针与PCR产物在一定条件下杂交具有高度的特异性，严格遵循碱基互补的原则。探针可用放射性同位素标记，通过放射自显影的方法检测，也可以用非放射性标记如地高辛、生物素、过氧化物酶等进行相应的标记物检测。
5. PCR-SSP法：序列特异性引物分析即根据各等位基因的核苷酸序列，设计出一套针对每一等位基因特异性的（allele-specific）、或组特异性 (group-specific)的引物，此即为序列特异性引物（SSP）。SSP只能与某一等位基因特异性片段的碱基序列互补性结合，通过PCR特异性地扩增该基因片段，从而达到分析基因多态性的目的。
6. PCR-荧光法：用荧光标记PCR引物的5’端，荧光染料FAM和JOE呈绿色荧光，TAMRA呈红色荧光，COUM 呈兰色荧光，不同荧光标记的多种引物同时参加反应，PCR扩增待检测的DNA，合成的产物分别带有引物5’端的染料，很容易发现目的基因存在与否。
7. PCR-DNA测序：是诊断未知突变基因最直接的方法，由于PCR技术的应用，使得DNA 测序技术从过去的分子克隆后测序进入PCR直接测序。PCR产物在自动测序仪上电泳后测序。常用方法有：Sanger双脱氧末端终止法;Maxam-Gilbert化学裂解法；DNA测序的自动化。目前DNA顺序全自动激光测定法是最先进的方法。
8. PCR指纹图法（PCR-fingerprints）：实用于快速的同种异型DR/Dw配型。在DR/DW纯合子及杂合子个体中，每种DR单倍型及每种单倍型组合所产生的单链环状结构的大小、数目和位置各异，由于同质双链和异质双链之间的分子构象不同。因此，在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳时，它们的迁移率各不相同，从而获得单倍型特异的电泳带格局即PCR指纹。也有人用人工合成的短寡核苷酸片段作为探针，同经过酶切的人体DNA作Southern blot，可以得出长度不等的杂交带，杂交带的数目和分子量的大小具有个体特异性，除非同卵双生，几乎没有两个人是完全相同的，就象人的 指纹一样，人们把这种杂交带图形称为基因指纹(gene finger-printing)。
9. 基因芯片法：又称为DNA 微探针阵列（Micro array）。它是集成了大量的密集排列的大量已知的序列探针，通过与被标记的若干靶核酸序列互补匹配，与芯片特定位点上的探针杂交，利用基因芯片杂交图象，确定杂交探针的位置，便可根据碱基互补匹配的原理确定靶基因的序列。这一技术已用于基因多态性的检测。对多态性和突变检测型基因芯片采用多色荧光探针杂交技术可以大大提高芯片的准确性、定量及检测范围。应用高密度基因芯片检测单碱基多态性，为分析SNPs提供了便捷的方法。
10. AFLP（Amplication Fragment Length Polymorphism）法
AFLP技术是一项新的分子标记技术，是基于PCR技术扩增基因组DNA限制性片段，基因组DNA先用限制性内切酶切割，然后将双链接头连接到DNA片段的末端，接头序列和相邻的限制性位点序列，作为引物结合位点。限制性片段用二种酶切割产生，一种是罕见切割酶，一种是常用切割酶。它结合了RFLP和PCR技术特点，具有RFLP技术的可靠性和PCR技术的高效性。由于AFLP扩增可使某一品种出现特定的DNA谱带，而在另一品种中可能无此谱带产生，因此，这种通过引物诱导及DNA扩增后得到的DNA多态性可做为一种分子标记。AFLP可在一次单个反应中检测到大量的片段。以说AFLP技术是一种新的而且有很大功能的DNA指纹技术。
11. DGGE（denaturing gradinent electrophoresis,DGGE）法
变性梯度凝胶电泳法（） DGGE法分析PCR产物，如果突变发生在最先解链的DNA区域，检出率可达100％，检测片段可达1kb，最适围为100bp-500bp。基本原理基于当双链DNA在变性梯度凝胶中进行到与DNA变性湿度一致的凝胶位置时，DNA发生部分解链，电泳适移率下降，当解链的DNA链中有一个碱基改变时，会在不同的时间发生解链，因影响电泳速度变化的程度而被分离。由于本法是利用温度和梯度凝胶迁移率来检测，需要一套专用的电泳装置，合成的PCR引物最好在5`末端加一段40bp-50bp的GC夹，以利于检测发生于高熔点区的突变。在DGGE的基础上，又发展了用湿度梯度代替化学变性剂的TGGE法（温度梯度凝胶电泳temperature gradient gelelectrophoresis,TGGE）。DGGE和TGGE均有商品化的电泳装置，该法一经建立，操作也较简便，适合于大样本的检测筛选。
12. RAPD（Random amplified polymorphic DNA）法
运用随机引物扩增寻找多态性DNA片段可作为分子标记。这种方法即为RAPD( Random amplified polymorphic DNA，随机扩增的多态性DNA)。尽管RAPD技术诞生的时间很短, 但由于其独特的检测DNA多态性的方式以及快速、简便的特点,使这个技术已渗透于基因组研究的各个方面。该RAPD技术建立于PCR技术基础上,它是利用一系列(通常数百个)不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链(通常为10聚体)为引物,对所研究基因组DNA进行PCR扩增.聚丙烯酰胺或琼脂糖电泳分离,经EB染色或放射性自显影来检测扩增产物DNA片段的多态性,这些扩增产物DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性。RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同,但对于任一特异的引物,它同基因组DNA序列有其特异的结合位点.这些特异的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合PCR扩增反应的条件,即引物在模板的两条链上有互补位置,且引物3'端相距在一定的长度范围之内,就可扩增出DNA片段.因此如果基因组在这些区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变就可能导致这些特定结合位点分布发生相应的变化,而使PCR产物增加、缺少或发生分子量的改变。通过对PCR产物检测即可检出基因组DNA的多态性。分析时可用的引物数很大,虽然对每一个引物而言其检测基因组DNA多态性的区域是有限的,但是利用一系列引物则可以使检测区域几乎覆盖整个基因组。因此RAPD可以对整个基因组DNA进行多态性检测。另外，RAPD片段克隆后可作为RFLP的分子标记进行作图分析。
Ⅱ PCR鉴定微生物,请问一下具体的步骤是什么
PCR即聚合酶链式反应是常用的快速扩增基因的方法。
通过PCR可以鉴定到种
具体步骤：
1将培养过的微生物（最好是青年时代的）提取基因组（这步不清楚再问我）
2 通过PCR扩增，
3 测定基因序列
4 和已知的基因图库上的序列比较，就可以确定是哪一个种
不过现在一般不采用基因组来比较，这样工程量太大。比较16SRNA是比较常用的方法。相对简单，准确度高。
Ⅲ PCR产物的检测方法有哪些都有什么原理
1.琼脂糖凝胶电泳 同时点分子量marker，根据marker条带判断产物分子量大小，从而大致判断是不是你要的
2.酶切 已知你产物的序列，看上面有什么酶切位点，用一个酶或者两个酶切断，看与理论预测的条带数目和大小是否一致。一般检测有以上两步就行了，如果需要知道确切的需要进行3
3.测序 连接到pMD-18t 载体上，转到大肠杆菌中。拿到公司去测序，测序结果通过gene bank比对看与哪个基因一致，这种方法最准确
4.表达 pcr产物连到真核或者原核表达载体上，适宜条件表达出来以后的蛋白做质谱分析，看与理论产物表达的蛋白是否有一致的片段
Ⅳ 我的实验室想开展微生物用PCR方法鉴定，请问需要哪些仪器、试剂，还有操作步骤和方法，全过程最好！谢谢！
步骤如下：
1. 细菌总DNA的提取
2. 16S rDNA序列的扩增(采用通用引物)
3. PCR产物的回收
4. 16S rDNA产物与T载体的连接
5. E.coli JM109感受态细胞的制作(CaCl2法)
6. 连接产物转化入E.coli JM109感受态细胞
7. 挑取转化子并验证
8. 测序以及序列比对
9. 系统发育树的构建
所需仪器及试剂：
PCR仪、冷冻离心机、核酸电泳仪、水浴锅
DNA提取试剂盒、常用培养基、CaCl2、PCR试剂盒
E.coli JM109菌种、T载体、氨苄青霉素（由你载体类型决定）
O(∩_∩)O~，希望对你有用
Ⅳ 科普讲堂|实时荧光定量PCR检测方法
聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。目前，PCR成为分子生物学研究必不可少的一部分。实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对模板进行定量分析的方法。该项技术可以对DNA、RNA样品进行相对定量、绝对定量和定性分析，提高了普通PCR技术的特异性和准确性，被广泛应用于基础研究、疾病诊断、农业检测和法医调查等领域。
一、常规PCR
利用DNA分子会在体外95°高温时会发生变性解旋变成单链，然后降温到60°C左右时引物会与单链DNA按碱基互补配对原则结合，接着再升高温度到72°C左右，即DNA聚合酶最适反应温度，DNA聚合酶会沿着磷酸到五碳糖（5'-3'）的方向合成相应的互补链，如此循环往复以达到DNA分子扩增的目的，常规PCR技术无法实现精确定量。
二、实时荧光定量PCR
如要对DNA、RNA样品进行精确定量研究，就需要采用实时荧光定量PCR，根据检测实时荧光PCR产物的方式不同，实时荧光定量PCR主要有DNA结合染料法、基于探针的化学法、淬灭染料引物法等类型。
1. DNA 结合染料法
原理 ：应用一种带有荧光的、非特异的DNA结合染料检测PCR过程中积累的扩增产物。
应用于核算定量和基因表达验证。
优缺点： 它们的优点是可以对任何双链DNA 进行定量，不需要探针，具有相对高的灵敏度和可靠性，并且成本低，简单易用，缺点是它们能在反应中结合所有的DNA双链，其中包括在PCR过程中产生的引物二聚体或其他非特异产物。
染料法一般使用的是SYBR Green I染料，这是一种可以与双链DNA小沟结合的荧光染料，不会与单链DNA结合，并且在游离状态下几乎无荧光，只有与双链DNA结合才会发出荧光，因此将PCR扩增产生的双链DNA数量与荧光强度直接关联，产生实时监测的效果。
2. 基于探针的化学法
原理： 应用一个或多个荧光标记的寡核苷酸探针检测PCR扩增产物；依赖荧光能量共振传递检测特异性扩增产物。
应用于核酸定量、基因表达验证、等位基因鉴别、SNP分型、病原体和病毒检测、多重PCR。
优缺点： 探针法的鉴别能力远远大于DNA结合染料法，因为它们只与目的产物结合，从不与引物二聚体或其他非特异产物结合，缺点是它的合成价格高。
探针法中最常用的TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭基团则在3’末端，PCR扩增时在加入引物的同时加入探针，探针完整时，荧光信号被淬灭基团吸收，PCR扩增时，5’→3’外切酶活性将探针酶切降解，使荧光基团和淬灭基团分离，从而检测器可以接收到荧光信号。
3. 淬灭染料引物法
原理： 采用荧光标记引物扩增，从而使荧光标记基团直接掺入PCR扩增产物中，依赖荧光能量共振传递。
应用于核酸定量、基因表达验证、等位基因鉴别、SNP分型、病原体和病毒检测、多重PCR
优缺点：探针和目标片段的特异性结合产生荧光信号，因此减少了背景荧光和假阳性，还可进行多重PCR扩增，缺点是原料成本价格高
三、实时荧光PCR仪
实时荧光PCR系统包括热循环仪，用于荧光激发的光学系统以及用于收集荧光数据和管理分析的计算机软件，数据通过实时分析软件以图表的形式显示。
Ⅵ PCR鉴定具体操作是什么怎么用它来鉴定某个基因的表达
fengzhe79同学只提到逆转录PCR，这只是半定量PCR。
mRNA一般使用RT-qPCR进行“定量”PCR。
步骤前三步同于“半定量”PCR，第四步PCR的时候，用的PCR试剂，必须带有荧光素，用实时定量PCR仪检测。通过数据分析，得到mRNA的含量。
（基因是通过mRNA进行翻译成为蛋白质）
Ⅶ 简述PCR技术操作步骤
PCR即聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction）的缩写，它是体外酶促合成特异DNA片段的方法。这一方法的要点是合成两个分别互补于待扩增DNA片段两端的小片段引物，在含有引物、待扩增DNA模板核苷酸底物和DNA多聚酶的反应体系中DNA复制反复进行，在短时间内可以取得大量扩增产物。其原理是寡聚核苷酸链引物在DNA聚合酶的作用下沿模板延伸，合成两个与靶DNA两侧序列互补的引物，在体外进行靶DNA的重复合成。
主要的技术步骤是：
（1）DNA变性 加热使靶DNA序列双链解离成单链DNA。
（2）引物与靶DNA退火 适当降低温度，使两个引物分别结合成靶DNA两条的3′末端向5′末端延伸。
（3）引物延伸 在DNA聚合酶的催化下，引物沿着靶DNA3′末端向5′末端延伸。新合成的DNA链在变性解离后，又可作为模板与引物杂交，并且在DNA聚合酶的催化下，引导合成新的靶DNA链。如此反复进行以上3个步骤，即可使靶DNA片段指数性扩增。
Ⅷ 怎么通过PCR法鉴别小鼠基因型
三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时 聚合酶链式反应
间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至40~60℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于72℃左右，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
可以用血液来提取小鼠的DNA再电泳检测