Ⅰ 基因克隆的方法主要有哪几种，简述各种方法的原理和用途
基因克隆的方法主要有哪几种
选择目的基因,并设计相应引物；
用引物PCR扩增目的基因片段；
选择合适（抗性标记、酶切位点等）的克隆载体（为了保真扩增）,并将PCR片段连接入克隆载体中；（一般用Taq酶的PCR产物在末尾会自带一个A,可在Solution 1作用下与两端各带一个T的线性T载体直接相连）
将连接产物转化入感受态大肠杆菌,使之在含有抗生素的培养基上生长扩增；
从大肠杆菌中提取质粒（即前面的连接产物）,酶切鉴定和测序鉴定均无误后将目的基因片段切下并与新的表达载体连接,然后再次转化入大肠杆菌中扩增,再提质粒,即得到想要的目的基因片段克隆.
Ⅱ 基因克隆常见方法
、T4连接酶介导的DNA克隆
传统的分子克隆，通常需要使用相同的限制性内切酶酶切载体和目的片段，使得载体和片段产生相同的粘性或平末端，使用T4 DNA连接酶对其进行连接，转化，挑取阳性克隆，得到重组质粒
为了更方便的对DNA进行克隆，后续又将克隆的载体进行了简化，出现了T载体，这样就可以不用酶切，直接将片段连接到载体上，以便于DNA的保存及后续扩增。
以TA克隆为例来介绍整个连接过程。常规的连接是一个三分子共同反应的过程（图1），载体、片段和连接酶碰撞在一起，发生反应，完成连接过程。为了得到更多的阳性克隆，我们会倾向于加入更多的片段、载体和连接酶，以提高分子碰撞机率，但同时也会遇到一个问题，过高的DNA浓度和T4连接酶浓度会增加分子间相互作用促进串联体和载体自连的形成，反而导致片段和酶的利用率降低。所以在进行TA克隆时，并不是DNA和酶加入的越多越好。
使用这种方法进行克隆，如果需要连接平末端的DNA片段（比如Pfu类酶扩增的片段），则需要进行额外的加A尾反应（可以使用Taq酶完成加A）
二、EASY克隆
EASY克隆的方法主要依赖于载体上所携带的拓扑异构酶。拓扑异构酶的生理作用主要体现在DNA复制的过程中，同时具有内切酶和连接酶的功能：酶切释放DNA复制过程中产生的螺旋力；在复制完成后，将缺口补上，完成DNA的复制。很多拓扑异构酶无明显特异性结合DNA序列的规律，直到1990年，科学家舒曼在牛痘病毒中发现了一种拓扑异构酶能特异性识别C/TCCTT序列（图2），并对后面序列进行切割和连接，才使得拓扑异构酶用于DNA克隆成为可能。
图2 左图：拓扑异构酶识别特定的序列；右图：拓扑异构酶介导的基因克隆
EASY克隆就是基于这一原理，将T碱基通过磷酸键与拓扑异构酶第274位酪氨酸结合，使拓扑异构酶和载体偶联在
Ⅲ 基因克隆的常用方法有哪几种
根据已知探针克隆基因
这也是基因克隆的一种较直接的方法。首先将探针作放射性或非放射性标记,再将其与用不同内切酶处理的基因组DNA杂交,最后将所识别的片段从胶中切下来，克隆到特定的载体(质粒、噬菌体或病毒)中作序列测定或功能分析。这种方法不但可以将基因克隆出来,还能同时观察该基因在基因组中的拷贝数。但在探针杂交后,要注意高强度(highstringent)漂洗,以避免干扰信号,即保证克隆的特异性,同时节省时间。
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Ⅳ 基因克隆的方法有哪些
简单的说一下：
扩增目的基因，比如通过PCR的方法。
PCR扩增的序列可以通过酶切或者TOPO TA的方法插入到载体质粒。
转染大肠杆菌
筛选阳性克隆一般常采用蓝白克隆方法，就是在载体上，序列的插入位置本来是一个完整编码β-gal这个酶的序列，如果不被破坏，产生的酶可以降解细菌培养盘上的底物，形成蓝色产物。如果有目的序列插入，这个酶就不能表达，形成的克隆就是白色的。
挑取阳性克隆，测序确认无变异和方向后，扩增质粒，提纯质粒。
Ⅳ 怎样克隆一个目的基因
目的基因的克隆是利用一个单一的基因副本的行为。有pcr方法，凝胶电泳方法，色谱法，琼脂糖凝胶电泳法，质粒法等。具体方法可分别检索文献。
常用的植物目的基因克隆技术
1、通过已知基因产物的分析和鉴定
这类技术主要通过生物化学和病理学研究分离鉴定有关基因的蛋白产物，并对蛋白质氨基酸顺序进行分析，推断出编码该蛋白质的基因序列，然后通过抗体、寡聚核苷酸探针或PCR制备的探针对文库进行筛选来分离目的基因。如植物抗病虫基因工程中常用的苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因（Bt基因）、豇豆胰蛋白酶抑制基因（CpTI基因）、病毒外壳蛋白基因（CP基因）等。当其他植物的同类基因已分离到并且核苷酸序列保守性较高时，也可直接用这些已知的基因片段作探针对未克隆到该基因的植物基因文库进行筛选，也可分离到未知的新基因。
2、通过遗传表型分析
（1）基因标鉴法。该法是利用转座子或T-DNA插入植物的基因组中引起某一基因失活产生一些突变体，然后用相应转座子或T-DNA对突变体文库进行筛选，以选到的阳性克隆片段为探针，再筛选野生型植物因文库分离目的基因。如将一株带有功能的转位因子系统的植物与另一株在遗传上有差异的同种植物杂交，在杂交后代中筛选由于转位因子插入到某一特定基因序列中导致表型破坏或改变的突变株，用该纯合突变株构建基因文库，然后将转位因子用同位素标记作探针，从该文库中筛选出带有同源转位因子的目的基因。该法主要限于二倍体的自花授粉作物如玉米、金鱼草等。应用该法已分离出与玉米种子发育有关的Viviparious-1基因及与金鱼草花发育有关的一些基因等。
（2）激发子的寄主受体基因克隆技术。该技术是利用病菌无毒基因（avrgene）编氲募し⒆佑爰闹骺共’�虮嗦氲氖芴逯�浯嬖诓磺缀偷幕プ鞴叵担�圆≡�し⒆拥鞍孜�咚鞣掷牒涂寺〕鲆恍┘付≈士共’�颍�绶�延胛薅净�騛vr9对应的抗病基因cf9，与avrPto对应的抗病基因pto；拟南芥菜与avrRPS2对应的抗病基因rpS2等。
3、以图谱为基础的定位克隆技术
以图谱为基础的定位克隆技术在分离未知产物的基因方面有广阔的应用前景。该法的基本前提是基因定位，然后以紧密连锁的分子标记如RFLP等为起点，通过染色体步移逐步向目标基因靠近，最终克隆基因。其主要步骤包括：（1）将目标基因定位在高密度的分子标记连锁群上；（2）利用PFGE将连销标记的遗传图谱距转换成物理距离；（3）构建YAC文库，找到含连锁标记的YAC克隆，并通过克隆的排序获得目标基因的DNA片段；（4）通过转化和功能互补试验证实基因所在的DNA片段。如用该技术已分离出番茄抗根结线虫mi基因和拟南芥菜抗细菌性茎腐病的RPM1基因等。