A. 常用的菌种保存方法有哪些
菌种保藏是食用菌产业的一项基础工作，是确保野生种质资源基因留存和现有生产用种遗传性能相对稳定的必要手段。菌种保藏的方法多种多样，有的虽然保藏效果好，但投资高或操作繁杂。在生产实践中，更需要设备投入少，能保障菌种不死亡、不污染、最大限度地保持优良种性的简便方法，如斜面低温短期保藏和自然基质较长期保藏相结合的方法。
一般而言，对母种进行长期保存，对原种进行短期保存。须保证优良菌种的性状和活力不发生变异，不死亡，不被污染，确保其纯度。因此，保存方法应具备取材容易、操作方便、菌种不易退化、长期保存不污染杂菌等优点。常用的菌种保存方法如下：
（一）斜面低温保藏 该法的优点是保藏方便且所占空间较小。具体做法是：菌丝长满斜面后，放在0～5℃保存。以后每隔一定时间（2～3个月）转管一次。转管保存不能长期用PDA培养基，否则种性易退化，灰树花降解木质纤维素的能力减弱。因此隔一定时间（1年左右）须把菌种转接到木屑培养基上复壮，之后挑选健壮无污染的菌丝再转回PDA培养基保存。在长期保存过程中，要防棉塞受潮滋生杂菌。菌种试管口最好用蜡烫封，以防培养基内水分过快蒸发。增加琼脂用量（2.5%～3%）可减缓水分蒸发。还要防止菌种管上的标签脱落而造成种系混杂。
斜面低温保藏方法简便易行，能随时观察保藏菌株的活力和纯度，一旦染杂，肉眼能及时发现。
（二）自然基质保藏 此法是根据灰树花的特性，利用自然基质保藏其菌种的方法。灰树花是木腐菌，可以采用以木屑为主料的培养基。自然基质营养全面，且大部为缓释养分，不易产生营养过剩或饥饿；其次，培养基理化性状好，可吸收或缓冲菌丝代谢出的有害物质，水分与通气协调平衡，部分菌丝扎入基质内生长，不裸露于空气中，菌丝呼吸强度低，生命力强。
1.原料与配方 粗、细木屑比例适当，采用板栗树木屑最佳，粗木屑粒径为2毫米左右，细木屑为一般圆盘锯屑，粗、细的比例为1∶2，添加干木屑重量20%的麸皮和1%的糖，含水率为60%左右。这样的基质通气性好，营养丰富且供菌丝分解利用的时间长，长到基质内部的菌丝比包裹在基质外部暴露于空气中的菌丝耐受性强。不同粒径的基质比例适当，还能协调气与水的矛盾。粗粒过多，架空菌丝多；细粒过多，透气性差，菌丝生长慢。应用配方如下：
栗木屑78%，麸皮20%，石膏1%，蔗糖1%，水65%配料，装入较粗大的试管中，装料量为试管的1/3～1/2，1.5千克/厘米2灭菌1.5小时。冷却后，接入需保藏的菌种，在28℃下培养，待菌丝长满木屑培养基时取出换上无菌橡皮塞，在0～5℃冰箱内保藏1～2年转管一次。
2.容器与装量 采用容量250毫升的葡萄糖玻璃瓶，清洗洁净，装量一般不超过玻璃瓶容量的3/5，填料不能过满，瓶壁所残留的颗粒须擦拭干净，否则保藏的菌种易引起污染。
3.灭菌和冷藏 灭菌时若采用棉塞封口，基质表层易失水，接种成活率低，即使菌丝复活，生长也很缓慢，所以最好采用聚丙烯膜封口，接种后换用无菌棉塞培养，待菌丝长满后再换成有孔灭菌胶塞冰箱保藏。
用上述方法保藏的菌种经3年贮放后，接出成活率均达90%以上，出菇验证产量及子实体形态特征均无明显变化。因此，自然基质保藏法具有保存期长，菌种遗传性能相对稳定的特点。
（三）木粒PDA斜面保藏 灰树花在自然状态下易发生于栗树根部，这说明其营养需求较为特殊。根据灰树花这种习性，在PDA基础上添加适量的栗树木粒制成母种培养基。在多年的使用中发现，用该培养基培养的母种生长势好，在转接原种时，适应能力强，萌发定植快；用作菌种保藏基质时，保藏时间长，并能很好保持菌种的优良性状。
1.木粒PDA的制作 选取栗树边材，加工成0.3～0.5厘米的颗粒，及时烘干或晒干备用。称取葡萄糖10克，KH2PO41克，1溶解于1升清水中配制成营养液。将营养液倒入盛有木粒的小铝锅中，营养液以完全浸没木粒为准。煮沸10分钟，以加快木粒对营养液的吸收速度，起锅静置30分钟让木粒吸足营养液。捞出木粒，沥掉表面的水，装入试管，装量为试管长的1/6，最多不得超过试管长的1/5，否则在摆制斜面时，不易使木粒均匀分散于斜面的表面上。
选取新鲜的马铃薯，去皮并切成薄片，称取200克放入小铝锅中，加入1升清水，文火煮沸30分，趁热过滤取汁，并补足1升的体积。称取琼脂20克，葡萄糖20克，KH2PO4 2克，MgSO47H2O 2克。先将琼脂剪碎，加入到马铃薯滤液中，继续用文火加热，使琼脂溶化。待琼脂完全溶化后，加入称好的其他3种营养成分，搅拌使这些物质溶解均匀，趁热装入已装有木粒的试管中，装至试管长的1/3处，塞上棉塞。
在0.8～1千克/厘米2蒸气压下灭菌40分，待气压降至0时，开盖取出，趁热轻轻抖拍试管，使木粒分散后即可摆制斜面，并使木粒呈半裸状分布于斜面上，待凝固后便制成了木粒PDA培养基。
2.生长及保藏效果 木粒PDA斜面上培养的灰树花母种，菌丝生长迅速、良好，12天即可长满试管，但菌丝的后期生长势更为粗壮、浓密，后劲足。转接原种时，菌种适应力强，定植快。这表明，灰树花菌丝的生长速度、生长势不仅取决于本身的遗传性，而且很大程度上取决于培养基的营养。常规PDA的营养成分，主要是可溶性的速效性营养，前期营养丰富，营养利用直接，因而前期菌丝生长迅速、良好，后期营养则不足，菌丝生长不良，长势欠佳。木粒PDA由于在增添了木粒这一缓效性营养，就木腐性的灰树花而言，营养配伍合理，补充了菌丝生长后期所需的营养，因此后劲足。
菌丝体对基质的分解利用是通过菌丝细胞分泌的胞外酶，将基质中的大分子营养分解成小分子营养后才被吸收利用的，而这些胞外酶大多为诱导酶，其合成与分泌受基质的诱导和分解产物阻遏机制调节。就纤维素酶而论，许多易代谢碳源（如葡萄糖等）具有引起酶合成阻遏作用，同时伴随着菌丝体的旺盛生长，酶的大量合成则出现在易代谢碳源基本耗尽之后，且受到基质纤维素的诱导，常规PDA基质，到葡萄糖等易代谢碳源基本耗尽的后期，由于营养的缺乏，菌丝生理机能下降，酶的合成量减少。而木粒PDA不仅含有易代谢碳源——葡萄糖，又含有木粒这一缓效性营养，前期葡萄糖促进了菌丝体旺盛生长，获取了大量的菌丝体，表现为菌丝粗壮、浓密。到了易代谢碳源耗尽的后期，木粒一方面补充了后期所需的营养，使菌丝的生埋机能维持在一定的水平；另一方面木粒的纤维素激活菌丝细胞纤维素酶的诱导机制，合成了大量的酶，保持了木腐生性灰树花较强的分解木材的能力，因此，用该培养基培养的母种在转接原种时适应力强，萌发定植快。因部分菌丝长入木粒内部，抵抗不良环境的生存能力增强，种质不易退化。木粒PDA灰树花菌种，在0～5℃保藏2～3年再转管活化，成活率仍达到90%左右。此外，木粒PDA应用于木腐性灰树花种的提纯复壮，效果也较理想。
（四）石蜡隔氧封藏 具体做法是将液态石蜡分装入三角瓶内，装量达瓶空间的1/3，塞好棉塞，于121℃灭菌2小时，然后置40℃温箱中，使其水分蒸发，或置于干燥器内数日以除去水分，石蜡呈透明状为宜。在无菌条件下，用无菌吸管装入已长好菌丝的斜面试管，使液面高出斜面顶部1厘米左右。塞上无菌橡皮塞，竖直保存。此法可使菌种存活3年以上，但以1～2年移植一次为好。移植时不必倒出石蜡，用接种钩取一块菌丝即可。因转移时带有石蜡，菌丝生长弱，需要再转管1～2次，方能复壮。
B. 保存细菌等菌种最佳方法 菌种的保存方法
保存菌种的方法，应根据菌种的类型和保存目的进行选择，一般包括以下几种方法：
1、培养基保存法：此法不需要特殊设备，并可随时提供使用，为常用的一种保存方法，其缺点是易发生变异。营养要求
不高的细菌，可用半固体保存法，一般2～3月转种1次，并检查菌株特性，如特性已改变，则需丢弃。特殊培养要求的细菌，如流感嗜血杆菌可接种巧克力琼脂斜面，密封后冰箱贮存，每2周转种1次。淋病奈瑟菌保存于巧克力琼脂，每天或隔天转种1 次，不宜4 ℃冰箱保存，因易死亡。
2、快速冷冻法：将纯培养细菌在液体培养基上增菌后，取数个新鲜菌落加入含小牛血清或脱纤维绵羊血的培养基内制成浓菌悬液，再放人无菌玻璃珠，将此瓶放入－30℃以下低温冰箱保存。需要时用无菌镊子取出1 粒玻璃珠置增菌培养液中，增菌培养后即可获得新鲜菌种。用此方法，大部分细菌可保存6 ～12 月，甚至更长时间。
3、冷冻干燥法：是菌种保存最佳方法，可以免去细菌因频繁传代而造成菌种污染、变异和死亡。此法需冷冻干燥设备，操作较费时，但适用于需要长期保存的菌种。
C. 菌种保存 长期保存菌种的方法
1、液体石蜡保存法。液体石蜡保存法就是在斜面菌种或穿刺菌种表面覆盖一层液体石蜡，从而隔绝空气，减少菌种及培养物水分挥发，保藏温度要求在4℃下即可。将培养好的菌种斜面，缓慢倒入无菌的液体石蜡，使石蜡高出斜面顶端1厘米，直立放置，低温保存就可以，霉菌、放线菌、芽孢细菌可保藏2年以上不死，酵母菌可保藏1-2年。
2、沙土保存法。沙土保藏法是将菌种吸附在适当的载体上，而后进行干燥的保藏。将培养好的菌种接入沙土管内，用真空泵抽气至干。细菌、酵母菌、丝状真菌均可用此法保藏，前两者可保藏2年左右，有些丝状真菌甚至可保藏14-17年之久。
3、甘油管保存法。甘油管保存是利用微生物在甘油中生长和代谢受到抑制的原理达到保藏目的。配置30%浓度的无菌甘油，将培养好的菌种与甘油充分混合均匀，放入-20℃保存。
4、冷冻干燥保藏法。冷冻干燥保存法就是将菌种与保护剂混合均匀后，快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分，兼具低温、干燥、除氧三方。干燥后的菌种在真空环境下可长期保存。
D. 食用菌的菌种有哪些保藏方法各有什么特点
（1）斜面低温保藏。是一种最常用、最简便的菌种保藏方法。首先将需要保藏的菌种接到斜面培养基上，在适宜的温度条下培养，当菌丝健壮地长满斜面时，即将此试管菌种取出，放置于4 ℃的冰箱中保藏。特点：
①简单易行，适用于各类菇类菌种保藏，是目前生产及科研普遍采用的一种方法；②保藏时间短，需6个月转接一次，转管次数多菌丝变异的可能性大；③如改用橡皮塞并用石蜡扣，可保藏1年～3年。
（2）液体石蜡保藏。液体石蜡保藏也称为矿油保藏，即用矿油覆盖试管斜面试管保藏的方法。矿油是指无色、透明、黏稠、性质稳定、不易被微生物分解的石蜡油和液体石蜡，将其覆盖在斜面菌种之上，可以隔绝空气，防治培养基水分蒸发，抑制微生物的代谢活动，推迟细胞老化，从而达到长期保藏菌种的目的。特点：
①方法简便易行，保藏条件不严格，保藏时间长，可作为长期保藏菌种的方法；②菌种必须垂直放，放置不方便。
（3）滤纸保藏。滤纸保藏是一种以无菌滤纸作为食用菌孢子吸附载体长期保藏菌种的方法，又称滤纸孢子保藏法。特点：技术要求高，设备费用大，菌种不易衰老退化，菌种保藏时间长很少变异。
（4）自然基质保藏。自然基质保藏就是以不含毒性、刺激性和抑菌性而富含营养的自然生长的基质作培养基来保藏菌种的方法。自然基质很多，食用菌常用的自然基质有发酵的粪草、木屑及枝条基质等，取材方便，制作方法简便，保藏时间也较长。使用时，只需取一块、一粒或一条培养物放在新鲜的培养基上，并在适温下培养即可。特点：方法简便易行，保藏时间长。