转染的常用方法

‘壹’ 几种细胞转染技术原理和特点分析

转染方法的选择对实验结果影响很大，不少转染方法都需对细胞数量，DNA与转染试剂比例，培养及检测时间进行优化。传统的转染技术，如DEAE右旋糖苷法，磷酸钙法，电穿孔法，脂质体法各有利弊，其主要原理及应用特点见下表：转染方法原理应用特点磷酸钙法磷酸钙DNA复合物吸附细胞膜被细胞内吞稳定转染 瞬时性转染不适用于原代细胞 操作简便但重复性差 有些细胞不适用DEAE-右旋糖苷法带正电的DEAE-右旋糖苷与核酸带负电的磷酸骨架相互作用形成的复合物被细胞内吞瞬时性转染相对简便、结果可重复 但对细胞有一定的毒副作用 转染时需除血清电穿孔法高脉冲电压破坏细胞膜电位，DNA通过膜上形成的小孔导入稳定转染瞬时性转染所有细胞适用性广但细胞致死率高，DNA和细胞用量大， 需根据不同细胞类型优化电穿孔实验条件病毒介导法通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中稳定转染可用于难转染的细胞、原代细胞，体内细胞等逆转录病毒 特定宿主细胞但携带基因不能太大细胞需处分裂期 需考虑安全因素腺病毒通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中瞬时转染 特定宿主细胞可用于难转染的细胞 需考虑安全因素阳离子脂质体法带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物被细胞内吞稳定转染瞬时性转染所有细胞适用性广，转染效率高，重复性好，但转染时需除血清。转染效果随细胞类型变化大Biolistic颗粒传递法将DNA用显微重金属颗粒沉淀，再将包被好的颗粒用弹道装置投射入细胞，DNA在胞内逐步释放，表达瞬时性转染可用于：人的表皮细胞，纤维原细胞，淋巴细胞系以及原代细胞显微注射法用显微操作将DNA直接注入靶细胞核稳定转染 瞬时性转染转染细胞数有限 多用于工程改造或转基因动物的胚胎细胞 除上述传统方法外，近年来国际上推出了一些阳离子聚合物基因转染技术，以其适用宿主范围广，操作简便，对细胞毒性小，转染效率高受到研究者们的青睐。其中树枝状聚合物(Dendrimers)和聚乙烯亚胺(Polyethylenimine，PEI) 的转染性能最佳，但树枝状聚合物的结构不易于进一步改性，且其合成工艺复杂。聚乙烯亚胺是一种具有较高的阳离子电荷密度的有机大分子，每相隔二个碳个原子，即每“第三个原子都是质子化的氨基氮原子，使得聚合物网络在任何pH下都能充当有效的“质子海绵”(proton sponge)体。这种聚阳离子能将各种报告基因转入各种种属细胞，其效果好于脂质聚酰胺，经进一步的改性后，其转染性能好于树枝状聚合物，而且它的细胞毒性低。大量实验证明，PEI是非常有希望的基因治疗载体。目前在设计更复杂的基因载体时，PEI 经常做为核心组成成分。 线型PEI(Line PEI,LPEI) 与其衍生物用作基因转染载体的研究比分枝状PEI(Branched PEI,BPEI) 要早一些，过去的研究认为在不考虑具体条件，LPEI/DNA 转染复合物的细胞毒性较低，有利于细胞定位，因此与BPEI相比应该转染效率高一些。但最近研究表明BPEI的分枝度高有利于形成小的转染复合物，从而提高转染效率，但同时细胞毒性也增大。超高分枝的、较柔性的PEI衍生物含有额外的仲胺基和叔胺基，在染实验中发现这种PEI的毒性低，但转染效率却较高。 GenEscort 是采用各种分枝状和超高分枝状的小分子PEI 与各种含有生理条件下可降解键的交联剂交联，合成出的一系列高分枝的可降解的PEI衍生物。

‘贰’ 细胞转染的方法

1. DEAE-葡聚糖法。
   

2. 磷酸钙共沉淀转染。

3. 电穿孔法。

4. 脂质体法。

5. 病毒介导的感染，病毒感染增强剂。

6. 非脂质体转染 。
   

‘叁’ 细胞转染原理

细胞 转染是指将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技术。随着分子生物学和细胞生物学研究的不断发展，转染已经成为研究和控制真核细胞基因功能的常规工具。在研究基因功能、调控基因表达、突变分析和蛋白质生产等生物学试验中，其应用越来越广泛。

简介
转染 ，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例；化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。

理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。

需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态，到转染方法的操作细节，都需要考虑。

方法
脂质体转染法
阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电作用，将DNA分子包裹入内，形成 DNA脂复合物，也能被表面带负电的细胞膜吸附，再通过融合或细胞内吞进入细胞。脂质体转染适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前实验室最方便的转染方法之一，其转染率较高，优于磷酸钙法。由于脂质体对细胞有一定的毒性，所以转染时间一般不超过24小时。常用细胞类型：cos-7 、BHK、NIH3T3 、Hela等。

电穿孔转染法
电流能够可逆地击穿细胞膜形成瞬时的水通路或膜上小孔促使DNA分子进入胞内，这种方法就是电穿孔。当遇到某些脂质体转染效率很低或儿乎无法转入时建议用电穿孔法转染。一般情况下，高电场强度会杀死50%-70% 的细胞。现在针对细胞死亡开发出了一种电转保护剂，可以大大的降低细胞的死亡率，同时提高电穿孔转染效率。

病毒感染
对于脂质体转染与电穿孔转染都无法成功转染的细胞系建议用病毒感染，此法可以快速100%感染，检测成功率高。

‘肆’ 细胞转染的常用步骤

1. 转染试剂的准备
① 将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。
② 震荡后将试剂放在－20摄氏度保存，使用前还需震荡。
2. 选择合适的混合比例(1：1－1：2/脂质体 体积：DNA质量)来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。
3. 将混合液在室温放置10―15分钟。
4. 吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。
5. 加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。
6. 到时后，根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24－48小时。

‘伍’ 如何选择不同的转染方法

市面上的转染试剂品种很多，商家们还在不断推出新产品，如此多的选择难免令人感到无所适从，怎样才能找到最适合自己的产品呢？转染试剂的选择主要取决于细胞类型、细胞种属和下游实验。

细胞系不同，它们所需的转染条件自然也不相同。举例来说，悬浮培养的鼠类原代细胞，就比贴壁培养的人类细胞更难转染。此外，神经元和巨噬细胞也令人颇为头疼，标准方法很难将siRNA转染进去。

不论是哪种情况，经验数据都具有无可取代的价值。查阅文献，与其他研究者多交流都能获得宝贵的信息。当然，我们也可以在供应商提供的资料中，查看已成功转染的细胞类型。尽管这些资料中可能并没有siRNA转染的专门信息，但了解转染试剂已经成功转染了哪些细胞，是很有帮助的。

此外，我们可以向商家索要一点样品，或者向同事借用一些，对自己的细胞进行试验。幸运的话，在几天内就可以锁定合意的产品。在这里花少许时间，总好过因为实验结果不理想而要重头再来吧。

‘陆’ 体内转染的原理和操作方法是什么

EntransterTM-in vivo体内转染试剂通过纳米技术合成，通过物理作用与核酸结合，浓缩包裹核酸，从而保护核酸免受免疫系统破坏，同时增强核酸进入细胞核中表达。不含任何动物来源成分，由于处于纳米尺度，粒径小，不易引起免疫反应，不影响动物和器官组织的功能，可以多次在同一动物注射。

‘柒’ 转染的分类

包括：
1.DEAE-葡聚糖法
DEAE-葡聚糖是最早应用哺乳动物细胞转染试剂之一，DEAE-葡聚糖是阳离子多聚物，它与带负电的核酸结合后接近细胞膜而被摄取，用DEAE-葡聚糖转染成功地应用于瞬时表达的研究，但用于稳定转染却不是十分可靠。
2.磷酸钙法
磷酸钙法是磷酸钙共沉淀转染法，因为试剂易取得，价格便宜而被广泛用于瞬时转染和稳定转染的研究，先将DNA和氯化钙混合，然后加入到PBS中慢慢形成DNA磷酸钙沉淀，最后把含有沉淀的混悬液加到培养的细胞上，通过细胞胞膜的内吞作用摄入DNA。磷酸钙似乎还通过抑制血清中和细胞内的核酸酶活性而保护外源DNA免受降解.
3.人工脂质体法。
人工脂质体法采用阳离子脂质体，具有较高的转染效率，不但可以转染其他化学方法不易转染的细胞系，而且还能转染从寡核苷酸到人工酵母染色体不同长度的DNA，以及RNA,和蛋白质。此外，脂质体体外转染同时适用于瞬时表达和稳定表达，与以往不同的是脂质体还可以介导DNA和RNA转入动物和人的体内用于基因治疗。LipoFiterTM脂质体转染试剂()是一种适合于把质粒或其它形式的核酸,以及核酸蛋白复合物转染到培养的真核细胞中的高效阳离子脂质体转染试剂。它可以和带负电荷的核酸结合后形成复合物，当复合物接近细胞膜时被内吞成为内体进入细胞质，随后DNA复合物被释放进入细胞核内，至于DNA是如何穿过核膜的，其机理目前还不十分清楚。 外源基因进入细胞主要有四种方法：电击法、磷酸钙法、脂质体介导法和病毒介导法。电击法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入；磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞；病毒法是利用包装了外源基因的病毒感染细胞的方法使得其进入细胞。但是由于电击法和磷酸钙法的实验条件控制较严、难度较大；病毒法的前期准备较复杂、而且可能对于细胞有较大影响；所以现在对于很多普通细胞系，一般的瞬时转染方法多采用脂质体法。
利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性，因此脂质体与质粒的比例，细胞密度以及转染的时间长短和培养基中血清的含量都是影响转染效率的重要问题，通过实验摸索的合适转染条件对于效率的提高有巨大的作用。 （1）材料
293T细胞、MyoD表达质粒和EGFP表达质粒、DMEM培养基、链霉素/青霉素（双抗）、FCS（小牛血清）、PBS（磷酸盐缓冲溶液）、胰酶/EDTA消化液、转染试剂（TransFast）
（2）器材
20ul/200ul/1ml微量移液器和Tip头酒精灯、废液缸、血球计数板、涡旋振荡器、恒温水浴箱、台式离心机、35mm培养皿、转染管、15ml离心管、观察用倒置显微镜荧光显微镜和CCD 细胞传代
(1)试验准备：200ul/1mlTip头各一盒（以上物品均需高压灭菌），酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。
(2)弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。
(3)用Tip头加入1mlTrypsin液，消化1分钟（37。C，5%CO2)。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。
(4)加入1ml的含血清培养基终止反应。
(5)用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。
(6)将培养液装入离心管中，1000rpm离心5min。
(7)用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X106个细胞加入一个35mm培养皿。
(8)将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。
(9)将培养皿转入CO2培养箱中培养，第二天转染。
细胞转染
1）转染试剂的准备
A.将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。
B.震荡后将试剂放在－20摄氏度保存，使用前还需震荡。
2）选择合适的混合比例（1：1－1：2/脂质体体积：DNA质量）来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。
5）将混合液在室温放置10—15分钟。
6)吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。
7）加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。
8）到时后，根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24－48小时。
第二次细胞传代
1） 在转染后24小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。
2） 再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度0.8X105个细胞/35mm培养皿将细胞重新放入培养皿中。
3） 在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。

‘捌’ 怎样才是理想的细胞转染方法

博凌科为解答：理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小、重复性好、安全、简单等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低 的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。