DNA甲基化的常用的转化方法

❶ DNA甲基化测序方法介绍

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DNA 甲基化是表观遗传学(Epigenetics)的重要组成部分，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用，是目前新的研究热点之一。

DNA 甲基化及CpG岛

DNA 甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一,可能存在于所有高等生物中。DNA 甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。甲基化的主要形式有5-甲基胞嘧啶,N6-甲基腺嘌呤和7-甲基鸟嘌呤。原核生物中CCA/TGG和GATC常被甲基化，而真核生物中甲基化仅发生于胞嘧啶。DNA 的甲基化是在DNA 甲基化转移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5'端的胞嘧啶转变为5'甲基胞嘧啶。这种DNA 修饰方式并没有改变基因序列，但是它调控了基因的表达。脊椎动物基因的甲基化状态有三种：持续的低甲基化状态,如管家基因；去甲基化状态,如发育阶段中的一些基因；高度甲基化状态,如女性的一条失活的X染色体。

哺乳动物中，CpG序列在基因组中出现的频率仅有1%，远低于基因组中的其它双核苷酸序列。但在基因组的某些区域中，CpG序列密度很高，可以达均值的5倍以上，成为鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区，形成所谓的CpG岛。通常，CpG岛大约含有500多个碱基。在哺乳动物基因组中约有4万个CpG岛，而且只有CpG岛的胞嘧啶能够被甲基化，CpG岛通常位于基因的启动子区或是第一个外显子区。健康人中，CpG岛中的CpG位点通常是处于非甲基化状态，而在CpG岛外的CpG位点则通常是甲基化的。这种甲基化的形式在细胞分裂的过程中能够稳定的保留。当肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加，而CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态，以致于染色体螺旋程度增加及抑癌基因表达的丢失。

随着高通量测序技术（NGS）技术的发展，使我们能够从全基因组水平来分析5’甲基胞嘧啶及组蛋白修饰等事件，由此能够发现很多传统的基因组学研究所不能发现的东西，这就是所谓的“DNA甲基化测序”！

DNA甲基化测序方法按原理可以分成三大类：

一、重亚硫酸盐测序；

二、基于限制性内切酶的测序；

三、靶向富集甲基化位点测序；

基于以上原理又有数种不同的测序方法，下面，就介绍10种DNA甲基化测序的常用方法及参考文献：

1) 重亚硫酸盐测序

该方法可以从单个碱基水平分析基因组中甲基化的胞嘧啶。首先，利用重烟硫酸盐对基因组DNA进行处理，将未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基变成尿嘧啶。而发生了甲基化的胞嘧啶未发生脱氨基，因而，可以基于此将经重亚硫酸盐处理的和未处理的测序样本进行比较来发现甲基化的位点。

【相关文献】

Shotgun bisulphite sequencing of theArabidopsis genome reveals DNA methylation patterning

Highly integrated single-base resolutionmaps of the epigenome in Arabidopsis

2）重亚硫酸盐处理后接头标记技术(PBAT)

为了避免重亚硫酸盐处理时模板的丢失，通常会在重亚硫酸盐处理后进行接头连接和随机引物的扩增。

【相关文献】

Amplification-free whole-genome bisulfitesequencing by post-bisulfite adaptor tagging

3）限制性内切酶-重亚硫酸盐靶向测序(RRBS)

该技术是指对基因组上CpG岛或CpG甲基化较密集的区域进行靶向测序。样本首先经几种限制酶进行消化处理，然后经重亚硫酸盐处理，最后再测序。这种方法可以发现单个核苷酸水平的甲基化。

【相关文献】

Reced representation bisulfite sequencingfor comparative high-resolution DNA methylation analysis

4）氧化-重亚硫酸盐测序(oxBS-Seq)

5’羟甲基胞嘧啶(5’hmC)是5’甲基胞嘧啶脱甲基成胞嘧啶过程的中间产物，重亚硫酸盐测序无法对二者进行区分。通过氧化-重亚硫酸盐测序，5’甲基胞嘧啶保留，而5’羟甲基胞嘧啶(5’hmC)被氧化，进而脱氨基成尿嘧啶。通过将经过氧化处理和未处理的样本进行测序比较，即可从单个碱基水平分辨5’羟甲基胞嘧啶(5’hmC)和5’甲基胞嘧啶。

【相关文献】

Quantitative sequencing of 5-formylcytosinein DNA at single-base resolution.

5）TET辅助的重亚硫酸盐测序(TAB-seq)

TAB-seq采用葡萄糖亚胺与5’羟甲基胞嘧啶(5’hmC)作用来保护免受TET蛋白的氧化。5’甲基胞嘧啶和未甲基化的胞嘧啶被脱氨基成尿嘧啶，进而可以从单个碱基水平鉴定5’羟甲基胞嘧啶(5’hmC)。

【相关文献】

Base-resolution analysis of5-hydroxymethylcytosine in the Mammalian genome

6）甲基化敏感性的限制酶测序(MRE-Seq)

MRE-Seq将甲基化作用的敏感性和限制酶的特异性结合起来进而鉴定CpG岛的甲基化状态。

【相关文献】

Genome-scale DNA methylation analysis

7）HELP-Seq

HELP-Seq采用HpaII及其甲基化不敏感的限制性内切酶MSPI处理，来对基因组内及基因组间的甲基化位点进行比较，进而实现甲基化测序。

【相关文献】

Comparative isoschizomer profiling ofcytosine methylation: the HELP assay

8）甲基化DNA免疫共沉淀测序(MeDIP)

MeDIP是一种采用抗体或甲基化DNA结合蛋白来捕获富集甲基化DNA的技术，这种技术可以发现基因组中高度甲基化的区域，如CpG岛，但不能进行单个碱基水平的分析。

【相关文献】

Chromosome-wide and promoter-specificanalyses identify sites of differential DNA methylation in normal andtransformed human cells

9)甲基化结合域捕获技术(MBD-CAP)

MBD-CAP技术利用甲基化DNA能够结合蛋白MeCP2,MBD1-2 和 MBD3LI来对甲基化的DNA进行免疫沉淀。与MeDIP技术相似，该技术也是可以发现基因组中高度甲基化的区域，不能从单个碱基水平分析甲基化。

【相关文献】

High-resolution mapping of DNAhypermethylation and hypomethylation in lung cancer

10）基于探针的靶向富集技术

甲基化测序靶向富集技术采用合成寡核苷酸探针来捕获CpG岛、基因启动子区域以及其他一些显着性甲基化的区域。目前，Agilent 和 Roche Nimblegen公司已有这种商品化的试剂盒。

最后，Pacific Biosciences（Pacbio）公司的这项SMRT DNA测序技术采用动力学原理来直接检测甲基化的胞嘧啶。

其中三代测序技术针对真核中的5mc检测需要的深度较深，大概要250x,但是利用特殊的试剂会降低其深度。

❷ DNA甲基化的去甲基化

有两种方式： 1） 被动途径： 由于核因子N F 粘附甲基化的DNA，使粘附点附近的DNA不能被完全甲基化，从而阻断DNM T1 的作用； 2） 主动途径： 是由去甲基酶的作用，将甲基基团移去的过程。在DNA 甲基化阻遏基因表达的过程中，甲基化CpG 粘附蛋白起着重要作用。虽然甲基化DNA 可直接作用于甲基化敏感转录因子E2F、CREB、A P2、CM ycöM yn、N F2KB、Cmyb、Ets，使它们失去结合DNA 的功能从而阻断转录，但是，甲基化CpG 粘附分子可作用于甲基化非敏感转录因子（SP1、CTF、YY1）,使它们失活，从而阻断转录。人们已发现5 种带有恒定的甲基化DNA 结合域（MBD ) 的甲基化CpG 粘附蛋白。其中M ECP2、MBD1、MBD2、MBD3 参与甲基化有关的转录阻遏；MBD1 有糖基转移酶活性，可将T 从错配碱基对TöG 中移去，MBD4 基因的突变还与线粒体不稳定的肿瘤发生有关。在MBD2 缺陷的小鼠细胞中，不含M ECP1 复合物，不能有效阻止甲基化基因的表达。这表明甲基化CpG 粘附蛋白在DNA 甲基化方式的选择，以及DNA 甲基化与组蛋白去乙酰化、染色质重组相互联系中的有重要作用。
哺乳动物一生中DNA甲基化水平经历2次显着变化，第一次发生在受精卵最初几次卵裂中，去甲基化酶清除了DNA分子上几乎所有从亲代遗传来的甲基化标志；第二次发生在胚胎植入子宫时，一种新的甲基化遍布整个基因组，甲基化酶使DNA重新建立一个新的甲基化模式。细胞内新的甲基化模式一旦建成，即可通过甲基化以“甲基化维持”的形式将新的DNA甲基化传递给所有子细胞DNA分子。
程晓东发现DNA甲基化运作机制‘转载’
摘要：埃默里大学医学院的科学家们发现了哺乳动物真核细胞用于复制甲基化信息的分子机制。科学家们通过X射线衍射晶体分析法对UHRF1蛋白的SRA区域进行结构分析，他们发现在复制酶拷贝DNA序列的时候，这一蛋白起书签样的作用。

❸ 易基因｜一文读懂：十大DNA甲基化研究核心问题

DNA甲基化是最早被发现、也是研究最深入的表观遗传调控机制之一，近年来关于DNA甲基化的研究成果屡屡见刊。我翻阅各类文献，为大家总结了十大DNA甲基化研究核心问题，包括什么是DNA甲基化，DNA甲基化的主要形式、DNA甲基化与去甲基化、植物中的DNA甲基化、DNA甲基化的主要功能、DNA甲基化作为生物标志物的潜力、DNA甲基化的主要研究方向、DNA甲基化检测方法、样本不同如何选择DNA甲基化检测技术、DNA甲基化数据挖掘等，让您一文读懂DNA甲基化。

1、什么是DNA甲基化

DNA甲基化（DNA methylation）为DNA化学修饰的一种形式，是指DNA分子在DNA甲基转移酶的作用下将甲基选择性地添加到特定碱基上的过程。DNA甲基化能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现，是最重要的表观遗传调控方式之一。

2、DNA甲基化的主要形式

5-甲基胞嘧啶（5-mC）：最重要的一种DNA甲基化修饰，广泛存在于植物、动物等真核生物基因组中, 称誉为“第五碱基”。

5-羟甲基胞嘧啶世衫腊（5-hmC）：哺乳动物的“第六碱基”。

N6-甲基腺嘌呤（N6-mA）：在细菌、藻类及动植物基因组中存在。

7-甲基鸟嘌呤（7-mG）

3、DNA甲基化与去甲基化（5mC）：

DNA甲基化反应分为2种类型：一种是2条链均未甲基化的DNA被甲基化，称为从头甲基化（denovo methylation）；另一种是双链DNA的其中一条链已存在甲基化，另一条未甲基化的链被甲基化，这种类型称为保留甲基化（maintenance methylation）。

甲基化的DNA可以发生去甲基化。DNA的去甲基化由基因内部的片段及与其结合的因子所调控，包括：

主动去甲基化(Active demethyaltion)：哺乳动物TET酶主动去甲基化，5mC经过TET作用转化成5hmC。

被动物甲基化(Passive demethylation)：DNA通过不断复制丢失/稀释甲基化。

4、植物中的DNA甲基化

对于植物而言，面对生长环境塌颂的改变，表观遗传的变异会改变植物DNA的构象，从而改变染色质和蛋白质的结构，达到调节基因组的作用。研究发现，当植物面临生物胁迫和非生物胁迫时，植物基因组中DNA甲基化会发生改变，并且这些改变会遗传给后代。所以DNA甲基化的改变能够丰富植物物种的多样性，加强植物的环境适应性。

不同于哺乳动物基因组只有CG甲基化，植物基因组甲基化有CG，CHG，CHH（H代表任何非G的碱基）甲基化。而维持这三种不同的DNA甲基化的分子机制非常复杂。

5、DNA甲基化的主要功能

DNA甲基化能引起染色体结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式改变，从而控制基因的表达。

保持基因组遗传物质的稳定性（TE的高甲基化）

调控基因的表达（顺式作用元件的动态甲基化，如Promoter/Enhancer等）

DNA甲基化参与基因转录调控、细胞分化、胚胎发育、X染色体失活、基因印记和肿瘤的发生等过程。

6、DNA甲基化作为生物标志物的潜力

相比基因组，DNA甲基化能够反应环境的影响

DNA甲基化不像基因组那么一成不变，也不像转录组和蛋白组那么搜滑不稳定。

DNA甲基化处于动态变化中，能够像年轮一样记录环境因素的影响。

DNA甲基化标志物是最有应用前景的表观遗传标志物 。

7、DNA甲基化的主要研究方向

8、DNA甲基化检测方法

目前研究中常用的DNA甲基化测序方法包括全基因组（WGBS、oxWGBS等）、简化基因组（dRRBS、RRBS、XRBS等）、靶向基因组（液相捕获）、靶向基因（TBS）和850K芯片等，适用于多种不同应用场景。

WGBS和RRBS用于基因组范围内研究探索，并筛选目标基因（候选DNA甲基化标记物）

TBS用于后续目标基因的甲基化验证

9、样本不同，如何选择DNA甲基化检测技术

易基因结合十余年DNA甲基化研究经验，全面总结了不同样本类型对于不同DNA甲基化检测工具选择的不同，技术推荐标准可以分为三点：

最有力方案（金标准）：WGBS/微量WGBS/scWGBS 

最具性价比方案：RRBS/dRRBS/XRBS（动物）

大规模临床转化/目标区域甲基化验证：TBS 

10、DNA甲基化数据挖掘

DNA甲基化一般遵循三个步骤进行数据挖掘。首先，进行整体全基因组甲基化变化的分析，包括平均甲基化水平变化、甲基化水平分布变化、降维分析、聚类分析、相关性分析等。其次，进行甲基化差异水平分析，筛选具体差异基因，包括DMC/DMR/DMG鉴定、DMC/DMR在基因组元件上的分布、DMC/DMR的TF结合分析、时序甲基化数据的分析策略、DMG的功能分析等。最后，将甲基化组学&转录组学关联分析，包括Meta genes整体关联、DMG-DEG对应关联、网络关联等。

❹ 如何进行DNA甲基化分析

DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶，即在DNA甲基化转移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶转变为5’-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。这种DNA修饰方式在不改变基因序列前提下实现对基因表达的调控。脊椎动物DNA的甲基化状态与生长发育调控密切相关，比如在肿瘤发生时，抑癌基因CpG岛以外的CpG序列非甲基化程度增加，CpG岛中的CpG则呈高度甲基化状态，导致抑癌基因表达的下降。
1、甲基化特异性的PCR（Methylation-specific PCR，MSP）
用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变；随后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在甲基化；反之，说明被检测的位点不存在甲基化。
2、亚硫酸氢盐测序法（Bisulfite sequencing PCR，BSP）
用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧啶全部转化为胸腺嘧啶，最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化称为BSP-直接测序方法。将PCR产物克隆至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为BSP-克隆测序法。
3、高分辨率熔解曲线法（High Resolution Melting，HRM）
在非CpG岛位置设计一对针对亚硫酸氢盐修饰后的DNA双链的引物，这对引物中间的片段包含感兴趣的CpG岛。若这些CpG岛发生了甲基化，用亚硫酸氢盐处理后，未甲基化的胞嘧啶经PCR扩增后转变成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变，样品中的GC含量发生改变，从而导致熔解温度的变化（图1）。
其中，样品要求：细胞（≥106 个）、组织（≥300mg）、血液（≥1ml）、血清（≥1.5ml）等样品材料，基因组DNA（体积≥20μl，浓度≥50 ng/μl）。