半自动血凝仪使用方法

A. 凝血酶时间测定和凝血酶原时间测定的区别

凝血酶原时间（PT）测定和胆碱酯酶（ChE）活力检测各有什么临床意义？

凝血酶原是由肝脏合成的一种蛋白质。凝血酶原试验是一种了解血液凝固情况的试验，它可以反映肝脏的凝血功能。凝血酶原时间（PT）和凝血因子Ⅰ、Ⅴ、Ⅶ和Ⅹ有关，而这些因子也均在肝脏合成。凝血酶原时间的正常值为11～15秒（奎氏法）。当肝脏出现病变、肝功能不良、上述凝血因子因合成障碍而含量降低时，即可引起凝血酶原时间延长而发生凝血障碍。如重型肝炎时，凝血酶原时间明显延长，患者容易出血，预后较差；慢性活动性肝炎与肝硬变时，凝血酶原时间可轻度延长；肝外阻塞而无明显肝细胞损害时，凝血酶原时间可正常。长期肝外阻塞、胆汁淤积、影响维生素K的吸收时，也可导致凝血酶原时间延长；若给患者注射维生素K时，则凝血酶原时间可恢复正常。

此外, 由于凝血酶原半衰期短，在急性重型肝炎发病后的短时间内即有凝血酶原时间的改变，故测定凝血酶原时间，对重型肝炎的诊断，病情和预后的判定，具有重要的临床意义。

血清胆碱酯酶，又称“假性”或“非特异性”胆碱酯酶，是由肝脏合成的一种特异性较差的，既可作用于乙酰胆碱，又能作用于其他胆碱酯类的酶。其正常值为0.80～1.00或40单位以上。

由于血清胆碱酯酶的半衰期短，所以它是肝内损害时的一种极为敏感的、反映肝脏酶合成障碍的试验。其活性降低的程度往往与肝病的严重程度相一致。如重型肝炎患者胆碱酯酶活性值一般都较正常降低，且降低程度与病情轻重密切相关；约80％的病人，其血清胆碱酯酶活性可降至正常值的60％，重危病人甚至下降至10％以下，此类患者多很快死亡。因此，血清胆碱酯酶活性的测定，有助于对重型肝炎的诊断及对病情和预后的判定。此外，重度慢性肝炎和晚期肝硬变患者，血清胆碱酯酶亦有不同程度的降低。

血栓与止血实验室检查的临床重要性与日俱增，检验内容不断扩大，工作量也日益增多；不断出现的方法更新和试剂商品化、操作自动化，改变了以往靠手工操作、自配试剂、工作效率低的局面。与此同时，方法标准化和质量控制也显得格外重要。然而，由于血栓与止血试验的特殊性 ......

有关（凝血酶原时间（PT）、活化的部分凝血活酶时间（APTT）和纤维蛋白原(FIB)测定等三项实验）

摘要：对ICSH、ICTH或美国国家临床生物化学委员会（NCCLS）等国际以文件形式公布的有关凝血酶原时间（PT）、活化的部分凝血活酶时间（APTT）和纤维蛋白原测定等三项实验的标准化及其重要性作了简单叙述。

关键词： 凝血酶原时间 活化的部分凝血活酶时间 纤维蛋白原 标准化

由于血栓与止血实验的特殊性，因此迄今仅有凝血酶原时间（prothrombin time,PT）、活化的部分凝血酶时间（activated partial thromboplastin time,APTT）和纤维蛋白原（fibrinogen,Fg）等三项实验有了标准化的试剂（如PT）、标准品（如Fg）、质控品和统一的报告形式等；其他，如血小板功能、抗凝因子和纤溶成分等检测尚缺乏成熟的标准化方案。本文仅就经国际血液学标准化委员会（ICSH）国际血栓与止血委员会（ICTH）或美国国家临床生物化学标准委员会（NCCLS）等国际组织以文件形式公布的有关PT、APTT和Fg三项实验的标准化问题作一简介。

一、标准化和质量控制的重要性
所谓血栓与止血检测方法的标准化和质量控制，是指采用统计学原理，运用规范的物理、化学、生物学的方法，对血栓与止血实验的技术、操作、仪器、试剂和标本等项的质量水平，进行合理的管理、检测和评价，以标准化和质量控制来堵绝误差，提高实验的精密度、准确性和可靠性。标准化和质量控制的重要性在于：

1、为临床诊治提供可靠的依据：实验结果的可靠性是临床诊治疾病的重要依据和条件。实验结果若为假阳性就会造成误诊、误治；若为假阴性就会造成漏诊、漏治；实验结果偏高或偏低都会影响患者的诊断、鉴别诊断以及影响医师对病情和疗效的判断。

2、提高血栓与止血基础研究的效率和价值：血栓与止血基础研究的形式就是进行各种实验。实验可靠性好，就能揭示血栓与止血的客观规律，甚至可带来重大理论突破及（或）社会、经济效益；若实验可靠性差或有错误，则会造成假象或错误理论。

3、有助于人群健康调查和建立血液学参数的正常范围：为了解一定人群的健康水平，建立具有广泛意义的血液学参考值的范围须进行较大规模人群的健康调查，健康调查必须要有实验结果的可靠性作保障，不然会导致不准确或错误的结果，故质量控制对群体医学也有重要意义。

总之，血栓与止血实验室的质量控制，从一定程度上反映一个国家，一个地区，一个单位血栓与止血医疗水平和研究水平的高低。因此，应倍加重视。

二、 凝血酶原时间（PT）的标准化
自1935年Quick创建凝血酶原时间（prothrombin time,PT）测定方法以来，迄今仍然 是检查外源凝血系统诸因子及相关抑制物的重要筛选试验，PT也是目前口服抗凝剂治疗的主要手段。但是，PT测定受多种因素影响，必须对它进行标准化和质量控制，以提高PT检测的精密度、准确度和可靠性。

（一）凝血酶原时间（PT）的标准化问题

1、组织凝血活酶标准化：应用的国际参考品（international reference preparation IRP），有下列几种：
（1）单一组织凝血活酶国际参考品：是一种组织提取物的生理盐水悬液制剂。WHO在英国使用的统一标准的"英国比较凝血活酶"（British comparative thromboplastin,BCT）为基础，制备WHO的原级凝血活酶参考品（primary reference preparation），如人脑组织凝血活酶，编号67/40。同时又以BCT67/40为基础标化了次级参考品（secondary reference preparation）。如牛脑组织凝血活酶，编号为68/434；兔脑为70/178。后来WHO还公布了一些次级组织凝血活酶参考品，如人脑或胎盘制剂，如BCT/253；兔或兔、猴组织混合制剂，如RBT/79等。

（2）复合组织凝血活酶国际参考品：它是组织提取物的生理盐水悬液中加入适量的纤维蛋白原、因子V 和氯化钙组成的制剂，如牛组织凝血活酶OBT/79等。

目前世界各国都广泛应用WHO的这些参考品来校正本国或本地区制备或生产的组织凝血活酶参考物。这样使世界范围内有了多种组织凝血活酶参考品。

2、组织凝血活酶工作制剂（working preparation,WP）的国际敏感度指数（international sensitivity index,ISI）
由于不同组织凝血活酶对凝血因子的敏感性不同。为了使不同敏感性的组织凝血活酶在检测PT中能得到同样的结果，必须要制定一个共同的敏感性指标。这就需要通过自制的试剂与国际参考品（IRP）进行比较，然后得出一个校正值。具体的方法如下：

（1）用国际参考品（IRP）标定国家、地区或本实验室的参考制剂（reference preparation,RP）。
（2）用实验室参考制剂（RP）标定工作制剂（WP）。

1）标本：2份正常人血浆和6份口服抗凝剂达6周的患者血浆，连收10天，共60份标本。

2）测定：按一定顺序进行测定，每份标本重复测定2次。将PT测定的结果（秒）点在双 对数坐标纸上，横坐标代表WP的PT测定结果，纵坐标代表RP的PT测定结果，画出最佳的各点拟合直线，得出定标曲线，通过WP/RP比值，或回归方程求出斜率b。

3）计算WP的ISI值：ISI值愈接近于1.0，表明组织凝血活酶试剂愈敏感，因此，生产和出售组织凝血活酶试剂的厂商，必须在产品上标有ISI。

3、PT测定结果的报告方式：理论上，无论何种组织凝血活酶，只要标有ISI，就可与国际参考制品进行对比校正，并可用同一种计量单位报告。1985年ICSH和ICTH推荐以PT监测口服抗凝剂的报告方式是国际正常化比率（international normalizde ratio,INR）。

INR的计算公式如下： 在用INR后，各种敏感性不同的组织凝血活酶均可得到相同的INR值。

4、仪器特有有ISI：上述PT根据报告方式适用于手工法（试管倾斜法）测定PT。但是手工法与仪器法以及仪器法与仪器法测定PT的INR之间，仍有差异。研究表明，在ACL、Cobas Fibro和Coaga-Pet三台自动化仪器上，使用同一种ISI为1.12的Thromborel S试剂，测定PT的均值分别为10.7秒、12.1秒和11.1秒。但若以同一ISI值计算INR，得出的数值也存在着不同程度的差异。为此，专家们提出建议：同一组织凝血活酶试剂用于不同仪器时，可用所谓的"仪器特有的ISI"（instrument specific ISIs）或称区域性ISI（Local ISI）来计算INR。每台仪器所使用的凝血活酶试剂都应该有特定的ISI值，重新标定ISI值的做法是购买标有INR的冻干血浆，然后在自己的仪器上再标定所使用凝血活酶试剂的ISI值，这样才可使病人的INR具有可比性。

（二）凝血酶原时间（PT）的推荐方法

[原理]
将组织凝血活酶（主要含组织因子和脂质）和钙离子，加到枸橼酸抗凝血浆中，在37℃保温，测定血浆凝固时间，即为PT。PT主要用于筛选检测外源凝血系统的因子Ⅶ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅹ和相关因子的抑制物的试验。

[标本来集和处理]
1、标本采集：用硅化或塑料注射器抽取空腹静脉血，按9:1比例加入含0.109mol/L的枸橼酸钠抗凝剂的硅化或塑料试管中，轻轻混合均匀。
2、标本处理：以2000～2500g，离心15分钟，分离乏血小板血浆，并在24小时内完成试验。
3、正常对照血浆：选择正常健康男性和女性各lO名以上，年龄在18～45岁。但不能是妊娠、月经期、哺乳期和口服避孕药的妇女，采取的血浆冰冻干燥保存或-80℃保存。

[试剂]
1、抗凝剂：109mmol/L枸橼酸钠液（相当于含二分子结晶水的枸橼酸钠32g/L）。
2、凝血活酶试剂：市售商品，应标有ISI、批号及有效期。冻干者应按说明书加指定的缓冲稀释剂复溶。
3、氯化钙（CaCl2）溶液：为25mmol/L。（目前有些商品试剂已将凝血活酶液与氯化钙液混合好，可不必另配CaCl2液）。
4、质控物：正常及异常对照血浆
5、配制试剂用水必须符合1级纯水的标准。

[仪器]
1、手工法：秒表，保持37℃±1℃的恒温水浴箱或电热块。水深能浸试管3cm以上，表面无划痕的10×mm拭管。经标准的0.1mL移液管。经校正的秒表。
2、仪器法：各种自动或半自动血凝仪，严格按说明书操作。

[操作步骤]
1、手工法
（1）测定温度36.5～38.5℃，上述各试剂及被测血浆，均应预温至此一温度，但凝血活酶试剂预温不可超过30分钟，血浆预温一般不宜超过10分钟。

（2）所用试管及加样器等接触血浆的器具均为塑料或硅化玻璃管。

（3）吸取枸橼酸抗凝血浆0.1mL，加入一小试管中：加入凝血活酶试剂0.1mL混匀后置37℃水浴中。再加入25mmol/L CaCl2液0.1mL，（也可先将凝血活酶试剂与CaCl2溶液等量混合，加入0.2mL）。立即混匀并开动秒表：试管仍浸于水浴中，至约10秒钟时，自水浴中取出，在纱布上迅速擦去试管外水滴，在明亮处不断倾斜试管，在流动状态下观察有无纤维蛋白形成。一旦见到纤维蛋白（同时将出现液体流动减慢），立即停表，记录时间。每次测定二管，按平均数报告。本试验的最后混合液其pH应为7.2～7.3，大部分商品凝血活酶试剂均用含缓冲液的溶液配制。

（4）每批均同时做正常和异常对照，方法应与测定标本完全相同。

[报告方式]
1、以PT的秒（S）数报告（最接近的0.5秒）
2、以患者血浆（S）/正常对照PT（S）的比率（PRT）报告。
3、在口服华法令类抗凝药物治疗监控时，应报告国际正常化比率（INR）。大部分自动化仪器可根据所测的PTR和凝血活酶试剂的ISI，自动算出INR。手工法可根据下列公式，用一计算器直接计算：

Poller设计了一个简便的列线图，在取得PTR和ISI值后，即可从图上直接查找出INR值，十分便利，国内已有介绍。
ICSH规定，不再用稀释曲线或百分比（活动度）报告。

[参考值]
因仪器/试剂不同，会得出不同结果，故很难统一规定参考值。各实验室应根据自己的仪器、试剂等条件，自行测定一批健康人，建立参考值。此后至少每年或当条件有变化时，根据新的条件，重新建立。参考值PT测定的一切条件均应与患者血浆PT测定相同（包括采血、容器、抗凝剂等）。健康供血者应选至少20个18～55岁的男性和非妊娠、月经期女性，不可服药，在平静休息状态采血、以减少个体差异（有条件时，可测一批老年人和小儿，分开统计）。同时应分开几天采血和测定，以减少天间差异。测定结果经统计学处理，计算标准差：以两个标准差（2SD）或95%可信限作为参考范围。对于三个标准差是正常还是异常，需结合具体情况进行评估。从统计学上讲，其中有些人是正常的。用以上标准，病人（PT异常）则很少会遗漏。

三、活化部分凝血活酶时间(APTT)的标准化
（一）活化部分凝血活酶时间(APTT)的标准化
APTT是检测内源凝血系统诸凝血因子缺陷和相关抑制物的筛选试验，也是当前用于凝血因子、肝素抗凝治疗以及狼疮抗凝物质检测的主要手段。
与PT测定一样，不同的部分凝血活酶、不同的活化剂和不同的激活时间对各种凝血因子缺陷、对肝素和对狼疮抗凝物质的敏感性相差很大。例如，检测APTT的试剂中，所用活化剂（白陶土、硅藻土、鞣花酸）不同，他们对检测肝素、狼疮抗凝物质和因子Ⅷ、Ⅸ的敏感性不同。

迄今，ICSH和ICTH尚未有APTT检测方法标准化或试剂标准化的可行方案问世，仅NCCLS于1992年，提出一个编号为H29-T的暂行方案。

（二）活化的部分凝血活酶时间（APTT）的推荐方法

[原理]
将一种磷脂和激活剂加到血浆中，经过孵育后，加入适当浓度的钙离子。其纤维蛋白凝块形成的时间（以秒计），即为APTT。本法主要用于过筛测定内源途径凝血因子的缺陷，如因子Ⅶ、Ⅺ、Ⅷ、Ⅸ、激肽释放酶原（PK）、高分子量激肽原（HMWK）以及纤维蛋白原等。同时也用于上述因子的抑制物测定、肝素治疗的监测以及狼疮抗凝因子的检查。

[仪器]
本实验所用仪器、设备（包括采血、贮血容器、加样装置和标本的处理等）以及对它们的要求完全与PT相同。PT所用自动化仪器同样适于本实验。

[试剂]
1、部分凝血活酶试剂：由商品供应。一般已与檄活剂按比例配在一起（或分开配制）常用的激活剂由硅藻土（商品名Celite）、白陶土、二氧化硅微粒、鞣化酸（ellagic acid）或其它可用的激活剂，由厂方配套供应。
APTT试剂/仪器结合，应能使因子Ⅷ、Ⅸ或Ⅺ活性低于0.3μ/mL（或＜30%）的血浆，出现异常延长的结果。
2、氯化钙溶液（25mmol/L）以及其它试剂与PT所用者相同。

[操作步骤]
1、样品的采取、贮存、输送与PT测定相同。注意，应用清洁的塑料或硅化玻璃采血器采血及贮血。
2、标本（去血小板的血浆）的制备与PT相同。注意、应用去血小板血浆测定。
3、水浴箱或电热板的温度为37℃±1℃，要经常检查是否正确。
4、接触活化时间：加激活剂活化因子Ⅻ的时间要保持一致；各仪器和试剂生产厂家的规定可能不一样，应严格按说明书要求进行。手工操作时，应用秒表或类似的定时装置计时。
5、操作：预温（不超过30分钟）APTT试剂一份与预温（不超过10分钟）的侍测血浆一份混合，立即开动秒表计时；至规定的接触活化时间终点时，加人预温37℃的CaCl2液一份，混匀，同时开动秒表。至出现血浆凝固时，停表，记录血浆凝固时间（以秒计）。手工测定时应同时测定两管，按平均数报告。一些精密度已有很大改进的自动或半自动凝血仪，如果有适当的质控标准也可只测定一次。应同时测定正常和异常对照血浆。

[参考值]参照PT

[特殊解释]
1、对肝素的敏感性：APTT常用于肝素治疗的监测，通常以患者APTT与正常血浆APTT的比率在1.5～2.5作为治疗控制范围：但不同的试剂/仪器系统对肝素的敏感性不同。其试剂/仪器系统对肝素的敏感性可进行测定。体外的敏感性（in vitro sensitlvity）是指将临床在使用的同类型钓肝素按其治疗浓度，加到正常血浆中，测定APTT。体外敏感性与体内敏感性（in vivo sensitivity）不等同，但可作参考。
2、浪疮抗凝因子：狼疮抗凝因子是一种抗磷脂的自身抗体，由于它抗凝血的重要成分磷脂，故能干扰凝血。血中如存在狼疮抗凝因子，APTT将延长。但APTT试剂对狼疮抗疑因子的敏感性有很大差别，试剂制造厂家应提供足够的说明，有关的国家机构也可提供对狼疮抗凝因子的资抖。但要知道，病人个体之间也有很大差异，没有一种试剂能测出所有狼疮抗凝因子。

四、纤维蛋白原测定（Fg）的标准化
（一）纤维蛋白原测定（Fg）的标准化问题
纤维蛋白原（死）由肝合成，存在于血浆和体液中，其结构和功能基本已搞清，但迄今仍无理想的临床检测方法；文献报道的测定方法多至10余种，有的精密度、准确信较好，但过于复杂、烦琐；有的虽然简便、快速，但精密度、准确性较差。
1992年，英国国家生物标准及控制研究所（NIBSC）、研究完成了一个纤维蛋白原标准品，编号为89/644，向WHO的生物标准专家委员会（ECBS）推荐，[15]并被ECBC批准为国际参考品（IRP）。从此，各国均引进这一标准品来标化本国或厂家生产的次极标准品（我国卫生部临床检验中心亦已在引进）。使纤维蛋白原测定的标准化工作，走出了关键的一步。因此根据调查，各家标准品纤维蛋白原含量差别很大。

（二）纤维蛋白原（Fg）测定的推荐方法
各家用IRP来标化自己的标准时，推荐采用Jacobsson的改良法，现将该法介绍如下。

[试剂]
1、缓冲液：Na2O·2H2O 0.882g；KH2PO4 2.77gl升，此为贮存缓冲液；将贮存缓冲液l份，加生理盐水2份即为应用缓冲液，pH为6.35。
2、生理盐水：0.15mol/L
3、人或牛凝血酶：500IU/mL，生理盐水溶液。
4、凝块溶解剂：尿素400g溶于少量蒸溜水中，200mL 1.Omol/L NaOH，再加水至l升。

[操作步骤]
将纤维蛋白原冻干（标准）品（源于89/644）加lmL蒸馏水复溶，加到含有2mL应用缓冲液的有机玻璃浅盘或其他容器中，再加入凝血酶液50μL，迅速混匀，在室温中静制置2小时。将容器倒扣于吸水的布上（其下可垫吸水纸），再用适当物质（加滤纸）将凝块吸干。将凝块取下，置于5OmL生理盐水中洗涤2次，每次洗涤后均应将凝块吸干（可用玻璃挤压凝块），尽量除去含于凝块中的液体，以免液体中的其它血浆蛋白残留。必要时可在清洁棉布上挤压。
小心将凝块加人含凝块溶解剂7.5mL的容器中，摇匀，直至凝块完全溶解。倒人光径为1cm的比色杯中，以凝块溶解剂为空白，在280nm和315nm波长读取吸光度（A）。

（三）适用的纤维蛋白原（Fg）测定（Clauss法）

[原理]
将凝血酶加到血浆中，使纤维蛋白原变成纤维蛋白，血浆便出现凝固。在有足量的凝血酶时，与不同含量的纤维蛋白原作用，其出现血浆凝固的时间与纤维蛋白原含量呈负相关。

[试剂]
1、牛凝血酶l00NIHU/mL
2、纤维蛋白原标准品（IRP次级标准）
3、缓冲液（下列两种任选一种）：
（1）巴比妥缓冲液（PH7.5）；巴比妥2.5g，巴比妥钠2.75g，璐氯化钠7.3g溶于750mL去离子水中，校正至PH7.5，加水至1L。
（2）咪唑（Imidazole，或Glyoxaline）缓冲液：咪唑3.4g（0.05mol/L），氯化钠5.85g，加于约500mL水中；加O.1mol/L盐酸186mL，调PH至7.3-7.4，最后加蒸馏水至1升。

[操作步骤]
1、手工法
（1）用上述缓冲液先将标准品稀释成0.8，1.6，2.4，和4.0g/L纤维蛋白原浓度，各浓度再用缓冲液作1:10稀释。
（2）患者血浆及质控物用缓冲液作1:10稀释。
（3）将含100NIHU/mL，牛凝血酶，混匀后室温保存。如用仪器法测定，则用100NIHU/mL，牛凝血酶，不必稀释。
（4）在一试管中，加稀释血浆0.2mL，置37℃水浴中4分钟。
（5）加入预温37℃的lOONIHU/mL凝血酶液O.2mL，摇匀并立即开动秒表，不断观察凝固时间。至出现凝固时停表。
（6）每份标本测定两次，求平均数。同时测定各标准管和对照（质控）管，方法相同，准确记录时间。
（7）计算：用双对数纸作图，以凝固时间为纵坐际、纤维蛋白原浓度为横坐标，将各相应浓度的标准管对凝固时间，在图上标出相应的点并连成直线，制成标准曲线。然后根据患者和质控血浆所测得的凝固时间。在图上查到纤维蛋白原含量。
如血浆纤维蛋白原含量大于4g/L，应稀释血浆后重测，结果乘以稀释倍数。如血浆纤维蛋白原含量低于O.8g/L，需将原血浆改为1:2或1:5稀释，在标准曲线上查得结果后除以5或除以2。
2.仪器法：本法可用自动或半自动凝血仪按凝血酶时间（TT）测定法测定。可自动打印出结果。一般仪器法比手工法精密度高。

B. 血凝仪的测定方法

光学法血凝仪是根据血浆凝固过程中浊度的变化来测定凝血功能。根据仪器不同的光学测量原理，又可分为散射比浊法和透射比浊法两类。
散射比浊法是根据待验样品在凝固过程中散射光的变化来确定检测终点的。在该方法中检测通道的单色光源与光探测器呈90°直角，当向样品中加入凝血激活剂后，随样品中纤维蛋白凝块的形成过程，样品的散射光强度逐步增加。当样品完全凝固以后，散射光的强度不再变化，通常是把凝固的起始点作为0%，凝固终点作为100%，把50%作为凝固时间。光探测器接收这一光学的变化，将其转化为电信号，经过放大再被传送到监测器上进行处理，描出凝固曲线。
透射比浊法，是根据待测样品在凝固过程中吸光度变化来确定凝固终点的、与散射比浊法不同的是该方法的光路同一般的比色法一样呈直线安排：来自光源的光线经过处理后变成平行光，透过待测样品后照射到光电管变成电信号，经过放大后监测处理。当向样品中加入凝血激活剂后，开始的吸光度非常弱，随着反应管中纤维蛋白凝块的形成，标本吸光度也逐渐增强，当凝块完全角成后，吸光度趋于恒定。血凝仪可以自动描绘吸光度的变化曲线并设定其中某一点对应的时间为凝固时间。 磁珠法是根据血浆凝固过程中粘度的变化来测量凝血功能的。根据仪器对磁珠运动测量原理的不同，又可分为光电探测法和电磁珠探测法。
光电探测法，在磁珠法中光电探测器的作用与光学法中不同，它只测量血浆凝固过程中磁珠的运动规律，与血浆的浊度无关。在磁珠法中的一对电磁铁安放在测试杯的两端，它们产生恒定的交替磁场使磁珠在测试杯中摆动，在与磁珠摆动的垂直方向安放一对光电接收装置，当磁珠摆幅衰减到50%时确定凝固终点。
光电探测法中还有一种利用红外光反射监测器监测磁珠运动的，下面介绍BE系列半自动血凝仪中将另加介绍。
电磁探测法又可称为双磁路磁珠法，其中一对磁路用于吸引磁珠摆动，另一对磁路利用磁珠摆动过程中对磁力线的切割所产生的电信号，对磁珠摆动幅读度进行监控，当磁珠摆动幅度衰减到50%确定凝固终点。 目前市售的半自动血凝仪主要由样品、试剂预温槽、加样器、检测系统（光学、磁场）及微机组成。有的半自动仪器还配备了发色检测通道，使该类仪器同时具备了检测抗凝及纤维蛋白溶解系统活性的功能。针对光学式半自动血凝仪受人为的因素影响多、重复性较差等缺陷，仪器中应有自动计时装置，以告知预温时间和最佳试剂添加时间；在测试位添加了试剂感应器，后者感应从移液器针头滴下的试剂后自动振动，使反应过程中血浆与试剂得以很好地混合；此外，该类仪器在测试杯顶部安装了移液器导板，在添加试剂时由导板来固定移液器针头，从而保证了每次均可以在固定的最佳的角度添加试剂并可以防止气泡产生。这一系列改进，提高了光学式半自动血凝仪检测的准确性。
一般半自动血凝仪都可进行凝固法测试，而需要用其它测试方法实现的凝血项目则可用生化分析仪、酶标仪等进行。 该类仪器的基本构成包括：样品传送及处理装置、试剂冷藏位、样品及试剂分配系统、检测系统、电子计算机、输出设备及附件等。
1. 样品传送及处理装置：一般血浆样品由传送装置依此向吸样针位置移动，多数仪器还设置了急诊位置，可以使常规标本检测必要时暂停以服从免疫比浊法将被检物与其相应抗体混合形成复合物，而产生足够大的沉淀颗粒，通过透射比法或散射比浊进行测定。此法操作简便，准确性好，便于自动化。
2. 试剂冷藏位：为避免试剂的变质，仪器往往有试剂冷藏功能，一般同时可以放置几十种试剂进行冷藏。
3. 样品及试剂分配系统：样品臂会自动提起标本盘中的测试杯，将其置于样品预温槽中进行预温。然后试剂臂将试剂注入测试杯中（性能优越的全自动血凝仪为避免凝血酶对其他检测试剂的污染，有独立的凝血酶吸样针），带有旋涡混合器的装置将试剂与样品进行充分混合后将送至测试位，经检测的测试杯被该装置自动丢弃于特设的废物箱中。
4．检测系统：这是涉及仪器测量原理的关键部分。检测血浆的凝固可以通过凝固反应检测法检测，即当纤维蛋白凝块形成时，检测散射光在660nm处浑浊液吸光度的变化；或通过凝固点检测法检测，即计算达到预先设定好的吸光度值时的凝固时间；而磁珠法则是通过测定在一定磁场强度下小钢珠的摆动幅度变化来测定血浆凝固点。发色底物法及免疫法是检测反应液在405nm、575nm及800nm时的吸光度变化来反映被检测物质的活性。
5. 电子计算机：根据设定的程序计算机指挥血凝仪进行工作并将检测得到的数据进行分析处理，最终得到测试结果。计算机尚可对患者的检验结果进行储存，记忆操作过程中的各种失误，及进行质量有关的工作。
6. 输出设备：通过计算机屏幕或打印机输出测试结果。
7. 附件：主要有系统附件、穿盖系统、条码扫描仪、阳性样品分析扫描仪等。

C. 医学检验，APTT、T T、PT、分别是用什么检测的

凝血功能套餐不止PT、TT、APTT还有FIB有些大医院还要加一项国际敏感度指数（international sensitivity index,ISI）,以确保PT的标准化。测定方法有很多：手工法，半自动，全自动，所需方法还要和当下条件相符才行，有专卖试剂的厂家，像亚中啊，金域啊，多得很，有官方网址，网络上可以查到的~以下所说，仅供参考： 凝血酶原时间（PT）的推荐方法

[原理]
将组织凝血活酶（主要含组织因子和脂质）和钙离子，加到枸橼酸抗凝血浆中，在37℃保温，测定血浆凝固时间，即为PT。PT主要用于筛选检测外源凝血系统的因子Ⅶ、Ⅱ、Ⅴ、Ⅹ和相关因子的抑制物的试验。

[标本来集和处理]
1、标本采集：用硅化或塑料注射器抽取空腹静脉血，按9:1比例加入含0.109mol/L的枸橼酸钠抗凝剂的硅化或塑料试管中，轻轻混合均匀。
2、标本处理：以2000～2500g，离心15分钟，分离乏血小板血浆，并在24小时内完成试验。
3、正常对照血浆：选择正常健康男性和女性各lO名以上，年龄在18～45岁。但不能是妊娠、月经期、哺乳期和口服避孕药的妇女，采取的血浆冰冻干燥保存或-80℃保存。

[试剂]
1、抗凝剂：109mmol/L枸橼酸钠液（相当于含二分子结晶水的枸橼酸钠32g/L）。
2、凝血活酶试剂：市售商品，应标有ISI、批号及有效期。冻干者应按说明书加指定的缓冲稀释剂复溶。
3、氯化钙（CaCl2）溶液：为25mmol/L。（目前有些商品试剂已将凝血活酶液与氯化钙液混合好，可不必另配CaCl2液）。
4、质控物：正常及异常对照血浆
5、配制试剂用水必须符合1级纯水的标准。

[仪器]
1、手工法：秒表，保持37℃±1℃的恒温水浴箱或电热块。水深能浸试管3cm以上，表面无划痕的10×mm拭管。经标准的0.1mL移液管。经校正的秒表。
2、仪器法：各种自动或半自动血凝仪，严格按说明书操作。

[操作步骤]
1、手工法
（1）测定温度36.5～38.5℃，上述各试剂及被测血浆，均应预温至此一温度，但凝血活酶试剂预温不可超过30分钟，血浆预温一般不宜超过10分钟。

（2）所用试管及加样器等接触血浆的器具均为塑料或硅化玻璃管。

（3）吸取枸橼酸抗凝血浆0.1mL，加入一小试管中：加入凝血活酶试剂0.1mL混匀后置37℃水浴中。再加入25mmol/L CaCl2液0.1mL，（也可先将凝血活酶试剂与CaCl2溶液等量混合，加入0.2mL）。立即混匀并开动秒表：试管仍浸于水浴中，至约10秒钟时，自水浴中取出，在纱布上迅速擦去试管外水滴，在明亮处不断倾斜试管，在流动状态下观察有无纤维蛋白形成。一旦见到纤维蛋白（同时将出现液体流动减慢），立即停表，记录时间。每次测定二管，按平均数报告。本试验的最后混合液其pH应为7.2～7.3，大部分商品凝血活酶试剂均用含缓冲液的溶液配制。

（4）每批均同时做正常和异常对照，方法应与测定标本完全相同。

[报告方式]
1、以PT的秒（S）数报告（最接近的0.5秒）
2、以患者血浆（S）/正常对照PT（S）的比率（PRT）报告。
3、在口服华法令类抗凝药物治疗监控时，应报告国际正常化比率（INR）。大部分自动化仪器可根据所测的PTR和凝血活酶试剂的ISI，自动算出INR。手工法可根据下列公式，用一计算器直接计算：

Poller设计了一个简便的列线图，在取得PTR和ISI值后，即可从图上直接查找出INR值，十分便利，国内已有介绍。
ICSH规定，不再用稀释曲线或百分比（活动度）报告。

[参考值]
因仪器/试剂不同，会得出不同结果，故很难统一规定参考值。各实验室应根据自己的仪器、试剂等条件，自行测定一批健康人，建立参考值。此后至少每年或当条件有变化时，根据新的条件，重新建立。参考值PT测定的一切条件均应与患者血浆PT测定相同（包括采血、容器、抗凝剂等）。健康供血者应选至少20个18～55岁的男性和非妊娠、月经期女性，不可服药，在平静休息状态采血、以减少个体差异（有条件时，可测一批老年人和小儿，分开统计）。同时应分开几天采血和测定，以减少天间差异。测定结果经统计学处理，计算标准差：以两个标准差（2SD）或95%可信限作为参考范围。对于三个标准差是正常还是异常，需结合具体情况进行评估。从统计学上讲，其中有些人是正常的。用以上标准，病人（PT异常）则很少会遗漏。

三、活化部分凝血活酶时间(APTT)的标准化
（一）活化部分凝血活酶时间(APTT)的标准化
APTT是检测内源凝血系统诸凝血因子缺陷和相关抑制物的筛选试验，也是当前用于凝血因子、肝素抗凝治疗以及狼疮抗凝物质检测的主要手段。
与PT测定一样，不同的部分凝血活酶、不同的活化剂和不同的激活时间对各种凝血因子缺陷、对肝素和对狼疮抗凝物质的敏感性相差很大。例如，检测APTT的试剂中，所用活化剂（白陶土、硅藻土、鞣花酸）不同，他们对检测肝素、狼疮抗凝物质和因子Ⅷ、Ⅸ的敏感性不同。

迄今，ICSH和ICTH尚未有APTT检测方法标准化或试剂标准化的可行方案问世，仅NCCLS于1992年，提出一个编号为H29-T的暂行方案。

（二）活化的部分凝血活酶时间（APTT）的推荐方法

[原理]
将一种磷脂和激活剂加到血浆中，经过孵育后，加入适当浓度的钙离子。其纤维蛋白凝块形成的时间（以秒计），即为APTT。本法主要用于过筛测定内源途径凝血因子的缺陷，如因子Ⅶ、Ⅺ、Ⅷ、Ⅸ、激肽释放酶原（PK）、高分子量激肽原（HMWK）以及纤维蛋白原等。同时也用于上述因子的抑制物测定、肝素治疗的监测以及狼疮抗凝因子的检查。

[仪器]
本实验所用仪器、设备（包括采血、贮血容器、加样装置和标本的处理等）以及对它们的要求完全与PT相同。PT所用自动化仪器同样适于本实验。

[试剂]
1、部分凝血活酶试剂：由商品供应。一般已与檄活剂按比例配在一起（或分开配制）常用的激活剂由硅藻土（商品名Celite）、白陶土、二氧化硅微粒、鞣化酸（ellagic acid）或其它可用的激活剂，由厂方配套供应。
APTT试剂/仪器结合，应能使因子Ⅷ、Ⅸ或Ⅺ活性低于0.3μ/mL（或＜30%）的血浆，出现异常延长的结果。
2、氯化钙溶液（25mmol/L）以及其它试剂与PT所用者相同。

[操作步骤]
1、样品的采取、贮存、输送与PT测定相同。注意，应用清洁的塑料或硅化玻璃采血器采血及贮血。
2、标本（去血小板的血浆）的制备与PT相同。注意、应用去血小板血浆测定。
3、水浴箱或电热板的温度为37℃±1℃，要经常检查是否正确。
4、接触活化时间：加激活剂活化因子Ⅻ的时间要保持一致；各仪器和试剂生产厂家的规定可能不一样，应严格按说明书要求进行。手工操作时，应用秒表或类似的定时装置计时。
5、操作：预温（不超过30分钟）APTT试剂一份与预温（不超过10分钟）的侍测血浆一份混合，立即开动秒表计时；至规定的接触活化时间终点时，加人预温37℃的CaCl2液一份，混匀，同时开动秒表。至出现血浆凝固时，停表，记录血浆凝固时间（以秒计）。手工测定时应同时测定两管，按平均数报告。一些精密度已有很大改进的自动或半自动凝血仪，如果有适当的质控标准也可只测定一次。应同时测定正常和异常对照血浆。 不好意思TT着实没找到，不过联系到权威厂家，应该就不用自己去找了~

D. 凝血酶原时间(PT) 检测方法及使用的设备和试剂盒名称

这个试剂盒有国产的也有进口的，国产的建议用南京建成生物公司的，很便宜，技术支持也比较到位。
货号：F007 凝血酶原时间(PT)测试盒(2ml*10瓶) 360.00元
也有进口的。比如Human Prothrombin,PT ELISA Kit，RB的，Abnova的。这些都要在生物技术公司代购。
还有一种解决方法是找生物公司帮你们做，也是可以的。
【产品名称】 凝血酶原时间检测试剂盒（凝固法）
【包装规格】 PT试剂：2.0ml×10； PT试剂溶解液：5.0ml×4
【预期用途】 本试剂盒用于体外检测人血浆凝血酶原时间（PT）,以定性筛查外源凝血系统情况。
【主要组成成分】 PT试剂：兔脑粉盐水抽提物（冻干品）； PT试剂溶解液：氯化钙溶液。 【储存条件及有效期】 1.本试剂盒2℃～8℃保存有效期为12个月； 2.复溶试剂2℃～8℃保存有效期为7天； 3.复溶试剂37℃保温稳定8小时。
【适用仪器】 手工法或半自动血凝分析仪。
【样本要求】 静脉采血，1份抗凝剂（0.109mol/L枸橼酸三钠）采集9份全血 ，轻轻颠倒混匀，以2700g（离心半径18cm约3500转/分）离心10分钟，分离血浆待测。如该血浆不能立即分析，应将其密封后于2℃～8℃保存，最长不超过4小时；或立即置－20℃以下冻存不超过一个月；-70℃以下冻存，不超过半年，用时37℃融化，避免反复冻融。
【检验方法】 试剂准备： 1.每瓶PT试剂准确加入2.0ml PT试剂溶解液，轻摇溶解； 2.取适量复溶后PT试剂，置37℃保温。 实验步骤： 1.取待测血浆或正常凝血质控血浆※0.1ml，37℃保温3分钟； 2.迅速加入0.2ml已预温至37℃的PT试剂，混匀，立即计时，记录其凝固时间，即为凝血酶原时间（PT）。） 如采用血凝分析仪测定，请参考仪器使用说明书。 ※ 该正常凝血质控血浆不包含在此试剂盒内。 结果计算： 1.凝血酶原时间秒值（PTs）：即测得的凝固时间（正常或异常血浆样本PTs） 被检血浆PTs 2. PT比值（PTR）= ────────── 正常凝血质控血浆PTs 3. 国际标准化比值（INR）= PTRISI
【参考范围】 1.以PTs值表示：10～15秒。 2.以PTR表示：0.95～1.24。 3 监测口服抗凝剂，以INR表示。 注：上值仅供参考，建议各实验室建立自己的参考值范围。试剂、仪器操作、血样收集技术或抗凝剂改变时，都应重新建立新的参考值范围。
【检验结果的解释】 1.与正常凝血质控血浆PTs值比较，超过3秒以上为异常。 2.PTR值超出0.95～1.24的范围为异常。 3.监测口服抗凝剂，以INR表示。
【注意事项】 1.本品仅用于体外诊断。 2.抽血要顺利，抗凝要充分，不能有血凝块；分离血浆时，务必去除血小板。 3.保温温度控制在37±0.5℃，过高或过低均会影响测定结果。 4.样品收集时不宜用EDTA、肝素或草酸盐作抗凝剂。 5.手工测定时，观察凝固的光线要充足。 6.抗凝剂的比例应准确，如果血球压积小于20%或大于55%，则需调整血样与抗凝剂的比例，方法是：0.00185×全血毫升数×（100－压积）= 抗凝剂毫升数。 7.防止试剂被任何痕迹量的血浆污染。 8.不要测试质量可疑的样品血浆。因为很小的血浆凝固会使凝固时间显着缩短（所有凝血因子已被激活），而广泛凝固又会因凝血因子和纤维蛋白原的消耗延长凝固时间。 9.凝血酶抑制剂出现在样品中可能导致该样品凝血酶原时间延长。 10.使用者若不慎将试剂溅在皮肤或眼睛上，应立即用水冲洗。