透射电镜使用方法

⑴ 如何利用电镜技术测定病毒粒体的特征

随着科学的发展，电镜已成为一种综合的分析仪器，在植物病毒的诊断和鉴定中发挥着重要作用。植物病毒学上用得较多的是透射电镜。

1 透射电镜的成像原理

显微镜的分辨率与其使用光源的波长呈负相关，即波长越短分辨本领越大。可见光的波长范围为0.4～0.7μm，它决定了光镜的分辨极限为0.2μm，有效放大倍数不能超过2000倍。电镜用的光源为电子枪产生的高速电子束，其波长比可见光短十万倍以上，因而大大地提高了分辨率。电镜分辨率接近0.lnm，有效放大倍数在百万倍以上。

在电子显微镜下可观察病毒粒体外形、大小以及在寄主细胞中的位置等。植物病毒粒子常见的有球形、长杆状、线形和弹状。

2 制样技术

样品处理技术多种多样，适用于不同的材料和观察目的。如金属投影和复型技术，主要用于病毒或其他大分子的表面结构和大小观察；冰冻蚀刻用于细胞化学、生物膜等研究；另外还有放射自显影电镜技术、免疫电镜技术等。而植物病毒学上广泛应用的是负染技术和超薄切片技术。负染制样操作简单，所需时间少；而超薄切片制样方法操作复杂，所需时间长，但这种方法可以观察到病毒粒子在组织中的情况。

2.1 负染技术

负染是相对正染而言的。是指在样品的周围包被高电子密度的染料，背景呈深色，而样品呈白色，反衬出样品的轮廓。病毒负染后能很清楚地看到其大小和细微结构。此法简便、易行、快速，为病毒诊断提供了一种可靠手段。现在鉴定病毒，一般先用病汁液做负染观察，根据看到的病毒的大小和形状等，能为进一步研究提供许多有用信息，如采用什么方法提纯、病毒的分类地位如何等。其中有六个病毒属的形态特征非常典型，几乎可以凭此特征就能确定它们属于哪个病毒科、属，见表1。

表1 六个典型特征病毒属

pH调节用1mol/L HCl或1mol/L NaOH，而钼酸铵用醋酸铵调，甲酸铀用氢氧化铵调。

强大电子束的轰击，是造成病毒变形和失去结构细节的另一重要原因，观察时要采用尽量低亮度光斑，动作迅速，以减少轰击时间。Forvmor膜等在电子束照射下，容易漂移，这样病毒会被拉长或拉宽，因此，在测量病毒颗粒大小等精确观察时，最好使用碳膜，或在Forvmor膜上加喷一层碳膜。

（5）病毒粒体大小测量 目前病毒学工作者已经注意到，同一病毒的大小不一样，有些甚至相差甚远。这可能是由于不同分离物或不同株系本身就不同，但大部分可能是由于实验误差或方法上的差别造成的。测量病毒大小，一般不宜提纯病毒，而要用病株粗提液。因为病毒在提纯过程中的形态结构，会由于提纯过程中离子环境等的变化和物理因素的影响发生而变化。染色要用两种以上染料，测量病毒颗粒的数量要尽量多，尤其是线状病毒容易断裂，数量应在100个以上。

2.2 超薄切片技术

根据电镜成像原理可知，用于电镜观察样品其厚度要求在数十纳米，而通常单个细胞的厚度在数十微米，比要求厚度大100倍，而徒手切片或用于光镜的切片机，其切片厚度一般在单个细胞水平，所以电镜观察必须做超薄切片。

超薄切片一般程序为：取材—固定—脱水—包埋—切片—染色—电镜观察。

（1）取材 取材要求典型、迅速，机械损伤小。材料切成1mm3大小，离体后1min之内进入固定液。应取不同寄主材料、同一寄主的不同组织和不同接种时期的样品。

（2）固定 是用物理的或化学的方法迅速将细胞杀死，并且尽可能地使保存和固定细胞内各种结构、生物大分子生活时的状态和位置。电镜中常用的固定方法是化学固定。常用四氧化锇、戊二醛、高锰酸钾或重铬酸钾等固定剂。在病毒学中一般采用2%～3%戊二醛—1%～2%四氧化锇（用0.2mol/LPBS，pH7.2配制）双固定法，这样细胞中的多种成分，如蛋白质、脂类、多糖、核酸等，大部分都能固定下来。戊二醛固定12～24h，四氧化锇固定2～4h。戊二醛遇到锇酸会形成沉淀，因此戊二醛固定后一定要用缓冲液充分清洗后再进行四氧化锇固定。固定在超薄切片中很关键，固定液的种类、浓度、pH、渗透压、离子组成、固定时间、温度和方式都与固定的质量密切相关。因此，整个固定过程应该在4℃下进行。固定剂一定要用缓冲液配制。固定好的材料，电镜下细胞内各种膜系统应该完整，没有断裂，双层膜要基本平行，细胞质呈精细颗粒状，没有空白。固定后缓冲液要充分清洗后再进行下面的步骤。

（3）脱水 常用的包埋剂是疏水的，因此包埋前要用既亲水又亲脂的乙醇或丙酮进行脱水。从低浓度到高浓度的脱水剂脱水，最后用绝对无水的脱水剂脱水。

（4）包埋 包埋的目的是增强样品的机械强度，使样品具有一定的机械形状，适于切片机工作；另一个重要作用是进一步固定细胞结构。包埋剂种类很多，有水溶性的，也有脂溶性的。常用的是Epon812等环氧树脂。包埋过程中发生的化学反应，叫聚合过程。聚合过程中实际上发生了两类反应，一类是环氧树脂末端环氧基之间在胺类化合物（如DMP-30）催化下，化合生成长链；另一类是树脂中间的羟基和交联剂（也称固定剂）的酸酐发生反应，生成横向连桥，加固了树脂分子之间的联系。为了增强树脂聚合形成的包埋块的切割性能，常加入一些增塑剂，如树脂、催化剂、固化剂。

（5）切片 准确、熟练地掌握切片机操作技术，包埋块软硬适度，修块好，就能切出要求质量的片子来。这里技巧很重要。

（6）超薄切片的染色 也叫电镜技术的正染色。观察内容不一样，采用染色方法不同，病毒内含体和细胞病理学研究则常用醋酸双氧铀—柠檬酸铅染色法。切片在1%～2%醋酸双氧铀中染色20min，用50%乙醇冲洗后用柠檬酸铅染色30min，0.01mol/L NaOH冲洗。染色的关键是要防止醋酸铀和柠檬酸铅生成沉淀。防止污染的主要措施是防止CO2和柠檬酸铅反应。如用刚制备出的蒸馏水配制染料和冲洗剂，染色时在小室中进行，小室中放入吸收CO2的固体NaOH，防止人呼吸时CO2进入小室中，戴口罩等。染色和冲洗完毕，切片自然干燥后就可以电镜观察。

电子显微镜的出现及各种电镜技术的发展，为植物病毒的直接观察起到了巨大的推动作用，使检疫工作人员能得到受病毒感染的病毒粒子电镜照片以作为直接证据。但电镜观察结果需要和其他方法的检测结果相结合，才能确定病毒的分类地位。这是因为许多病毒都有类似的形态和结构。由于一些植物汁液中病毒浓度过低，在进行常规的电镜观察检测中，很难发现病毒粒子，这样就要求对一些植物病毒进行分离和提纯，以便进行有效的电镜观察和其他理化检测。病毒的分离和提纯主要是采用差速离心、PEG沉淀的方法，进一步的纯化则采用密度梯度离心和柱层析法。为了直接检测植物体内的带毒情况，常采用植物组织的超薄切片和电镜观察进行。超薄切片的电镜观察可以直接用于对植物组织内部的病毒形态、内含体形态、病毒所在的部位、受感染的植物组织发生的病理学变化等进行检查。

⑵ 使用显微镜的方法步骤_显微镜的类型有哪些

显微镜是由一个透镜或几个透镜的组合构成的一种光学仪器，是人类进入原子时代的标志。下面是我为大家整理的几种使用显微镜的 方法 步骤，希望您喜欢。

1安放：显微镜应放在体前偏左，镜筒在前镜臂在后的方向安放好。

2对光：用低倍镜、较大光圈(遮光器上调);眼看目镜，同时调节反光镜;使视野变得明亮。

3放片：观察对象要正对物镜的孔，将玻片夹好之后再调焦。

4调焦：先用低倍镜寻找物象，先降镜筒后升高镜筒，降低镜筒时要在侧面观察是否压片，升高镜筒时正对着目镜寻找物象。把物像移到视野中心，换用高倍镜观察只调节细准焦螺旋，使物象变得清晰。

5观察：两眼睁开，用左眼观察，用右眼画图。

注意事项：

1.必须熟练掌握并严格执行使用规程。

2.取送显微镜时一定要一手握住镜臂，另一手托住底座。显微镜不能倾斜，以免目镜从镜筒上端滑出。取送显微镜时要轻拿轻放。

1.实验时要把显微镜放在桌面上，镜座应距桌沿6～7cm左右，打开底光源开关。

2.转动转换器，使低倍镜头正对载物台上的通光孔。然后用双眼注视目镜内，调整光源强度，把聚光镜上升，把虹彩光圈调至最大，使光线反射到镜简内，这时视野内呈明亮的状态。

3.将所要观察的装片放在载物台上，使被观察的部分位于通光孔的正中央。

4.先用低倍镜观察(物镜10×、目镜10×)。观察之前，先转动粗准焦螺旋，使载物台上升，使物镜逐渐接近切片。需要注意，不能使物镜触及玻片，以防镜头将玻片压碎。并转动粗准焦螺旋，使载物台慢慢下降，不久即可看到玻片中材料的放大物像。

5.如果在视野内看到的物像不符合实验要求(物像偏离视野)，可慢慢移动左右移动尺。移动时应注意玻片移动的方向与视野中看到的物像移动的方向正好相反。如果物像不甚清晰，可以调节细准焦螺旋，直至物像清晰为止。

6.如果进一步使用高倍物镜观察，应在转换高倍物镜之前，把物像中需要放大观察的部分移至视野中央(将低倍物镜转换成高倍物镜观察时，视野中的物像范围缩小了很多)。一般具有正常功能的显微镜，低倍物镜和高倍物镜基本齐焦，在用低倍物镜观察清晰时，换高信物镜应该可以见到物像，但物像不一定很清晰，可以转动细准焦螺旋进行调节。

7.在转换高倍物镜并且看清物像之后，可以根据需要调节光圈或聚光器，使光线符合要求般将低倍物镜换成高倍物镜观察时，视野要稍变暗一些，所以需要调节光线强弱)。

8.观察完毕，应先将物镜镜头从通光孔处移开，然后将显微镜复原。并检查零件有无损伤(特别要注意检查物镜是否沾水，如沾了水要用镜头纸擦净)，检查处理完毕后即可放回原处。

1.右手握住镜臂，左手托住镜座。

2.把显微镜放在实验台上，略偏左(显微镜放在距实验台边缘7厘米左右处)。安装好目镜和物镜。

3.转动转换器，使低倍物镜对准通光孔(物镜的前端与载物台要保持2厘 米的距离)。

4.把一个较大的光圈对准通光孔。左眼注视目镜内(右眼睁开，同时画图)。转动反光镜，使光线通过通光孔反射到镜筒内。通过目镜，可以看到白亮的视野。

5.把所要观察的玻片标本(也可以用印有“6”字的薄纸片制成)放在载物台上，用压片夹压住，标本要正对通光孔的中心。

6.转动粗准焦螺旋，使镜筒缓缓下降，直到物镜接近玻片标本为止(眼睛看着物镜，以免物镜碰到玻片标本)。

7.左眼向目镜内看，同时反方向转动粗准焦螺旋，使镜筒缓缓上升，直到看清物像为止。再略微转动细准焦螺旋，使看到的物像更加清晰。

注意事项：

实验完毕，把显微镜的外表擦拭干净。转动转换器，把两个物镜偏到两旁，并将镜筒缓缓下降到最低处。最后把显微镜放进镜箱里，送回原处。

显微镜以显微原理进行分类可分为偏光显微镜、光学显微镜与电子显微镜和数码显微镜。

偏光显微镜

偏光显微镜(Polarizing microscope)是用于研究所谓透明与不透明各向异性材料的一种显微镜，在地质学等理工科专业中有重要应用。凡具有双折射的物质，在偏光显微镜下就能分辨的清楚，当然这些物质也可用染色法来进行观察，但有些则不可用，而必须利用偏光显微镜。反射偏光显微镜是利用光的偏振特性对具有双折射性物质进行研究鉴定的必备仪器， 可供广大用户做单偏光观察，正交偏光观察，锥光观察。

光学显微镜

通常皆由光学部分、照明部分和机械部分组成。无疑光学部分是最为关键的，它由目镜和物镜组成。早于1590年，荷兰和意大利的眼镜制造者已经造出类似显微镜的放大仪器。光学显微镜的种类很多，主要有明视野显微镜(普通光学显微镜)、暗视野显微镜、荧光显微镜、相差显微镜、激光扫描共聚焦显微镜、偏光显微镜、微分干涉差显微镜、倒置显微镜。

电子显微镜

电子显微镜有与光学显微镜相似的基本结构特征，但它有着比光学显微镜高得多的对物体的放大及分辨本领，它将电子流作为一种新的光源，使物体成像。自1938年Ruska发明第一台透射电子显微镜至今，除了透射电镜本身的性能不断的提高外，还发展了其他多种类型的电镜。如扫描电镜、分析电镜、超高压电镜等。结合各种电镜样品制备技术，可对样品进行多方面的结构 或结构与功能关系的深入研究。显微镜被用来观察微小物体的图像。常用于生物、医药及微小粒子的观测。电子显微镜可把物体放大到200万倍。

台式显微镜,主要是指传统式的显微镜,是纯光学放大，其放大倍率较高，成像质量较好，但一般体积较大,不便于移动,多应用于实验室内,不便外出或现场检测。

便携式显微镜

便携式显微镜,主要是近几年发展出来的数码显微镜与视频显微镜系列的延伸。和传统光学放大不同,手持式显微镜都是数码放大,其一般追求便携,小巧而精致,便于携带;且有的手持式显微镜有自己的屏幕,可脱离电脑主机独立成像,操作方便,还可集成一些数码功能,如支持拍照,录像,或图像对比,测量等功能。

⑶ 透射电镜和扫描电镜的特点及应用（越全越好）

1、透射电子显微镜电子束的波长要比可见光和紫外光短得多，并且电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比，也就是说电压越高波长越短。

透射电子显微镜在材料科学、生物学上应用较多。由于电子易散射或被物体吸收，故穿透力低，样品的密度、厚度等都会影响到最后的成像质量，必须制备更薄的超薄切片，通常为50～100nm。所以用透射电子显微镜观察时的样品需要处理得很薄。

常用的方法有：超薄切片法、冷冻超薄切片法、冷冻蚀刻法、冷冻断裂法等。对于液体样品，通常是挂预处理过的铜网上进行观察。

2、扫描电镜的特点：有较高的放大倍数，2-20万倍之间连续可调；有很大的景深，视野大，成像富有立体感，可直接观察各种试样凹凸不平表面的细微结构；试样制备简单。

生物：种子、花粉、细菌；

医学：血球、病毒；

动物：大肠、绒毛、细胞、纤维；

材料：陶瓷、高分子、粉末、金属、金属夹杂物、环氧树脂；

化学、物理、地质、冶金、矿物、污泥（杆菌）、机械、电机及导电性样品，如半导体(IC、线宽量测、断面、结构观察）电子材料等。

(3)透射电镜使用方法扩展阅读

透射电镜的总体工作原理是：由电子枪发射出来的电子束，在真空通道中沿着镜体光轴穿越聚光镜，通过聚光镜将之会聚成一束尖细、明亮而又均匀的光斑，照射在样品室内的样品上；透过样品后的电子束携带有样品内部的结构信息，样品内致密处透过的电子量少，稀疏处透过的电子量多；

经过物镜的会聚调焦和初级放大后，电子束进入下级的中间透镜和第1、第2投影镜进行综合放大成像，最终被放大了的电子影像投射在观察室内的荧光屏板上；荧光屏将电子影像转化为可见光影像以供使用者观察。

扫描电子显微镜的制造依据是电子与物质的相互作用。扫描电镜从原理上讲就是利用聚焦得非常细的高能电子束在试样上扫描，激发出各种物理信息。通过对这些信息的接收、放大和显示成像，获得测试试样表面形貌的观察。