DNA的提取常用的方法

Ⅰ 提取基因组的方法

提取基因组DNA和细胞核DNA是不同的方法
提取细胞核要先把细胞破碎分离出细胞核，要在甘油或其他保护剂中进行
SDS十二烷基磺酸钠：可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离
CATB是一种抽提液，破坏细胞膜的~具体忘了~
DNA不溶于异丙醇，异丙醇可以析出DNA，产生白色絮状沉淀，用枪头挑出就可以了
以下是一些具体方法，希望有用
基因组DNA提取方法

制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。主要是CTAB方法，其他的方法还有1物理方式:玻璃珠法,超声波法,研磨法,冻融法。2化学方式：异硫氰酸胍法,碱裂解法3生物方式:酶法。根据核酸分离纯化方式的不同有:硅质材料、阴离子交换树脂等

试验步骤：

1、贴壁细胞用胰酶消化，离心收集。

2、细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次，离心收集。试验步骤2再重新作一边。

3、加入5mlDNA提取缓冲液，(10mmol/LTris-cl,0.1mol/LEDTA,o.5%SDS),混匀。

4、加入25ul蛋白酶K,使终浓度达到100ug/ml,混匀，50℃水浴3h,

5、用等体积的酚抽提一次，2500rpm离心收集水相，用等体积的（酚，氯仿，异戊醇）混合物抽提一次，2500r/min离心收集水相

6、用等体积的氯仿，异戊醇抽提一次。加入等体积的5mol/L的LiCL,混匀，冰浴，10min.。

7、2500rpm离心10min.转上清于一离心管中。加入等体积的异丙醇。室温10min。

2500rpm,离心10min。弃上清。

8、加入0.1倍体积3mol/L乙酸钠(PH5.2)与2倍体积-20℃预冷无水乙醇。-20℃20min。

9、12000r/min,室温离心5min。弃上清。将DNA溶于适量TE中。

外周血DNA提取技术

分离外周血白细胞提取方法：

试验步骤：

1、取人肘静脉血5ml，EDTA抗凝，2500rpm离心10min。

2、小心吸取上层血浆，分装到3个0.5ml离心管中。

3、在血细胞中加入3倍体积的溶血液，摇匀，冰浴15min。

4、2500rpm离心10min，弃上清。

5、加入10ml溶血液，摇匀，冰浴15min。

6、3000rpm离心10min，弃上清。

7、倒置离心管，去掉残液。

8、得白细胞，－80?C冻存。

试验要求：

血至分离白细胞之间隔时间在室温下放置不超过2h，4℃放置不超过5h，以防白细胞自溶。

氯仿法抽提外周血白细胞基因组DNA：

试验试剂：

Ligsisbuffer：

133mMNH4ClNHCl7.12g0.9mMNH4HCO3NH4HCO30.071g0.1mMEDTA0.5mMEDTA0.2ml；最后加灭菌去离子水至1000ml，高压灭菌。

ACD抗凝剂：柠檬酸1.68g柠檬酸钠4.62g葡萄糖5.15g；最后加灭菌去离子水至350ml，高压灭菌。

提取缓冲液（Extractionbuffer）：

10mMTrisCl(PH=8.0)1MTris.Cl(PH=8.0)1ml0.1mMEDTA(PH=8.0)0.5mMEDTA(PH=8.0)20ml0.5%SDS10%SDS0.5ml；最后加灭菌去离子水至100ml，高压灭菌

试验步骤：

1、在500μl抗凝血中加入ligsisbuffer1000μl，充分颠混至清亮。以4000rpm，离心5min。弃上清液。

2、沉淀中加入ligsisbuffer1500μl，充分匀浆。以6000rpm，离心5min。

3、彻底弃去上清，加入extractionbuffer500μl（裂解细胞），混匀置于37℃，水溶1h。

4、加入8μl的蛋白酶K，颠混，37℃过夜（或55℃，3h，但是37℃效果要好些）。

5、每管加入450μl饱和酚（取溶液下层）缓慢摇晃10min，以5500rpm，离心15min。

6、取上清，每管加入250μl饱和酚和250μl氯仿－异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。

7、取上清，每管加入500μl氯仿－异戊醇，摇匀10min，以5500rpm，离心15min。

8、取上清，每管加50μl的3M的NaAC＋，适量无水乙醇（预冷）至满，摇匀放入-20℃保存2h以上。

9、以12000rpm，离心20min。去上清，加入70％乙醇500μl，以12000rpm，离心5min，去上清，50－60℃干燥。

10、加入50μl灭菌去离子水，转弹，混匀。

NaI提取法提取外周血白细胞基因组：

实验步骤：

1、取外周抗凝血（全血）100ul于eppendorf管中，12000rpm离心12min。

2、弃上清，加双蒸水200ul溶解，摇匀20s。

3、混匀后加6MNaI溶液200ul，摇匀20s。

4、加入氯仿/异戊醇（24：1）400ul，边加边摇，摇匀20s，12000rpm离心12min。

5、取上层液350ul，加入另一新eppendorf管中，加0.6倍体积异丙醇，摇匀20s，室温放置15min，静置后的反应体系15000rpm离心12min，使沉淀紧贴eppendorf管壁。

6、弃异丙醇，加70％乙醇1ml（不振动），以15000rpm离心12min。

7、弃乙醇，敞开eppendorf管盖，烘干（37℃恒温箱）后，加1xTE溶液30ul，溶解DNA＞12h以上，制成的DNA液-20℃冰箱保存备用。

常用的外周血白细胞基因提取方法：

试验原理：

苯酚/氯仿提取DNA是利用酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性，SDS(十二烷基磺酸钠)将细胞膜裂解，在蛋白酶K、EDTA的存在下消化蛋白质或多肽或小肽分子，核蛋白变性降解，使DNA从核蛋白中游离出来。DNA易溶于水，不溶于有机溶剂。蛋白质分子表面带有亲水基团，也容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能顺利地进入到水溶液中形成稳定的胶体溶液。当有机溶液存在时，蛋白质的这种胶体稳定性遭到破坏，变性沉淀。离心后有机溶剂在试管底层(有机相)，DNA存在于上层水相中，蛋白质则沉淀于两相之间。酚-氯仿抽提的作用是除去未消化的蛋白质。氯仿的作用是有助于水相与有机相分离和除去DNA溶液中的酚。抽提后的DNA溶液用2倍体积的无水乙醇在1/103mol/LNaCl存在下沉淀DNA，回收DNA用70%乙醇洗去DNA沉淀中的盐，真空干燥，用TE缓冲液溶解DNA备用。

试验步骤：

1、将1mlEDTA抗凝贮冻血液于室温解冻后移入5ml离心管中，加入1ml磷酸缓冲盐溶液（PBS），混匀，3500rpm离心15min,倾去含裂解红细胞的上清。重复一次。用0.7mlDNA提取液混悬白细胞沉淀，37℃水浴温育1h。

2、将上述DNA提取液混悬白细胞，37℃水浴温育1h后，加入1mg/ml蛋白酶K0.2ml,至终浓度为100-200ug/ml,上下转动混匀，液体变粘稠。50℃水浴保温3h，裂解细胞，消化蛋白。保温过程中，应不时上下转动几次，混匀反应液。

3、反应液冷却至室温后，加入等体积的饱和酚溶液，温和地上下转动离心管5-10min，直至水相与酚相混匀成乳状液。5000rpm离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复酚抽提一次。加等体积的氯仿：异戊醇（24：1），上下转动混匀，5000rpm离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复一次。

4、加入1/5体积的3mol/LNaAc及2倍体积的预冷的无水乙醇，室温下慢慢摇动离心管，即有乳白色云絮状DNA出现。用玻璃棒小心挑取云絮状的DNA，转入另一1.5ml离心管中，加70%乙醇0.2ml，以5000rpm离心5min。洗涤DNA，弃上清，去除残留的盐。重复一次。室温挥发残留的乙醇，但不要让DNA完全干燥。加TE液20ul溶解DNA,置于摇床平台缓慢摇动，DNA完全溶解通常需12-24h。制成的DNA液-20℃冰箱保存备用。

真核细胞DNA的制备

一般真核细胞基因组DNA有107-9bp，可以从新鲜组织、培养细胞或低温保存的组织细胞中提取，常是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提而实现的。这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析，还可用于PCR的模板、文库构建等实验。

根据材料来源不同，采取不同的材料处理方法，而后的DNA提取方法大体类似，但都应考虑以下两个原则：

1、防止和抑制DNase对DNA的降解。

2、尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏。

试剂准备：

1、TE:10mMTris-HCl(pH7.8);1mMEDTA(pH8.0)。

2、TBS:25mMTris-HCl(pH7.4);200mMNaCl;5mMKCl。

3、裂解缓冲液：250mMSDS;使用前加入蛋白酶K至100mg/ml。

4、20%SDS

5、2mg/ml蛋白酶K

6、Tris饱和酚（pH8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿

7、无水乙醇、75%乙醇

试验步骤：

材料处理：

1、新鲜或冰冻组织处理：

1)取组织块0.3-0.5cm3,剪碎，加TE0.5ml，转移到匀浆器中匀浆。

2)将匀浆液转移到1.5ml离心管中。

3)加20%SDS25ml，蛋白酶K(2mg/ml)25ml，混匀。

4)60°C水浴1-3hr。

2、培养细胞处理：

1)将培养细胞悬浮后，用TBS洗涤一次。

2)离心4000g×5min，去除上清液。

3)加10倍体积的裂解缓冲液。

4)50-55°C水浴1-2hr。

DNA提取：

1、加等体积饱和酚至上述样品处理液中，温和、充分混匀3min。

2、离心5000g×10min，取上层水相到另一1.5ml离心管中。

3、加等体积饱和酚，混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。

4、加等体积酚/氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。如水相仍不澄清，可重复此步骤数次。

5、加等体积氯仿，轻轻混匀，离心5000g×10min，取上层水相到另一管中。

6、加1/10体积的3M醋酸钠（pH5.2）和2.5倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀。

7、待絮状物出现后，离心5000g×5min，弃上清液。

8、沉淀用75%乙醇洗涤，离心5000g×3min，弃上清液。

9、室温下挥发乙醇，待沉淀将近透明后加50-100mlTE溶解过夜。

植物组织中DNA的提取

试验原理：

脱氧核糖核酸（deoxribonucleicacid，DNA）是一切生物细胞的重要组成成分，主要存在于细胞核中，盐溶法是提取DNA的常规技术之一。从细胞中分离得到的DNA是与蛋白质结合的DNA，其中还含有大量RNA，即核糖核蛋白。如何有效地将这两种核蛋白分开是技术的关键。DNA不溶于0.14mol/L的NaCl溶液中，而RNA则能溶于0.14mol/L的NaCl溶液之中，利用这一性质就可以将二者从破碎细胞浆液中分开。制备过程中，细胞破碎的同时就有Dnase释放到提取液中，使DNA因被降解而影响得率，在提取缓冲液中加入适量的柠檬酸盐和EDTA，既可抑制酶的活性又可使蛋白质变性而与核酸分离，再加入阴离子去垢剂0.15％的SDS，经过2h搅拌，或用氯仿－异醇除去蛋白，通过离心使蛋白质沉淀而除去，得到的是含有核酸的上清液。然后用95％的预冷乙醇即可把DNA从除去蛋白质的提取液中沉淀出来。

植物DNA的SDS提取法：

试验试剂：

1、研磨缓冲液：称取59.63gNaCl，13.25g柠檬酸三钠，37.2gEDTA－Na分别溶解后合并为一，用0.2mol/L的NaOH调至pH7.0，并定容至1000ml。

2、10×SSC溶液：称取87.66gNaCl和44.12g柠檬酸三钠，分别溶解，一起定容至1000ml。

3、1×SSC溶液：用10×SSC溶液稀释10倍。

4、0.1×SSC溶液：用1×SSC溶液稀释10倍。

5、Rnase溶液：用0.14mol/LNaCl溶液配制成25mg/ml的酶液，用1mol/LHCl，pH至5.0，使用前经80℃水浴处理5min（以破坏可能存在的Dnase）。

6、氯仿－异戊醇：按24ml氯仿和1ml异戊醇混合。

7、5mol/L高氯酸钠溶液：称取NaClO4．H2O70.23g，先加入少量蒸馏水溶解再容至100ml。

8、SDS（十二烷基硫酸钠）化学试剂的重结晶：将SDS放入无水酒精中达到饱和为止，然后在70～80℃的水浴中溶解，趁热过滤，冷却之后即将滤液放入冰箱，待结晶出现再置室温下凉干待用。

9、1mol／LHCl。

10、0.2mol/LNaOH。

11、二苯胺乙醛试剂：1.5g二苯胺溶于100ml冰醋酸中，添加1.5ml浓硫酸，装入棕色瓶，贮存暗处，使用时加0.1ml乙醛液〔浓乙醛：H2O＝1：50（V／V）〕。

12、1.0mol/L高酸溶液（HClO4）。

13、0.05mol/LNaOH。

14、DNA标准液：取标准DNA25mg溶于少量0.05mol.L-1NaOH中，再用0.05mol/LNaOH定容至25ml，后用移溶管吸取此液5ml至50ml容量瓶中，加5.0ml1mol/LHClO4，混合冷却后用0.5mol/LHClO4定容至刻度，则得100μg/ml的标准溶液。

实验步骤：

1、称取植物幼嫩组织10g剪碎置研钵中，加10ml预冷研磨缓冲液并加入0.1g左右的SDS，置冰浴上研磨成糊状。

2、将匀浆无损转入25ml刻度试管中加入等体积的氯仿－异戊醇混合液，加上塞子，剧烈振荡30s，转入离心管，静置片刻以脱除组织蛋白质。以4000rpm离心5min。

3、离心形成三层，小心地吸取上层清液至刻度试管中，弃去中间层的细胞碎片、变性蛋白质及下层的氯仿。

4、将试管置72℃水浴中保温3min（不超过4min），以灭活组织的DNA酶，然后迅速取出试管置冰水浴中冷却到室温，加5mol/L高氯酸钠溶液〔提取液：高氯酸钠溶液＝4：1（V／V）〕，使溶液中高氯酸钠的最终浓度为1mol/L。

5、再次加入等体积氯仿－异戊醇混合液至大试管中，振荡1min，静置后在室温下离心（4000rpm）5min，取上清液置小烧杯中。

6、用滴管吸95％的预冷乙醇，慢慢地加入烧杯中上清液的表面上，直至乙醇的体积为上清液的两倍，用玻璃棒轻轻搅动。此时核酸迅速以纤维状沉淀缠绕在玻璃棒上。

7、然后加入0.5ml左右的10×SSC，使最终浓度为1×SSC。

8、重复第6步骤和第7步骤即得到DNA的粗制品。

9、加入已处理的Rnase溶液，使其最后的作用浓度为50～70μg/ml，并在37℃水浴中保温30min，以除去RNA。

10、加入等体积的氯仿－异戊醇混合液，在三角瓶中振荡1min，再除去残留蛋白质及所加Rnase蛋白，室温下以4000rpm离心5min，收集上层水溶液。

11、再按6、7步骤处理即可得到纯化的DNA液。

植物DNA的CTAB提取法：

试验步骤：

1、称取新鲜叶片2-3g，剪碎放入研钵中，在液氮中研磨成粉末。

2、将粉末转移到加有7ml经预热的15×CTAB提取缓冲液15ml离心管中，迅速混匀后置于65℃水浴中，温育30min。

3、取出离心管,冷却至室温，加入氯仿/异戊醇(24:1)，充分混匀，室温下2300转离心20min。

4、将上清转移至另一新的15ml离心管中，加入1/10体积10%的CTAB和等体积的氯仿/异戊醇。充分混匀，2300rpm离心20min。

5、转移上清至另一新的15ml离心管中，加入等体积1%的CTAB沉淀缓冲液，轻轻摇晃至形成DNA絮状沉淀。1000rpm离心10min，使DNA沉淀于管底。

6、加入1.5-2ml的1mol/LNaCl及5μlRNase置于56℃水浴中过夜。

7、待DNA完全溶解后，加2-3ml4℃预冷的95%的冰乙醇使DNA沉淀，挑出DNA，置于15ml离心管中，用70%乙醇清洗30min。

8、离心机甩5s，倒出70%乙醇，再用95%乙醇浸泡5min，倒出95%乙醇，在超净工作台上吹干。

9、将风干的DNA直接在4℃保存备用或溶于100μlTE溶液中于-20℃保存。

细菌DNA的提取方法

针对一些不易于提取的细菌的方法:

试验试剂：

抽提缓冲液：2%CTAB(W/V)2%PVPK25(w/v)（去色素）100mMTris-HCl(pH8.0)

25mMEDTA(pH8.0)2.0MNaCl

10MLiCl

2MLiCl

DEPC-water（抑制RNA酶活性）

3MNaAc(pH5.2)

96%乙醇

70%乙醇

试验步骤：

1、抽提缓冲液65℃预热。

2、加菌体到已经预热的缓冲液（700ul）中混匀，65℃，10min。

3、加酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），振荡，以12,000rpm，离心10min。

4、取上清，加氯仿/异戊醇（24：1）振荡，以12,000rpm，离心10min。

5、重复再作一次步骤4。

6、加入1/10体积的3M醋酸钠和1.5倍体积的乙醇（或加入等体积的异丙醇），－20C下沉淀。

7、以2,000rpm，离心10min。

8、弃上清，以70％乙醇条洗沉淀，也可以再用100％乙醇洗，然后溶解于100ml水中。

较为常用的细菌DNA提取方法：

实验步骤：

1、将菌株接种于液体LB培养基，37℃震荡培养过夜。

2、取1.5ml培养物12000rpm离心2min。

3、沉淀中加入567ul的TE缓冲液，反复吹打使之重新悬浮，加入30ul10%SDS和15ul的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h.

4、加入100ul5mol/LNaCl,充分混匀，再加入80ulCTAB/NaCl溶液，混匀后再65℃温育10min。

5、加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混匀，离心4-5min,将上清转入一只新管中，加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，沉淀可稍加离心。

6、沉淀用1ml的70%乙醇洗涤后，离心弃乙醇．

真菌DNA提取总结的两种方法：

第一种方法：

试验步骤：

1、取真菌菌丝0.5g,在液氮中迅速研磨成粉。

2、加入4mL提取液，快速振荡混匀。

3、加入等体积的4mL的氯仿:异戊醇(24:1)，涡旋3～5min（此处是粗提没有加酚）。

4、以4℃，1000rpm，离心5min。

5、上清再用等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提一次。以4℃，10,000rpm，离心5min。

6、取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷的异丙醇或2.5倍体积的无水乙醇沉淀,混匀,静置约30min。

7、用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干，重悬于500ulTE中。

8、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37℃下处理1h。

9、用酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次。以4℃，10,000rpm，离心5min。

10、取上清，加入1/10倍体积的3MNaAc,2.5倍体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上。

11、沉淀用75%乙醇漂洗，风干,溶于200ulTE中，-20℃保存备用。

DNA提取液：0.2MTris-HCl（pH7.5），0.5MNaCl，0.01MEDTA，1％SDS，3MNaAc。

第二种方法：

试验步骤：

1、真菌菌丝0.5-1g,在液氮中迅速研磨成粉。

2、加入3mL65℃预热的DNA提取缓冲液，快速振荡混匀65℃水浴30min,期间混匀2-3次。

3、加入1mL5MKAc，冰浴20min。

4、等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次（10,000rpm，4℃离心5min）。

5、取上清，加入2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇,混匀,静置约30min。

6、用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干，重悬于500ulTE中。

7、加入1ulRNaseA（10mg/mL），37℃处理1h。

8、用酚（pH8.0）:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次。以4℃，10,000rpm，离心5min。

9、取上清，1/10V3MNaAc,2.5V体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上。

10、沉淀用75%乙醇漂洗，风干,溶于200ulTE中，-20℃保存备用。
植物基因组提取(CATB法)
作者： 时间：2008-05-13 14:26:27 来源: 生物谷 浏览评论

一、实验目的
掌握植物总DNA的抽提方法和基本原理。学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。
二、实验原理
通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。
十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。
三、实验材料
水稻幼叶
四、主要配方
2% CTAB抽提缓冲溶液: CTAB 4g NaCl 16.364 g 1M Tris-HCl 20ml( PH8.0) 0.5M EDTA 8ml，先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml灭菌, 冷却后0.2-1% 2-巯基乙醇 （400ul） 氯仿-异戊醇（24：1）：先加96ml氯仿，再加4ml异戊醇，摇匀即可。
五、实验步骤
1. DNA的提取
（1） 2%CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热。
（2）取少量叶片（约1g）置于研钵中，用液氮磨至粉状；
（3） 加入700ul的2%CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动；
（4） 将磨碎液分倒入1.5 ml的灭菌中，磨碎液的高度约占管的三分之二；
（5）置于65℃的水浴槽或恒温箱中，每隔10 min轻轻摇动，40 min后取出；
（6）冷却2 min后，加入氯仿-异戊醇（24：1）至满管，剧烈振荡2~3 min，使两者混合均匀；
（7）放入离心机中10 000 rpm离心10 min，与此同时，将600 µl的异丙醇加入另一新的灭菌中；
（8） 10 000 rpm离心1 min后，移液器轻轻地吸取上清夜，转入含有异丙醇的内，将离心管慢慢上下摇动30 sec，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物；
（9）10000 rpm离心1 min后，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上； （10）60 sec后，直立离心管，加入720 µl的75%乙醇及80 µl 5 M的醋酸钠，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中；
（11）放置30 min，使DNA块状物的不纯物溶解；
（12）10000 rpm离心1 min后，倒掉液体，再加入800 µl 75%的乙醇，将DNA再洗 30 min；
（13）10000 rpm离心30 sec后，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺开的纸巾上；数分钟后，直立离心管，干燥DNA（自然风干或用风筒吹干）；
（14）加入50 µl 0.5 × TE(含RNase)缓冲液，使DNA溶解，置于37℃恒温箱约15 h，使RNA消解；
（15）置于-20℃保存、备用。
2. DNA质量检测
琼脂糖电泳检测，原理和方法见实验二。
六、 注意事项
（1）叶片磨得越细越好。
（2）移液器的使用。
（3）由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。

Ⅱ 常用酶的提取方法有哪些并解释提取机理

血中DNA的提取血液中DNA提取的原理：如果以外周血为DNA提取材料,在外周血中提取DNA就是从有核的白细胞中提取DNA.因此,从外周血中提取DNA包括以下几个关键步骤：第一,破坏红细胞,通常利用红细胞与白细胞膜结构的差异,先使红细胞裂解,经离心后收集白细胞；第二,白细胞裂使膜蛋白和核蛋白变性,游离DNA,通常是采用离子型表面活性剂使蛋白质变性；第三,除去变性蛋白质：通常采用蛋白沉淀剂沉淀变性蛋白质,使DNA留在上清液中；第四,在高盐环境下使DNA从有机溶剂如无水乙醇中析出. 取材 取外周血5ml,EDTA抗凝 1.新鲜抗凝血,离心弃去上清液； 2.取出4℃冰箱预冷的ELS裂解液,按1:6-10的比例向细胞沉淀中加入ELS裂解液（1ml细胞压积加入6-10ml裂解液）,轻轻吹打混匀；红细胞裂解液ELS配方： NH4Cl:4.15克加双蒸水500ml,取450ml; Tris:1.0297克加双蒸水50ml,再加上上面的450ml,共计500ml,高压灭菌, 用时加10-20ml 3.800-1000rpm离心5-8分钟,离心弃去上层红色清液； 4.收集沉淀部分,加入Hank’s液或无血清培养液离心洗2-3次； 5.如裂解不完全可重复步骤2和3； 6.重悬细胞,用于后续实验；提取DNA,最好是于步骤4开始使用DEPC水配制的溶液进行. 酚氯仿方法提取DNA 在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素,以保证DNA的完整性,为后续的实验打下基础.是采用在EDTA以及SDS等试剂存在下用蛋白酶K消化细胞,随后用酚抽提而实现的.这一方法获得的DNA不仅经酶切后可用于Southern分析,还可用于PCR的模板、文库构建等实验. 原则：（1）防止和抑制DNase对DNA的降解；（2）尽量减少对溶液中DNA的机械剪切破坏. 一、试剂准备 1．TE: 10mM Tris-HCl (pH 7.8); 1mM EDTA (pH 8.0). 2．TBS: 25mM Tris-HCl (pH 7.4); 200mM NaCl; 5mM KCl. 3．裂解缓冲液：250mM SDS; 使用前加入蛋白酶K至100mg/ml. 4．20% SDS 5．2mg/ml蛋白酶K 6．Tris饱和酚（pH 8.0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿 7．无水乙醇、75%乙醇二、操作步骤（一）材料处理 1．白细胞处理 ⑴ 取红细胞裂解完全后收集的沉淀,加入0.5ml TE ⑵ 将匀浆液转移到1.5ml离心管中. ⑶ 加20% SDS 25 μl,蛋白酶K (2mg/ml) 25 μl,混匀. ⑷ 60°C水浴1-3hr. 2．培养细胞处理： ⑴ 将培养细胞悬浮后,用TBS洗涤一次. ⑵ 离心4000g×5min,去除上清液. ⑶ 加10倍体积的裂解缓冲液. ⑷ 50-55°C水浴1-2hr. （二）DNA提取 1. 加等体积饱和酚至上述样品处理液中,温和、充分混匀3min. 2. 离心5000g×10min,取上层水相到另一1.5ml离心管中. 3. 加等体积饱和酚,混匀,离心5000g×10min,取上层水相到另一管中. 4. 加等体积酚/氯仿,轻轻混匀,离心5000g×10min,取上层水相到另一管中.如水相仍不澄清,可重复此步骤数次. 5. 加等体积氯仿,轻轻混匀,离心5000g×10min,取上层水相到另一管中. 6. 加1/10体积的3M醋酸钠（pH 5.2）和2.5倍体积的无水乙醇,轻轻倒置混匀. 7. 待絮状物出现后,离心5000g×5min,弃上清液. 8. 沉淀用75%乙醇洗涤,离心5000g×3min ,弃上清液. 9. 室温下挥发乙醇,待沉淀将近透明后加50-100ml TE溶解过夜. (三）DNA定量和电泳检测 1.DNA定量： DNA在260nm处有最大的吸收峰,蛋白质在280nm处有最大的吸收峰,盐和小分子则集中在230nm处.因此,可以用260nm波长进行分光测定DNA浓度,OD值为1相当于大约50μg/ml双链DNA.如用1cm光径,用 H2O稀释DNA样品n倍并以H2O为空白对照,根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：DNA（mg/ml）=50×OD260读数×稀释倍数/1000. DNA纯品的OD260/OD280为1.8,故根据OD260/OD280的值可以估计DNA的纯度.若比值较高说明含有RNA,比值较低说明有残余蛋白质存在.OD230/OD260的比值应在0.4-0.5之间,若比值较高说明有残余的盐存在. 2.电泳检测：取1μg基因组DNA用行0.8%琼脂糖凝胶上电泳,检测DNA的完整性,或多个样品的浓度是否相同.电泳结束后在点样孔附近应有单一的高分子量条带. 三、注意事项 1. 所有用品均需要高温高压,以灭活残余的DNA酶. 2. 所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制. 3. 用大口滴管或吸头操作,以尽量减少打断DNA的可能性. 4. 用上述方法提取的DNA纯度可以满足一般实验（如Southern 杂交、PCR等）目的.如要求更高,可参考有关资料进行DNA纯化.

Ⅲ 提取叶绿体色素的常用方法是

（1）用纸层析法分离叶绿体的色素，用萃取法提取胡萝卜素，水蒸气蒸馏法是植物芳香油提取的常用方法．
（2）在DNA的粗提取与鉴定实验中，提取较纯净的DNA利用了DNA不溶于酒精的特点；鉴定DNA可利用二苯胺试剂．
（3）从土壤中分离出尿素分解菌，平板内的固体培养基应以尿素作为唯一的氮源，培养基中加入指示剂酚红，培养后若变红则鉴定其中含有所需细菌．
（4）纯化菌种和统计某活菌的数目，宜采用的接种方法是稀释涂布平板法．该方法统计的菌落数比活菌的数目偏低，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到只是一个菌落．
故答案为：
（1）纸层析法 萃取法 水蒸气蒸馏
（2）不溶于酒精 二苯胺
（3）酚红
（4）稀释涂布平板法 当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到只是一个菌落

Ⅳ 获取目的基因的常用方法是哪种

..刚好学到
基因工程流程的第一步就是获得目的DNA片段,如何获得目的DNA片段就成为基因工程的关键问题。所需目的基因的来源,不外乎是分离自然存在的基因或人工合成基因。常用的方法有PCR法、化学合成法、cDNA法及建立基因文库的方法来筛选

直接获取
1.从基因文库中获取 这个没什么就是现成的基因储存在受体菌上你用的时候提取出来就好了（基因组文库法 就是原教材中的用限制性内切酶直接获取。利用λ噬菌体载体构建基因组文库的一般操作程序如下：① 选用特定限制性内切酶， DNA进行部分酶解，得到DNA限制性片段② 选用适当的限制性内切酶酶解λ噬菌体载体DNA。③ 经适当处理，将基因组DNA限制性片段与λ噬菌体载体进行体外重组。④ 利用体外包装系统将重组体包装成完整的颗粒。⑤ 以重组噬菌体颗粒侵染大肠杆菌，形成大量噬菌斑，从而形成含有整个DNA的重组DNA群体，即文库。）经典解释
2.cDNA文库法（即原教材中提到的逆转录法）。cDNA文库，是指汇集以某生物成熟mRNA为模板逆转录而成的cDNA序列的重组DNA群体。虽然可用基因组文库法来获取真核生物的目的基因，但是由于高等真核生物基因组DNA文库比其cDNA文库大得多，相关工作量同样大得多。更为重要的是，在真核生物基因组中合有大量的间隔序列或内含子，但在大肠杆菌等原核生物中没有类似序列的存在，所以大肠杆菌不能从真核生物基因的初级转录本中去除间隔序列，即不能表达真核生物DNA。而在真核生物成熟mRNA中已不存在间隔序列（已在拼接过程中被去除），所以可以以真核生物成熟mRNA为模板，逆转录而成的cDNA可被大肠杆菌表达。因此，在基因工程中，cDNA文库法是从真核生物细胞中分离目的基因的常用方法。
3.直接分离基因最常用的方法是“鸟枪法”，又叫“散弹射击法”。这种方法有如用猎枪发射的散弹打鸟，无论哪一颗弹粒击中目标，都能把鸟打下来。鸟枪法的具体做法是：用限制酶（即限制性内切酶）将供体细胞中的DNA切成许多片段，将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞所提供的DNA（外源DNA）的所有片段分别在受体细胞中大量复制（在遗传学中叫做扩增），从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法吧带有目的基因的DNA片段分离出来。如许多抗虫，抗病毒的基因都可以用上述方法获得。

用“鸟枪法”获取目的基因的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性。

人工合成
1.(主要是序列已知的基因)。主要是通过DNA自动合成仪，通过固相亚磷酸酰胺法合成，具体过程可以网上查询，反正是可以按照已知序列将核苷酸一个一个连接上去成为核苷酸序列，一般适于分子较小而不易获得的基因。对于大的基因一般是先用化学合成法合成引物，再利用引物获得目的基因。
2.聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究 的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研 究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑
他只是给目的基因的扩增

好累~....

Ⅳ DNA的提取方法有多少种

DNA的提取方法有7种：酚抽提法、甲酰胺解聚法、玻璃棒缠绕法、异丙醇沉淀法、表面活性剂快速制备法、加热法快速制备、碱变性快速制备。

DNA的提取原则

1、保证核酸一级结构的完整性；

2、核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；

3、其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；

4、其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。

(5)DNA的提取常用的方法扩展阅读

提取DNA的注意事项

1、 各操作步骤要轻柔，尽量减少DNA的人为降解。

2、注意防止非核酸类成分干扰。

3、要减少DNA的降解，促进DNA与蛋白等的分相及DNA沉淀。

4、 提取DNA过程中所用到的试剂和器材要通过高压烤干等办法进行无核酸酶化处理。

5、 所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制。

Ⅵ DNA的提取方法有多少种

dna提取的几种方法 
(1).浓盐法 
利用rnp和dnp在电解溶液中溶解度不同,将二者分离,常用的方法是用1m
氯
纳提取化钠抽提,得到的dnp粘液与含有少量辛醇的
氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间,而dna位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将dna
钠盐沉淀出来.
也可用0.15
mnacl液反复洗涤细胞破碎液除去rnp,再以1mnacl提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白. 
两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些. 
以稀盐酸溶液提取dna
时,加入适量去污剂,如sds可有助于蛋白质与dna
的分离.在提取过程中为抑制组织中的dnase对dna
的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂.通常用.15mnacl,0.015m柠檬钠,并称ssc溶液,提取dna. 
（2）.阴离子去污剂法: 
用sds或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取dna
.由于细胞中dna与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取dna. 
（3）.苯酚抽提法: 
苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了dnase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与dna
联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶.蛋白分子溶于酚相,而dna溶于水相.离心分层后取出水层,多次重复操作,再合并含dna
的水相,利用核酸不溶于醇的性质,用乙醇沉淀dna
.此时dna是十分粘稠的物质,可用玻璃漫漫绕成一团,取出.此法的特点是使提取的dna保持天然状态
. 
（
4）.水抽提法:
利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去rna,然后将沉淀溶于水中,使dna充分溶解于水中,离心后收集上清液.在上清中加入固体氯化钠调节至2.6m.加入2倍体积95%乙醇,立即用搅拌法搅出.然后分别用66%
٠80%和95%乙醇以及丙铜洗涤,最后在空气中干燥,既得dna样品.此法提取的dna中蛋白质含量较高,故一般不用.为除蛋白可将此法加以改良,在提取过程中加入sds.

Ⅶ DNA提取的方法有几种分别是什么，哪种是现在最常用的

关于DNA的提取方法在《分子克隆》一书中有详细介绍，其中最常用的质粒提取方法包括：
SDS碱裂解法制备质粒DNA煮沸裂解法制备质粒DNA牙签法小量制备质粒DNASDS裂解法提取质粒DNA
这其中SDS碱裂解法又是最常使用的提取方法。
当然针对不同组织样品DNA的提取方法是不同的，具体还是要参考《分子克隆》等工具书。
另外，针对不同组织的DNA样品，就是都有很多成熟的试剂盒可以使用。如果不是大批量使用或者经费充足的话，可以考虑购买试剂盒，一般可以提取到更高质量的DNA，并且也可以节约不少自己摸索的时间。

Ⅷ 农杆菌质粒DNA常用的提取方法

一、从在含20 mg/l Kanamycin和15 mg/l Gentamycin 5-8 ml的液体LB培养基中接种Agrobacterium细胞，然后在28℃、200-220 rpm培养24 h。然后进行质粒提取。 二、新鲜配制Sol II溶液（880 l H2O, 100 l SDS 10%, 20 l 10 N NaOH），及包含 4 mg/ml溶菌酶Lysozyme 的200 l Sol I (P1)溶液。 三、对培养一昼夜的的Falcon试管在3600 rpm速度下进行离心12 min，丢弃上清。 四、用200 l 5 M NaCl重悬农杆菌细胞，利用涡旋将农杆菌细胞混匀。转移到Eppendorf管中。 生物帮有相关问题的详细介绍，分子生物学洗涤剂 http://proct.bio1000.com/101184/

Ⅸ DNA的提取如何进行以及最常见的方法

提取DNA主要有SDS和CTAB法，其实提取效果的好坏主要看提取的对象是什么样的材料，在提取之前一定要好好分析材料的特性，然后在设计实验步骤。
一）CTAB法
CTAB是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7
mol/L
NaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3
mol/L
NaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白质、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇。
（二）SDS法
利用高浓度的SDS，在较高温度（55—65℃）条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的做法使蛋白质及多糖杂质沉淀（最常用的是加入5M的KAc于冰上保温，在低温条件下KAc与蛋白质及多糖结合成不溶物），离心除去沉淀后，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。
以下是在提取热带水果DNA时设计的两种不同方法步骤，对比起来CTAB法好，在禾本科植物效果差不多！
1、
CTAB法
1）
在所需量的CTAB抽提液中加入2－巯基乙醇，使终浓度达2％（v/v）。将此溶液预热至65℃。
对于每克新鲜的叶组织大约需要4ml的2－ME/CTAB抽提液。
2）
用液氮（－196℃）或干冰（－78℃）冷却粉碎器/匀浆器，将0.5
g植物组织粉碎成细粉，然后将组织转移到2.0
ml离心管。
3）
加入800
µl预热的2－Me/CTAB，混合使之充分湿润，于65℃温育20
min，不时颠倒混匀。
4）
待冷至室温后，加入800
µl氯仿/异戊醇（24：1），颠倒混匀至溶液呈乳浊状----但不要振荡。25℃，10000
rpm离心10
min。
5）
上清（~700
µl）转移至另一干净的离心管中，加入5
µl
RNaseA贮液，37℃温育30
min。
6）
加入700
µl氯仿/异戊醇，颠倒混匀，25℃，10000
rpm离心10
min。
7）
上清（~600
µl）转移至另一干净的1.5
ml离心管中，加入600
µl异丙醇，颠倒混匀，室温或-20℃放置20
min。
8）
25℃，12000
rpm，离心10
min，收集沉淀。
9）
去上清，加1
ml70%乙醇洗涤沉淀两次。（25℃，12000
rpm，离心10
min）
10）凉干DNA，溶于50
µl
ddH2O，4℃保存备用。
2、
SDS法
①
将0.3
g植物材料于液氮速冻，然后在研钵中将其磨碎，将粉末转至2
ml离心管中。
②
加入1.2
ml预热至65℃的提取缓冲液（其中加入3
μl
β—巯基乙醇，增加DNA的稳定性），置65℃水浴中放置30分钟，不时颠倒混匀。。
③
加入0.45
ml
5M的醋酸钾，混匀，冰浴20分钟，在10000
rpm离心20
min。需要的话，Miracloth纱布过滤除去沉淀，上清液转入另一离心管中。
④
加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），轻轻颠倒混匀，12000
rpm离心15
min。
⑤
转移上清液到另一新离心管中，加5
μl
RNaseA贮液，37℃温育30
min。
⑥
加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），轻轻颠倒混匀，12000
rpm离心15
min。
⑦
转移上清液到另一新离心管中，加入0.7V异丙醇，轻轻颠倒混匀，-20℃放置30分钟沉淀核酸。
⑧
25℃，12000
rpm，离心10
min，收集沉淀。
⑨
弃上清，70％乙醇洗两次。
⑩
凉干DNA，溶于50
µl
ddH2O，4℃保存备用。

Ⅹ 获取目的基因的常用方法是哪种

1.从基因文库中获取目的基因：将含有某种生物的许多DNA片段，导入受体菌
的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物不同的基因，称为基因文库。
当需要某一片段时，根据目的基因的有关信息，如根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因
在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA，以及基因的表达产物蛋白质等特性来获取目的基
因。
2.化学合成法。已知目的基因的核苷酸序列，可用DNA合成仪直接合成。
3.用PCR技术扩增技术提取。已知目的基因引物的序列，将整个DNA放入合成仪，因为只有当
引物与模板结合后DNA热聚合酶才能行使聚合功能，所以只有引物中间的目的基因被大量扩增，
即被提取出来。