菌种的诊断和分型通常用什么方法

A. 病原微生物中细菌常见检测方法有哪些

1、快速测试片技术法

快速测试片是指以纸片、纸膜、胶片等作为培养基载体，将特定的培养基和显色物质附着在上面，通过微生物在上面的生长、显色来测定食品中微生物的方法。

细菌总数检测纸片的研制始于 20 世纪 80 年代，其主要优点是简便、实用、经济、操作性强。近年来以滤纸和美国某公司的 Petrifilm 为载体的测试片已开始被广泛应用。

2、生物电化学方法

生物电化学方法是指通过电极测定微生物产生或消耗的电荷，从而提供分析信号的方法。微生物在滋生代谢过程中，培养基的电化学性质如电流、电位、电阻和电导等会发生变化，所以可以通过检测分析这些电化学参量的变化来实现对微生物的快速测定。

常见的有：阻抗分析法、电位分析法、电流分析法等。生物电化学方法具有测量快速、直观、操作简单、测量设备成本低和信号的可控性等特点。

3、微菌落技术

微菌落是指细菌生长繁殖早期在固相载体上所形成的只能借助于显微镜观察的微小菌落。微菌落技术具有快速、经济、实用的特点，其研究始于 20 世纪50年代，定量测定技术从 20 世纪 70 年代开始，国外已有报道将该法应用于水、食品中细菌总数的快速检测。

4、气相色谱法

气相色谱应用到微生物的检测中，主要是依据不同微生物的化学组成或其产生的代谢产物各异，利用上述色谱检测可直接分析各种体液中的细菌代谢产物、细胞中的脂肪酸、蛋白质、氨基酸、多肽、多糖等，以确定病原微生物的特异性化学标志成分，协助病原诊断和检测。

5、高效液相色谱法

利用高效液相色谱检测可分析各种体液中的细菌代谢产物、病原微生物等，以确定病原微生物的特异性化学标志成分，协助病原诊断和检测。

B. 菌种鉴定常用的分离方法有哪些

菌种质量检测的目标包括菌丝形态、菌落特征以及子实体形态等方面。质量检测常用方法如下：

（1）建立标准的培养和观察方法

对于一个栽培品种各菌种的质量检测，实际上是以该品种典型的生物学特性（包括形态特征、生理生态特性、栽培习性）为参照标准进行比较，以检验菌种是否存在品种退化、菌种老化、病菌侵染、杂菌污染和品种混杂等质量问题。同时，菌种质量检测不仅要考虑从哪些方面来评价一个菌种的质量优劣，也要考虑用怎样的标准方法对菌种质量进行评价的问题。因为一定的结果来源于一定的方法和一定的条件。方法和条件不同，结果就失去了可比性，也就无法鉴别，因此，需要建立标准。这些标准包括：培养基、培养条件（温度、湿度、pH、光照等）、菌种的菌龄等。

（2）连续观察

在菌种生长过程中，要连续观察，一切不正常的现象只有在生长过程中才能表现出来。而当菌种长满培养基表面后，其不正常现象往往会被菌种的过龄而掩盖。

（3）宏观检查

对食用菌母种、原种及栽培种的宏观检查要根据其培养特征来进行（参见前述有关内容），这是菌种生产者及使用者普遍使用的方法，简单易行，但需要有多年的从业经验与技术沉淀。如被检菌种表现出菌落生长速度不一致、气生菌丝变稀疏或出现扇变菌落、菌落上过早出现色素、或不同特征的菌落混杂共存、或菌落上出现黑褐色、青灰色、黄褐色或红色的孢子堆，均可以确定该菌种存在质量问题。优质菌种外观菌丝洁白、密集粗壮，生长速度一致，齐发并进。

在生产实践中，广大菇农和专业工作人员总结出“纯、正、壮、润、香”的质量检查方法。这种应用感官识别菌种优劣，是经验的总结，能大致、快速地鉴定出菌种的优劣。具体方法是：

“纯”指菌种的纯度高，无杂菌感染，无斑块、无抑制线，无“退菌”、“断菌”现象等。

“正”指菌丝无异常，具有亲本正宗的特征，如菌丝纯白、有光泽，生长整齐，连结成块，具弹性等。

“壮”指菌丝发育粗壮，长势旺盛，分枝多而密，在培养基上恢复、定植、蔓延速度快。

“润”指菌种含水量适中，基质湿润，与瓶壁紧贴，瓶颈略有水珠，无干缩、松散现象。

“香”指具该品种特有的香味，无霉变、腥臭、酸败气味。

通过检测各种食用菌菌丝生长的色泽、速度、均匀度等特征是否正常，来判断菌种生长是否正常、是否可用，但辨别不了是否优质高产。

（4）显微镜检查

对菌丝体进行显微观察，可以确定菌丝粗细、分枝、隔膜、锁状联合等特性是否均一，是否与该栽培品种的典型特征一致（参见前述相关内容）。具有不同形态特征的菌丝体存在于同一菌种体中，表明该菌种存在质量问题；如果出现菌丝体重寄生现象，常表现出不同特征的菌丝体相互缠绕，或菌丝体中空变细，或在寄生点出现吸器等不正常现象。

镜检的方法是：挑取少量菌丝，置载玻片中央的水滴上，用解剖针或接种针拨散，盖上盖玻片，也可加碘酒或美蓝等染色后进行镜检。正常的菌丝一般透明、分枝状，有横隔和明显的锁状联合；异宗结合的食用菌，如仅有单核菌丝，不具结实性，不宜作菌种用；双核菌丝中，锁状联合多而密，则结菇力强，一般可认为是好菌种。如：

①双孢菇 观察双孢菇单孢子萌发后的菌丝生长形态。凡菌丝洁白、健壮，保存时间较长时菌丝颜色不变，较耐28℃以上气温，生长在基质上平贴培养基表面，气生菌丝不多的，为同化能力较强，产量较高的菌株。相反，菌丝生长初期好，很快变黄变稀，如蜘蛛丝一样，长出培养基表面菌丝较多的菌株产量较低。

②香菇 观察香菇的双核菌丝，在斜面培养基上生长速度达到1.2厘米/天以上的，菌丝不十分粗壮和洁白，锁状连合频繁，锁状连合在菌丝间相距较近，且在观察面上分布均匀，一般均是高产和抗杂能力较强的菌株。香菇出菇的密度与锁状连合有一定关系。

③草菇 观察草菇菌丝，发现菌丝分枝角度大的，出菇率高，产量高。菌丝分枝角度小、平行排列的，产量低。

各种食用菌的菌丝生长是否正常、是否可用，一般都以色泽、速度、均匀度等特征加以检测，但这并不能说明其是否优质高产。

（5）拮抗试验

也称对峙反应。同一种食用菌，经分离或杂交，将选育出许多不同的菌株，这些菌株的菌丝在形态上很难区别。如不同编号的香菇菌种，都是白色绒毛状菌丝，镜检时均具有锁状联合等。在当前菌种管理工作尚不十分健全的情况下，“同名异种”、“同种异名”的现象普遍发生，要识别异同，可采用“拮抗试验”加以区别。具体方法是：

用1支20毫米×200毫米的无底试管，中央部位装入长 5～7厘米的木屑麸糠培养基，两端压平并盖棉塞，灭菌后，两端各接入两株受检的菌种 1小块，25℃左右条件下培养，当两端菌丝往中央生长并相互接触后，把试管移至20℃、约300勒克斯的漫射光下继续培养，观察菌丝接触区有无对峙反应。若无褐色的带线出现，表示两个受检菌株的基因极相似或相同，是相同的菌株，仅编号不同，即同种异名。如果受检菌株间形成带线，则表示是不同的菌株。

用平板进行拮抗试验测试，方法是在无菌的PDA培养基平板上各接入2个或多个被检菌株的菌种，在上述条件下培养，观察菌丝相接触部分有无带线，以区别相同或不同的菌株。也可用菌种瓶（袋）进行拮抗测试（图2-11）。

图2-11 拮抗现象

（6）菌丝长速测定

在适宜的条件下，若菌丝生长迅速、粗壮有力、浓密整齐，一般为优质菌种。若菌丝生长缓慢、中断或长速极快、稀疏无力、参差不齐和易枯黄萎缩，则为不良菌种。菌丝生长速度测定，可在PDA平板中心接种培养，测量菌落两个直交直径，取其平均值。同理，还可在原种、栽培种瓶（袋）壁上划线测定。

（7）菌丝生长量测定

将等面积的菌苔接入无菌的液体培养基内，在相同的条件下，进行摇床振动培养，经过一定时间后，过滤收集菌丝，反复冲洗干净后置容器内，80～100℃烘箱中烘干至恒重后称重。凡菌丝增殖快、重量重的为优质菌株，而增殖慢、重量轻的为不良菌株。

（8）耐高温测定

以双孢菇为例，把菌种置于20～22℃下培养，待菌丝长到1/2试管斜面时，每一菌株取出2～3支试管，置于35℃温度下，经24小时作抗热性试验，然后放到22～23℃下培养，观察菌丝恢复情况。若菌丝恢复萌发快，仍健壮、旺盛生长，则表明该菌株具有耐较高温的优良性状；如果菌丝生长缓慢，出现发黄倒伏，萎缩无力，则为不良菌株。

（9）均一性测定

将母种接种于标准培养基的平板上，并置于标准的环境条件下，每批做30～50个重复，进行长势和长速的连续观察记录。均一性好的品种，每个重复之间长势和长速几乎没有肉眼可见的差异。如果长势和长速不一，则表明原始的母种的遗传均一性不良，不宜作生产用种。

（10）纯度测定

菌种纯度高低是鉴定菌种质量好坏的关键环节。优质菌种要求同一管、瓶或袋内只含有所需要的菌种菌丝体，而不能含有其他种类的杂菌。这里所说的杂菌包括细菌、放线菌、酵母菌和各种霉菌，以及含有两种食用菌菌丝体或同一种食用菌的两个品种菌丝。凡是被杂菌污染的菌种都是不纯菌种，必须予以淘汰。在三角瓶内装入浅层液体培养基，灭菌后接入经捣散的菌种，25℃条件下培养，约1周观察，若有气泡和菌膜发生，并具酸败味，说明菌种不纯，混有杂菌；如果无上述现象则菌种纯正无杂。

（11）长势测定

菌丝长势包括菌丝生长的状态和速度。凡是菌丝生长迅速、整齐浓密、健壮有力的菌种为优良菌种。如果菌丝生长缓慢，或长速特快、稀疏无力、参差不齐、易于衰老，则表明是劣质菌种。在鉴别菌丝长势时，必须注意，在不同培养基上、不同培养条件下，同一种食用菌菌丝的长势不同，因此，判断食用菌的菌种长势，应采用相同的培养基，这样，结果就可靠一些。在外界环境条件相同的情况下，菌丝生长旺盛、生长量多、生长速度快的要好于菌丝生长弱、生长量少、生长速度慢的菌种。还有一种方法是在三角瓶内装入浅层液体培养基，灭菌后接入经捣散的菌种，25℃条件下培养，约1周观察浮在液面的菌种。如果菌丝向旁边迅速生长、健壮有力、边缘整齐，且不断增厚，说明该菌株生长势强；若表面生长慢、稀疏、菌丝层薄，说明长势弱，不宜用于生产。

（12）抗霉性测定

以木耳为例：制备平板，在平板的一边分别接入不同的木耳菌株，每一菌株3个重复，在26～28℃下培养。待木耳菌丝长到平板一半左右时，在平板的另一边接上木霉菌丝，继续培养。之后注意观察木霉菌丝与木耳菌丝的交界处，出现拮抗线的表示木耳菌株抗霉能力强，木霉菌丝无法长过去，为抗霉能力强的菌株。如果木霉菌丝很快盖过木耳菌丝，说明这个木耳菌株的抗霉能力差或没有抗霉力。

（13）出菇试验

对引进或分离的同一品种的若干菌株进行出菇对比试验，必须是在各级菌种的培养基成分、培养温度、培养时间及栽培条件基本一致的情况下进行。出菇试验可按菇类的常规栽培方法进行，数量可少些。为使试验准确，每一菌株设3～4个重复，以避免试验的偶然性。在位置排放上尽可能按菌名拉丁文排列，以相同的措施管理，在管理过程中对环境因子的变化、管理措施及生长历程、品种本身性状等要详细全面记录。以香菇为例记载内容如下：

①母种菌丝生长情况，如菌丝浓淡、生长快慢、菌苔韧性等。

②原种、栽培种中菌丝生长情况，如菌丝萌动、吃料、生长快慢；菌种表面有无菌皮或菌皮厚薄，白色颗粒状物有无或多少；培养基转色情况等。

③栽培阶段应记载：菇木转色快慢、颜色深浅；出菇快慢、菇生长密度；子实体经济性状，包括菇的大小、厚度、色泽、圆整程度、菌柄长度、粗细等；转潮快慢；对水分的敏感程度；产量及产量分布；出口菇比例等。

通过对记载资料分析，选出综合性状符合要求的菌株，供大面积生产或出售。

出菇试验因季节推迟或其他原因，可采用一种较简单的方法来弥补，即直接将接有各菌株并已发好菌的瓶（袋）装菌种，小心地敲破瓶颈或打开塑料袋口，使培养料外露（如果是双孢菇，则要覆土调好土粒的湿度），置最适宜的温、湿度条件下进行出菇（耳）管理，观察记载各项指标，最后进行评比。但这种方法的结果只能提供参考。

（14）栽培指标

采用一定的栽培规模，通过不同地区、不同原料、不同栽培方式，进行多次反复栽培观察，详细记录、评比后，具有优质、高产、高抗、高效和遗传性、稳定性强的菌株，才是优质和可推广的品种。其鉴定的内容、方法和指标有：

①吃料能力鉴定 将菌种接入最佳配方的原种培养料中，置适宜的温、湿度条件下培养，1周后观察种菇（耳）菌丝的生长情况。如果菌种块能很快萌发，并迅速向四周和培养料中生长伸展，则说明该品种的吃料能力强；反之，菌种块萌发后生长缓慢，迟迟不向四周的料层深处伸展，则表明该品种对培养料的适应能力差。对菌种吃料能力的测定，不仅用于对菌种本身的考核，同时还可以作为对培养料选择的一种手段。

②成活率 将菌种接在适宜的培养基上，若菌丝能很快恢复、定植和蔓延生长，成活率很高，是质量好的菌种；反之，接种后恢复慢，成活率不高是质量差的菌种。

③出菇快慢 一般说，高温型的出菇快，低温型的出菇慢，中温型的介于两者之间。而以菇的质量来说，高温型的质量差，低温型的质量好。但同一温型食用菌品种的不同菌株，其菌种接种后若菌丝分解培养料能力强，培养前后培养料失重大，出菇快而多，总产高，即是好菌种；否则为劣质菌种。

④菇峰间隔 在一个生产周期中，子实体发生可分数潮次，产菇最多时称菇峰，最低时称菇谷，每个菇峰和菇谷构成一潮菇。凡菇潮多，间隔时间短，说明菌丝分解能力强，供子实体发生的养分积累多，因此转潮快，是好的菌种；反之，菇潮间隔时间长，或不明显，零星出菇，产量低，即为劣质菌种。

⑤干燥率 鲜菇经干制后干燥率高，说明转化率高，子实体含水分低，为优质菌种。

⑥生物学效率 生物学效率，指每100千克干料可产多少千克鲜菇。生物学效率高，则菌种质量好，反之为劣质菌种。

（15）经济指标

高产不一定高效、丰产不等于丰收，要占领市场，获得较高利润，还必须具备商品的要求，如产品的色、香、味、形，档次，上市时间，货架期和保质期等。凡是鲜菇上市时间早，产量高、品质好、档次高、含水量低，不易变色、变质、破碎、失重，无农药残毒、残臭，符合食品卫生标准和得到的利润高等，均表示经济指标高，则为优质菌株；而上市有效时间短，易变色、变味、变质，含水量高，失水严重，易破碎，利润低的菌种均为劣质菌种。如香菇以大小适中、肉厚、色深、边缘内卷，柄短细为优良；双孢菇以色白、子实体大小适中，菌柄短，不易开伞等为优良；银耳以色白、开片好、蒂头小、松泡率高为优良等。

C. 请教病原微生物分型的方法种类及优劣势比较。谢谢！

病原微生物的分子分型方法
近年来，随着分子牛物学技术快速发展，新的诊断技术和方法不断涌现并广泛应用于临床微生物的检测，为病原微牛物的致病性、流行性、变异性以及耐药性分析等方面提供J，重要的信息。目前，应用分子生物学技术对病原微牛物进行分型的方法包括：脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gelelectrophoresis。PFGE)分型、聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)分型、生物芯片分型、多位点序列分型(muhilocus sequencetyping，MI。ST)、质粒DNA图谱分型以及限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)分型等。
1．脉冲场凝胶电泳分型PFGE技术以其重复性好、分辨力强而被誉为细菌分子分型的“金标准”。它可以用于大分子DNA的分离，其分辨范围达到10 Mb，而普通琼脂糖凝胶电泳仅能分离小于500 Kb的DNA。PFGE的基本原理是通过电场的不断改变，使包埋在凝胶中的DNA分子的泳动方向发
生改变，小分子DNA比大分子DNA泳动快，从‘‘ii在凝胶上按DNA分子大小呈现出特异的电泳图谱。病原微生物的基因组DNA经脉冲场凝胶电泳，使大片段DNA有效分离。DNA条带的密度反映了病原微生物基因组DNA的含量以及分子的大小，最终达到分型的目的。目前，PFGE已被广泛的应用于病原微牛物的分型，Swaminathan等∽J已经建立了针对大肠杆菌0157：H7、沙门菌属的Typhimurium血清型、李斯特菌、志贺菌属等病原微生物分型的标准PFGE操作方法。有研究认
为PFGE的分辨力强于核糖体分型和随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD)分型。当采用1个限制件核酸内切酶的分辨力不强时，可以采用2种限制性核酸内切酶加以提高。当然，PFGE也有一些局限，如耗时长、成本高等。另外，电泳图谱易受操作人员技术水平等因素的影响，这为不同实验室问的比较带米一定困难¨
2．聚合酶链反脱分犁PCR技术自1985年发明以来，以其灵敏度高和特异性强受到了人们的高度重视，成为核酸扩增和检测的一种常规方法H]。用于病原微生物分子分型的PCR方法主要有RAPD分型和重复序列PCR分犁2种。RAPD是建移在PCR基础卜-的1种可对整个未知序列的基因
组进行多态性分析的分子生物学方法。该方法以基冈组DNA为模板，以单个人T．合成的随机多态核苷酸序列(通常为10个碱基)为引物，在热稳定的DNA聚合酶的作用下进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖或聚内烯酰胺凝胶电泳后，对其进行多态性分析。反应小同基因组DNA特点，从而对病原微生物进行分型。RAPD可以在物种没有任何基因组信息的情况下分析其DNA多态性，对模板DNA的纯度要求不高。无需DNA探针和分子杂交。重复序列PCR分型足Versalovic于1996
年描述的1种细菌基因组指纹分析方法，即PCR扩增细菌基因组中广泛分布的短重复序列，经电泳图谱比较分析揭示基因组间的差异[5]。研究表明重复序列PCR分型与RAPD分型有相同的分辨力[6]，但操作相对复杂。然而，重复序列PCR分型的再现性非常好，这是RAPD无法比拟的。此外，多重PCR、巢式PCR等也呵用于病原微生物的分型，虽然各有长处，但也存在分辨力弱、重复性差、结果解析困难等不足，因此，还未广泛应用于临床。
3．生物芯片分型 生物芯片技术是将生物大分子，如寡核苷酸、cDNA、基冈组DNA、肽、抗原以及抗体等固定在诸如硅片、玻璃片、塑料片、凝胶和尼龙膜等固相介质上形成生物分子点阵，当待测样品中的生物分子与生物芯片的探针分子发生杂交或相互作用后，利．}}j激光共聚焦显微扫描仪对杂交信号进行检测和分析例。其用于病原微生物分型的基本原理是将代表各个亚型的特异基因制成1张芯片，经反转录就可检测样本中病原微生物的亚型进行辨别。液态芯片(suspension arraytechnology，SAT)，又称微球蛋白芯片(proteinbeadarrays，PBA)，是近年来出现的1种新的芯片技术。其原理是甩2种荧光染料按照不同比例将直径为5．6 ttm的微球染成100种颜
色，每种颜色的微球共价结合1种牛物探针，可以是抗原、抗体、配体，也可以是核酸或酶，分针对1种待检物。混合载有100种不同颜色的微球，就可以在1个反应孔里同时完成100种不同的生物反应。随后微球成单列通过2束激光照射的管道，计算机采集并处理每种颜色微球的荧光强度变化就可以分别对每个待测物进行定性或定量的检测。该系统口‘用于多种微生物抗原、抗体和特定基因的联合检测。目前，该方法已应用于临床HPV的分型检测。与固态芯片相比，液态芯片在反
应动力学、反应速度、检测敏感性、稳定性以及自动化程度方面都有较大的优势，因此，不少学者看好液态芯片的应用前景。
4．多位点序列分型 随着DNA测序技术的快速发展，分子分型日益趋向于染色体的单一或多个位点的多态性上。MI。ST分型是指测定对多个管家基囡中长度约为470 bp的核心片段的核苷酸序列，对其组合进行索引编号，不同的菌株对应不同的序列型，从而揭示菌株间等位基因的多样性。Maid—en等[83发现，MI，ST可用于脑膜炎奈瑟球菌的分型。他们认为，多个管家基因的序列分析比较在实验过程的ⅡI操作性与结果的可靠性之间取得了平衡，且结果准确，所得数据在不同的实验窜问具有良好的可比性，即MLST对某哆菌株具有较强的种内分辨力【9 J。Chen等no]应用MLST对我国台湾地区12家医院分离到的51株白色假丝酵母菌进行遗传特征分析，结
果发现了7个管家基因序列的83个多态性位点和45个二倍体序列类型。其中，36．1％是同义突变，63．9 oA为非同义突变。他们认为，MI。ST的分辨力较PFGE更强，能分辨某患者所感
染的白色假丝酵母菌随时间推移‘‘ii发生的微小种内进化。但MLST的缺点是它的高额费用和操作过程所需的特定仪器。这使得这项技术只能局限在大型的全球性流行病学研究中心
使用，影响其在医院推广普及。
5．质粒DNA图谱分型 细菌质粒分析是较早被使用的病原微牛物分子分型方法。该方法包括萃取质粒DNA和琼脂糖凝胶电泳。由于不同菌株质粒DNA序列和大小不同，
通过琼脂糖凝胶电泳分离得到的DNA质粒图谱也不同，从而可以对不同菌株进行分型。菌株携带的质粒越多则质粒DNA图谱分型方法的特异性越强。质粒网谱分型的优点是操作相对简单，只需要简单的设备就可以完成，耗时短，费用低廉。但质粒图谱分型有一难以克服的缺陷。即质粒可以自发的丢失、获取以及在同种细菌甚至是在异种细菌之间转移，这就造成了质粒图谱的不稳定性。另外，质粒图谱型方法小能区分那些大小相同而DNA序列不同的质粒¨“。
6．限制性片段长度多态性分型 RFI。P是指基因组DNA经限制性核酸内切酶消化，消化后的片段再通过琼脂糖凝胶电泳进行分离。用限制性核酸内切酶BglⅡ和EcoRI等消化病原微生物基因组DNA，可以产生大量短的片段，通过电泳后得到的DNA图谱可用于病原微生物的分型。几乎所有
的病原微牛物分离株都町以通过这种方法分型，但由于基因组DNA巨大，酶切后产生的片段众多，且含有大量的莺叠片段，这使得蔚株间图谱的一致性分析面I临诸多用难口“。RFLP分
型分辨力弱于PFGE分型，且操作比较复杂。

D. 请问一下菌种鉴定的方法和实验步骤

实验步骤：菌种鉴定工作是各类微生物学实验室都经常遇到的基础性工作。不论鉴定对象属哪一类，其工作步骤都离不开以下三步：①获得该微生物的纯种培养物；②测定一系例必要的鉴定指标；③查找权威性的鉴定手册。 一、经典分类鉴定方法 群体：菌落形态，在半固体或液体培养基中的生长状态等
* 形态 个体：细胞形态，染色反应，各种特殊构造等
* 营养要求：能源，碳源，氮源，生长因子等
* 生理、生化反应 酶；产酶种类和反应物性等
* 代谢产物：种类，产量，显色反应等
* 经典指标 生态特性：生长温度，对氧的需要，宿主种类等
* 生活史特点
* 血清学反应
* 噬菌体的敏感性
* 其它
经典分类法
经典分类法是一百多年来进行微生物分类的传统方法。其特点是人为地选择几种形态生理生化特征进行分类，并在分类中将表型特征分为主、次。一般在科以上分类单位以形态特征、科以下分类单位以形态结合生理生化特征加以区分。 * A. 能在 60 o C 以上生长
* B. 细胞大，宽度 1.3~1.8mm ………………… 1. 热微菌属 ( Thermomicrobium )
* B. 细胞小，宽度 0.4~0.8mm
* C. 能以葡萄糖为碳源生长
* D. 能在 pH4.5 生长 …………………………… 2. 热酸菌属 ( Acidothermus )
* DD. 不能在 pH4.5 生长 …………………………………… 3. 栖热菌属 ( Thermus )
* CC. 不能以葡萄糖为唯一碳源 ……………… 4. 栖热嗜油菌属 ( 栖热嗜狮菌属 Thermoleophilum )
* AA. 不能在 60 o C 以上生长
二、现代分类鉴定方法
* 近年来，随着分子生物学的发展和各项新技术的广泛应用，促使微生物分类鉴定工作有了飞速发展。对微生物鉴定工作来说，已从经典的表型特征的鉴定深入到现代的遗传学特性的鉴定、细胞化学组分的精确分析以及利用电子计算机进行数值分类研究等新的层次上。
* （一）微生物遗传型的鉴定
* DNA是除少数RNA病毒以外的一切微生物的遗传信息载体。每一种微生物均有其自己特有的、稳定的DNA成分和结构，不同微生物间DNA成分和结构的差异程度代表着它们间新缘关系的远近。因此，测定每种微生物DNA的若干重要数据，是微生物鉴定中极其重要的指标：
1. DNA的碱基组成(G+Cmol%)* 每一个微生物种的 DNA 中 GC mol% 的数值是恒定的，不会随着环境条件、培养条件等的变化而变化，而且在同一个属不同种之间， DNA 中 GCmol% 的数值不会差异太大，可以某个数值为中心成簇分布，显示同属微生物种的 GC mol% 范围。 DNA 中 GC mol% 分析主要用于区分细菌的属和种，因为细菌 DNA 中 GC 含量的变化范围一般在 25 ％～ 75 ％；而放线菌 DNA 中的 GC 比例范围非常窄 (37 ％～ 51%) 。一般认为任何两种微生物在 GC 含量上的差别超过了 10 ％，这两种微生物就肯定不是同一个种。因此可利用 G+C mol ％来鉴别各种微生物种属间的亲缘关系及其远近程度。值得注意的是，亲缘关系相近的菌，其 G+C mol ％含量相同或者近似，但 G+C mol ％相同或近似的细菌，其亲缘关系并不一定相似，这是因为这一数据还不能反映出碱基对的排列序列，而且如放线菌的 DNA 的 GC mol% 在 37 ～ 51 之间，企图在这么小的范围内区分放线菌的几十个属显然是不现实的。要比较两种细菌的 DNA 碱基对排列序列是否相同，以及相同的程度如何，就需做核酸杂交试验。
1. DNA的碱基组成(G+Cmol%)* 1）每个生物种都有特定的GC%范围，因此后者可以作为分类鉴定的指标。细菌的GC%范围为25--75%，变化范围最大，因此更适合于细菌的分类鉴定。
* 2）GC%测定主要用于对表型特征难区分的细菌作出鉴定，并可检验表型特征分类的合理性，从分子水平上判断物种的亲缘关系。
* 3）使用原则：
* G+C含量的比较主要用于分类鉴定中的否定每一种生物都有一定的碱基组成，亲缘关系近的生物，它们应该具有相似的G+C含量，若不同生物之间G+C含量差别大表明它们关系远。但具有相似G+C含量的生物并不一定表明它们之间具有近的亲缘关系。
1. DNA的碱基组成(G+Cmol%)* 同一个种内的不同菌株G+C含量差别应在4～5%以下；同属不同种的差别应低于10～15%。所以G+C含量已经作为建立新的微生物分类单元的一项基本特征，它对于种、属甚至科的分类鉴定有重要意义。
* 若二个在形态及生理生化特性方面及其相似的菌株，如果其G+C含量的差别大于5%，则肯定不是同一个种，大于15%则肯定不是同一个属。
* 在疑难菌株鉴定、新种命名、建立一个新的分类单位时，G+C含量是一项重要的，必不可少的鉴定指标。其分类学意义主要是作为建立新分类单元的一项基本特征和把那些G+C含量差别大的种类排除出某一分类单元。
2.核酸的碱基组成和分子杂交：* 与形态及生理生化特性的比较不同，对DNA的碱基组成的比较和进行核酸分子杂交是直接比较不同微生物之间基因组的差异，因此结果更加可信。
DNA-DNA 杂交
* DNA 杂交法的基本原理是用 DNA 解链的可逆性和碱基配对的专一性，将不同来源的 DNA 在体外加热解链，并在合适的条件下，使互补的碱基重新配对结合成双链 DNA ，然后根据能生成双链的情况，检测杂合百分数。如果两条单链 DNA 的碱基顺序全部相同，则它们能生成完整的双链，即杂合率为 100% 。如果两条单链 DNA 的碱基序列只有部分相同，则它们能生成的“双链”仅含有局部单链，其杂合率小于 100% 。由此；杂合率越高，表示两个 DNA 之间碱基序列的相似性越高，它们之间的亲缘关系也就越近。如两株大肠埃希氏菌的 DNA 杂合率可高达 100 ％，而大肠埃希氏菌与沙门氏菌的 DNA 杂合率较低，约有 70 ％。 G+Cmol ％的测定和 DNA 杂交实验为细菌种和属的分类研究开辟了新的途径，解决了以表观特征为依据所无法解决的一些疑难问题，但对于许多属以上分类单元间的亲缘关系及细菌的进化问题仍不能解决。
DNA — rRNA 杂交
* 目前研究 RNA 碱基序列的方法有两种。一是 DNA 与 rRNA 杂交，二是 16S rRNA 寡核苷酸的序列分析。 DNA 与 rRNA 杂交的基本原理、实验方法同 DNA 杂交一样，不同的是① 是 DNA 杂交中同位素标记的部分是 DNA ，而 DNA 与 rRNA 杂交中同位素标记的部分是 rRNA 。② DNA 杂交结果用同源性百分数表示，而 DNA 与 rRNA 杂交结果用 Tm(e) 和 RNA 结合数表示。 Tm(e) 值是 DNA 与 rRNA 杂交物解链一半时所需要的温度。 RNA 结合数是 100 m gDNA 所结合的 rRNA 的 m g 数。根据这个参数可以作出 RNA 相似性图。在 rRNA 相似性图上，关系较近的菌就集中到一起。关系较远的菌在图上占据不同的位置。用 rRNA 同性试验和 16SrRNA 寡核苷酸编目的相似性比较 rRNA 顺反子的实验数据可得到属以上细菌分类单元的较一致的系统发育概念，并导致了古细菌的建立。
3.建立16 S r RNA系统发育树
* a）使生物进化的研究范围真正覆盖所有生物类群；
* 传统的生物进化研究，主要基于复杂的形态学和化石记载，因此多限于研究后生生物（metazoa），而后者仅占整个生物进化历程的1/5
* b）提出了一种全新的正确衡量生物间系统发育关系的方法；
* c）对探索生命起源及原始生命的发育进程提供了线索和理论依据；
* d）突破了细菌分类仅靠形态学和生理生化特性的限制，建立了全新的微生物分类、鉴定理论；
* e）为微生物生物多样性和微生物生态学研究建立了全新的研究理论和研究方法，特别是不经培养直接对生态环境中的微生物进行研究。
3、 16S rRNA(16S rDNA) 寡核苷酸的序列分析
* 首先， 16S rRNA 普遍存在于原核生物（真核生物中其同源分子是 18S rRNA ）中。 rRNA 参与生物蛋白质的合成过程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物进化的漫长历程中保持不变，可看作为生物演变的时间钟。其次，在 16S rRNA 分子中，既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究。第三， 16S rRNA 的相对分子量大小适中，约 1 540 个核苷酸，便于序列分析。因此，它可以作为测量各类生物进化和亲缘关系的良好工具。
分离菌株 16S rRNA 基因
* 。从平板中直接挑取一环分离菌株细胞 , 加入 100μL 无菌重蒸 H 2 O 中 , 旋涡混匀后 , 沸水浴 2min, 12 000r min -1 离心 5min, 上清液中即含 16S rRNA 基因，可直接用于 PCR 扩增。分离菌株 16S rRNA 基因的 PCR 扩增和序列测定的一般步骤为： 16S rRNA 基因的 PCR 引物： 5'-AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-3' ； 5'-AAGGA GGTGA TCCAG CCGCA-3' 。扩增反应体积 50 m L ，反应条件为 95 ℃预变性 5min ， 94 ℃变性 1min ， 55 ℃退火 1min ， 72 ℃延伸 2min ，共进行 29 个循环， PCR 反应在 PTC-200 型热循环仪上进行。取 5 m L 反应液在 10g L -1 的琼脂糖凝胶上进行电泳检测。 PCR 产物测序可由专门技术公司完成。
比对分析
* 测序得到 分离菌株 16S rDNA 部分序列，此序列一般以 *.f.seq 形式保存，可以用写字板或 Editsequence 软件打开，将所得序列通过 Blast 程序与 GenBank 中核酸数据进行比对分析 ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast ) ，具体步骤如下：点击网站中 Nucleotide BLAST 下 Nucleotide-nucleotide BLAST [blastn] 选项，将测序所得序列粘贴在“ search ”网页空白处，或输入测序结果所在文件夹目录，点击核酸比对选项，即“ blast ”，然后点击“ format ”，计算机自动开始搜索核苷酸数据库中序列并进行序列比较，根据同源性高低列出相近序列及其所属种或属，以及菌株相关信息，从而初步判断 16S rDNA 鉴定结果。
比对分析
* 遗传距离矩阵与系统发育树构建，可采用 DNAStar 软件包中的 MegAlign 程序计算样本间的遗传距离。由 GenBank 中得到相关菌株的序列，与本研究分离菌株所测得序列一起输入 Clustalx1.8 程序进行 DNA 同源序列排列，并经人工仔细核查。在此基础上，序列输入 Phylip3.6 软件包，以简约法构建系统发育树。使用 Kimura 2-parameter 法，系统树各分枝的置信度经重抽样法（ Bootstrap ） 500 次重复检测， DNA 序列变异中的转换和颠换赋于相同的加权值。
（二）细胞化学成分的鉴定* 除上述核酸成分外的其它化学成分的测定，是微生物化学分类法的重要内容，主要包括：1.细胞壁的化学成分。2.全细胞水解液的糖型。3.磷酸类脂成分的分析。4.枝菌酸的分析。5. 醌类的分析。6.气相色谱技术的应用。
（二）细胞化学成分的鉴定
* 微生物分类中，根据微生物细胞的特征性化学组分对微生物进行分类的方法称化学分类法 (chemotaxonomy) 。在近二十多年中，采用化学和物理技术采研究细菌细胞的化学组成，已获得很有价值的分类和鉴定资料，各种化学组分在原核微生物分类中的意义见表
细菌的化学组分分析及其在分类水平上的应用
细胞化学成分鉴定的意义
* 随着分子生物学的发展，细胞化学组分分析用于微生物分类日趋显示出重要性。细胞壁的氨基酸种类和数量现己被接受为细菌属的水平的重要分类学标准。在放线菌分类中，细胞壁成分和细胞特征性糖的分析作为分属的依据，已被广泛应用。脂质是区别细菌还是古菌的标准之一，细菌具有酰基脂 ( 脂键 ) ，而古菌具有醚键脂，因此醚键脂的存在可用以区分古菌。霉菌酸的分析测定己成为诺卡氏菌形放线菌分类鉴定中的常规方法之一。鞘氨醇单胞菌和鞘氨醇杆菌等细胞膜都含有鞘氨醇，因此鞘氨醇的有无可作为此类细菌的一个重要标志。此外某些细菌原生质膜中的异戊间二烯醌，细胞色素，以及红外光谱等分析对于细菌、放线菌中某些科、属、种的鉴定也都十分有价值。
（三）数值分类法
* 数值分类法亦称统计分类法，是在约200年前与林奈同代人M.Adanson (1727 ~1806，法国植物学家)发展的分类原理基础上借助于现代的电子计算机技术而发展起来的。数值分类的基本步骤为：（1）计算两菌株间的相似系数；（2）列出相似度矩阵；（3）将矩阵图转换成树状谱。
数值分类的基本步骤
数值分类法
* 又称阿德逊氏分类法 。它的特点是根据较多的特征进行分类，一般为 50 ～ 60 个，多者可达 100 个以上，在分类上，每一个特性的地位都是均等重要。通常是以形态、生理生化特征，对环境的反应和忍受性以及生态特性为依据。最后，将所测菌株两两进行比较，并借用电子计算机计算出菌株间的总相似值，列出相似值矩阵 ( 图 14-5) 。为便于观察，应将矩阵重新安排，使相似度高的菌株列在一起，然后将矩阵图转换成树状谱 (dendrogram) ，再结合主观上的判断 ( 如划分类似程度大于 85 ％者为同种，大于 65 ％者为同属等 ) ，排列出—个个分类群。
数值分类法的优越性
* 数值分类法的优越性在于它是以分析大量分类特征为基础，对于类群的划分比较客观和稳定；而且促进对细菌类群的全面考查和观察，为细菌的分类鉴定积累大量资料。但在使用数值分类法对细菌菌株分群归类定种或定属时，还应做有关菌株的 DNA 碱基的 G + Cmol% 和 DNA 杂交，以进一步加以确证。

E. 形态染色相似的肠杆菌科细菌通过什么手段进行鉴别和区别

这个问题要回来答内容很长,肠杆菌科细菌鉴定专着早已经有了,看看这本书问题就解决了,你只给5分,我要化个把钟头打字不值,你悬赏50分,我明晚来详细讲给你听.
先经SS琼脂分离，种克氏双糖铁，18-24h后做OF和氧化酶试验，
发酵葡萄糖，氧化酶阴性的为肠杆菌科细菌
氧化葡萄糖，氧化酶阳性的为非发酵菌
发酵葡萄糖，氧化酶阳性的为孤菌科细
菌肠杆菌科细菌的鉴定方法：
1，取双糖斜面上的肠杆菌做玻片凝集试验，
A－G群沙门氏菌O多价诊断血清鉴别沙门氏菌．阳性者用沙门氏菌因子血清分型。
四种志贺氏多价和鲍氏多价诊断血清鉴别志贺氏并用志贺氏分型血清分型。
2生化反应分属：进行下述生化反应：
靛基质，甲基红，V－P，枸椽酸盐，流化氢，尿素酶，KCN，动力，明胶液化，赖氨酸脱羧酶，精氨酸双水解酶，鸟氨酸脱羧酶，苯丙氨脱氨酶，丙二酸钠，葡萄糖产气，乳糖，蕉糖，甘露醇，卫矛醇
水杨苷，侧金盏花醇，肌醇，山梨醇，阿拉佰糖，棉子糖，鼠李糖，
椐以上反应可将肠杆菌科的细菌分为14个属。
这14个属的细菌是
艾希氏菌属
志贺氏菌属
沙门氏菌属
枸椽酸盐杆菌菌属
克雷佰氏菌属
肠杆菌菌属
哈夫尼亚菌属
沙雷氏菌属
欧文氏菌属
爱德华氏菌属
变形杆菌菌属
摩根氏菌属
普罗菲登氏菌属
耶尔森氏菌属
各菌属中的细菌再按种的特性鉴别到种。
沙门氏菌的生化反应：
H2S 靛基质 Ph7.2尿素 KCN 赖氨酸脱羧酶 结果判定
+..... — .....—....... — .........+.......伤寒沙门氏
+.....—..... — ........—..........+ ..亚利桑那,沙门氏菌
—... — ..... — .......— ........ +.. 甲型副伤沙门氏菌

志贺氏菌属的生化特性
动力 H2S 苯丙氨酸 赖氨酸脱羧酶 枸椽酸盐 葡铵
..—..—..... — ........— ..........— ........—

符合上述反应时再作群生化反应：
分群 ...........5%乳糖 甘露醇 棉子糖 3%甘油 靛基质
A群痢疾志贺氏菌...—........ —........— .....—......—
B群福氏志贺氏菌 . —....... +........ + ..... — ....+/—
C群鲍氏志贺氏菌 . —.......+......... — .....+ ....+/—
D群宋内氏志贺氏菌 + ........+ ........ + .....D .....—

伤寒副伤寒沙门氏菌的抗原结构
副伤寒甲沙门氏菌 O：2 ， 12 H：a；1、5
副伤寒沙乙门氏菌 O：4[5]，12 H：b；1、2
副伤寒沙丙门氏菌 O：6，7 H：c；1、5
伤寒沙门氏菌 O：9，12[VI] H：d；/

实在没办法打表格,还是自己去查书本吧!习惯的肠道致病菌从含铁双糖培养基上结合OF,氧化酶,赖氨酸脱羧酶, 尿素,枸椽酸盐,半固体等把非发酵菌和孤菌排除后,作沙门氏 菌\志贺氏菌\大肠艾希氏菌\变形杆菌\克雷佰氏菌等作出初步鉴别后,用编码法作出诊断.请你购肠道菌编码培养基,附有方法说明书,用起来很方便.我在疾控中心工作,现在我们购进法国生产的全自动化细菌鉴定仪分离到纯培养后,把菌液滴入培养管内4-8小时就出结果,20余种主要生化反应通过电脑软件给你打出,如果有疑问还会提醒再作几个生化,把补充结果或血清试验结果输入后就准确打印出细菌名称。