常用的物理诱变剂及其处理方法

A. 诱变育种的基本原理是什么

诱变育种的基本原理是基因突变，主要包括染色体畸变和基因突变。诱变育种是利用各种被称为诱变剂的物理因素和化学试剂处理微生物细胞，提高基因突变频率，再通过适当的筛选方法获得所需要的高产优质菌种的育种方法。

诱变育种存在的主要问题是有益突变频率仍然较低，变异的方向和性质尚难控制。因此提高诱变效率，迅速鉴定和筛选突变体以及探索定向诱变的途径。

(1)常用的物理诱变剂及其处理方法扩展阅读：

诱变育种是指用物理、化学因素诱导动植物的遗传特性发生变异，再从变异群体中选择符合人们某种要求的单株/个体，进而培育成新的品种或种质的育种方法。它是继选择育种和杂交育种之后发展起来的一项现代育种技术。

应用较多的是辐射诱变，即用α射线、β射线、γ射线、Χ射线、中子和其他粒子、紫外辐射以及微波辐射等物理因素诱发变异。当通过辐射将能量传递到生物体内时，生物体内各种分子便产生电离和激发，接着产生许多化学性质十分活跃的自由原子或自由基团。

它们继续相互反应，并与其周围物质特别是大分子核酸和蛋白质反应，引起分子结构的改变。由此又影响到细胞内的一些生化过程，如 DNA合成的中止、各种酶活性的改变等，使各部分结构进一步深刻变化，其中尤其重要的是染色体损伤。

由于染色体断裂和重接而产生的染色体结构和数目的变异即染色体突变，而DNA分子结构中碱基的变化则造成基因突变。那些带有染色体突变或基因突变的细胞，经过细胞世代将变异了的遗传物质传至性细胞或无性繁殖器官，即可产生生物体的遗传变异。

B. 用语言表述诱变育种的一般流程图

诱变育种的操作要点

（一）出发菌株的选择
用来进行诱变的菌株称为出发菌株。诱变育种的目的在于提高微生物代谢产物的产量、改进质晕或产生新的代谢产物。因此，选择出发菌株对诱变效果尤为重要。
1.作为出发菌株疢对诱变剂敏感，变异幅度大。
2．从自然界分离到的野生型菌株，对诱变剂敏感，易发生正向突变。由自发突变经
筛选得到的菌株也属于野生型菌株。
3.经诱变处理获得的高产菌株再诱变时易出现负突变，继续提高产量较难，不易直接作出发菌株。
4.选择易于表现出基因发生改变的单倍体细胞，酵母菌二倍体细胞很稳定，应该挑选异宗接合的单倍体菌株或用子囊孢子进行诱变。
5.选择单核或细胞核少的细胞，在霉菌的诱变育种中，多采用分生孢子或孢子囊孢
子进行诱变处理。

(二）细胞悬液的制备

1.采用生理状态一致的单细胞或单孢子进行诱变处理，不可能使细胞均匀地接触诱
变剂，还可以减少分离性表型延迟现象的发生。因此，诱变处理前的细胞应尽可能达到同步培养和对数生长期状态。
2． 一般诱变处理真菌孢子或酵母菌营养细胞，其细胞悬液浓度应为106个/ml而细菌营养细胞或放线菌孢于浓度为108个/ml，细胞悬液浓度可用平板计数法和血球计数板法测定。
3.一般情况，使用物理诱变剂处理时，用生理盐水配制细胞悬液；而使用化学诱变剂处理时，由于pH变化易引起诱变剂性质的改变而都使用缓冲液配制细胞悬液。

(三）诱变剂和处理方法的选择

1.诱变剂的选择 对诱变剂的要求是使遗传物质改变大，难于产生回复突变，这样获得的突变株突变性状稳定。亚硝基胍(NTG)和甲基磺酸己酯(EMS)等烷化虽能引起高频度的变异，但它们多是引起碱基对转换突变，易发生回变；而能引起染色体大损伤或移码的紫外线、γ-射线等诱变剂，其有优越性能。

2.诱变剂量的选择 选择最适诱变剂量，也就是在提高突变率的基础上，即能扩大变异幅度，又能使变异向正向突变范围移动的剂量。研究方向正向突变多出现在偏低剂量中，形态变异多发生在偏高剂量中，而一般形态变异多趋向于降低产量。
3.诱变处理方法的选择
（1）紫外线与光复活的交替处理 能使紫外线诱变作用得到显着增强。多次紫外线照射后，并在每次照射后进行-次光复活，突变率将大大提高。
（2）诱变剂的复合处理有一定的协同效应，复合处理有以下几种方式：两种或多种
诱变因子先后使用；同—种诱变剂重复使用；两种或两种以上诱变剂的交替使用等。

(四）中间培养

突变基因的出现并不意味着突变表型的出现，表型的改变落后于基因型改变的现象，称为表型延迟。其原因是分离性延迟和生理性延迟造成的。为此，必须将诱变处理的菌液进行中间培养，即将菌液接入完全液体培养基中培养过夜。

（五）突变株的分离
1.营养缺陷性菌株的分离

（1）淘汰野生型、浓缩缺陷型
（2）缺陷菌株的检出
（3）营养缺陷型的鉴定

2.抗性突变菌株的分离
（1）抗药性突变株的分离
（2）抗代谢结构类似物突变菌株的分离

3.产量性状突变的分离

C. 诱变育种的方法

物理、化学诱变的方法及其机理如下述。 应用较多的是辐射诱变，即用α射线、β射线、γ射线、Χ射线、中子和其他粒子、紫外辐射以及微波辐射等物理因素诱发变异。当通过辐射将能量传递到生物体内时，生物体内各种分子便产生电离和激发，接着产生许多化学性质十分活跃的自由原子或自由基团 。它们继续相互反应，并与其周围物质特别是大分子核酸和蛋白质反应，引起分子结构的改变。由此又影响到细胞内的一些生化过程，如 DNA合成的中止、各种酶活性的改变等，使各部分结构进一步深刻变化，其中尤其重要的是染色体损伤。由于染色体断裂和重接而产生的染色体结构和数目的变异即染色体突变，而DNA分子结构中碱基的变化则造成基因突变。那些带有染色体突变或基因突变的细胞，经过细胞世代将变异了的遗传物质传至性细胞或无性繁殖器官，即可产生生物体的遗传变异。
诱变处理的材料宜选用综合性状优良而只有个别缺点的品种、品系或杂种。由于材料的遗传背景和对诱变因素的反应不同，出现有益突变的难易各异，因此进行诱变处理的材料要适当多样化。由于不同科、属、种及不同品种植物的辐射敏感性不同，其对诱变因素反应的强弱和快慢也各异。如十字花科白菜的敏感性小于禾本科的水稻、大麦，而水稻、大麦的敏感性又小于豆科的大豆。另外，辐射敏感性的大小还同植物的倍数性、发育阶段、生理状态和不同的器官组织等有关。如二倍体植物大于多倍体植物，大粒种子大于小粒种子，幼龄植株大于老龄植株，萌动种子大于休眠种子，性细胞大于体细胞等。根据诱变因素的特点和作物对诱变因素敏感性的大小，在正确选用处理材料的基础上，选择适宜的诱变剂量是诱变育种取得成效的关键（表 1）。适宜诱变剂量是指能够最有效地诱发作物产生有益突变的剂量，一般用半致死剂量（LD50）表示。不同诱变因素采用不同的剂量单位。Χ、γ射线线吸收剂量以拉德(rad）或戈瑞（GY）为单位，照射剂量以伦琴（R）为单位，中子用注量表示。同时要注意单位时间的照射剂量（剂量率、注量率）以及处理的时间和条件。
辐照方法分外照射和内照射两种，前者指被照射的植物接受来自外部的γ射线源、Χ射线源或中子源等辐射源辐照，这种方法简便安全，可进行大量处理。后者指将放射性物质(如32P、35S等）引入植物体内进行辐照，此法容易造成污染，需要防护条件，而且被吸收的剂量也难以精确测定。干种子因便于大量处理和便于运输、贮藏，用于辐照最为简便。 化学诱变除能引起基因突变外，还具有和辐射相类似的生物学效应，如引起染色体断裂等，常用于处理迟发突变，并对某特定的基因或核酸有选择性作用。化学诱变剂主要有：①烷化剂。这类物质含有1个或多个活跃的烷基，能转移到电子密度较高的分子中去，置换其他分子中的氢原子而使碱基改变。常用的有甲基磺酸乙酯(EMS）、乙烯亚胺（EI）、亚硝基乙基脲烷（NEU）、亚硝基甲基脲烷（NMU）、硫酸二乙酯（DES）等。②核酸碱基类似物。为一类与DNA碱基相类似的化合物。渗入DNA后，可使DNA复制发生配对上的错误。常用的有5-溴尿嘧啶(BU）、5-溴去氧尿核苷（BudR）等。③抗生素。如重氮丝氨酸、丝裂毒素C等，具有破坏DNA和核酸的能力，从而可造成染色体断裂。
化学诱变主要用于处理种子，其次为处理植株。种子处理时，先在水中浸泡一定时间，或以干种子直接浸在一定浓度的诱变剂溶液中处理一定时间，水洗后立即播种，或先将种子干燥、贮藏，以后播种。植株处理时，简单的方法是在茎秆上切一浅口，用脱脂棉把诱变剂溶液引入植物体，也可对需要处理的器官进行注射或涂抹。应用的化学诱变剂浓度要适当（表 2）。处理时间以使受处理的器官、组织完成水合作用和能被诱变剂所浸透为度。化学诱变剂大都是潜在的致癌物质，使用时必须谨慎。