① 赛默飞磁珠法提取核酸留哪一个
1. 赛默飞磁珠法应该留DNA。
2. 核酸提取是通过比较核酸与不同化学物质之间的相互作用而实现的。
赛默飞磁珠法是一种基于磁性微珠的分离技术,通过在磁珠唯亮拆表面上修饰特定的功能性键困基团,可使其与特定的化合物或生物分子之间发生有选择性的结合。
在DNA和RNA的结构上,DNA与磁珠更容易结合并分离出指枣来。
3. 因此,在赛默飞磁珠法中提取核酸时,应该留下DNA。
② 核酸提取或纯化技术主要有哪几类
核酸提取或纯化技术主要有三类:
1、传统方法(操作复杂,耗时长)
2、离心柱法(试剂盒)
3、磁珠法(可单独采购磁珠或买成品试剂盒)
其中,磁珠法可实现自动化操作,是目前比较主流的方法。
核酸提取应用在疾病控制中旁李心、临床疾病诊断、输血安全、法医学鉴定、环境微生物检测、食品安全检测、畜牧业和分子生物学研运闭迟究态誉等多种领域。
(2)核酸提取的常用方法是磁珠法吗扩展阅读:
核酸提取的注意事项:
1、仪器的安装环境:正常的大气压(海拔高度应该低于3000m)、温度20-35℃、典型使用温度25℃、相对湿度10%-80%、畅通流入的空气为35℃或以下。
2、避免将仪器放置在靠近热源的地方,如电暖炉;同时为防止电子元件的短路,应避免水或者其他液体溅入其中。
3、进风口和排风口均位于仪器背面,同时避免灰尘或纤维在进风口聚集,保持风道的畅通。
4、核酸提取仪离其他竖直面至少10cm。
5、仪器接地:为了避免触电事故,仪器的输入电源线必须接地。
6、远离带电电路:操作人员不得擅自拆解仪器,更换元件或进行机内调节必须有持证的专业维修人员完成,不要在接通电源的情况下更换元件。
③ 艾滋病核酸检测的检测技术
核酸提取均采用磁珠法。
1)磁珠提取的原理:
将磁珠上标记特异性吸附核酸的物质特异性吸附核酸灶纤,并通过磁分离技术将病毒核酸从裂解液中提取出来。
2)步骤:
裂解—吸附—洗涤—洗涤—洗涤—洗脱
3)优点:
a.磁珠提取特异性高,受标本因素影响小,灵敏度高
b.易于实现自动化
4)缺点:
a.成本较高、并需要一定的仪器(半自动、全自动)。
b.完全手工工作,工作量太大。 根据HIV-1 gag.pol和env基因序列设计了套式聚合酶链反应(nesled polymerasechain reaction,nPCR)引物。将外周血单个核细胞裂解液先用外侧引物扩增,其产物再经内侧引物扩增,直接走凝胶电泳判定结果。nPCR的敏感性。较常规PCR高100~1000倍,册哪可检测到0.5fg质粒DNA和50μ1HIV-1感染者外周血样中的HIV基因。
根据专业文献记载,用本法检测63名HIV-1感染者全为阳性,而61名健康人和可疑者均为阴性,后者经追踪检测抗体排除了HIV-1感染。
由此可知,nPCR是一种敏感性极高、特异性很强、操作简便易行的HIV-1基因检测技术。它已经在早期诊断和外周血病毒含量检测中发挥了重要作用,而且有着更广阔的应用前景。
检测的优点
人体感染艾滋病病毒后,一般需要2-12周,平均42天左右血液中才可检测到HIV抗体。在这段时期内,常规检测技术根本无法检测出HIV病毒,这就是常说的“HIV窗口期”。“窗口期”的存在,也解释了为什么一些病人在接受了正规医院输血后却感染艾滋病的原因。
在感染过程中,首先出现的是病毒RNA,这时可以用PCR的方法检测出来,之后出现的是IgM抗体,使用双抗原夹心法即可以检测出来,然后出现的是IgG抗体,使用间接法可以检测州辩码出来。
现在省市疾病控制中心和检测试纸,使用的检测方法都是检测抗体抗原,无法避免“HIV窗口期”因素的干扰。所以说,常规检测技术在HIV窗口期内存在重大缺陷。
④ 核酸检测的艾滋病核酸检测技术
HIV基因结构
HIV基因组由两条单链RNA组成,每个RNA基因组约为9.7k,在RNA5′端有一帽结构(m7G5ppp5′GmpNp),3′端有poly(A)尾巴。HIV的主要基因结构和组合形式与其他反转录病毒相同,均由5′末端长重复(long terminal repeat,LTR)、结构蛋白编码区(gag)、蛋白酶编码区(pro)、具有多种酶活性的蛋白编码区(pol)、外膜蛋白(env)和3′末端的长重复LTR区组成。
核酸提取均采用磁珠法。
1)磁珠提取的原理:
将磁珠上标记特异性吸附核酸的物质特异性吸附核酸,并通过磁分离技术将病毒核酸从裂解液中提取出来。
2)步骤:
裂解—吸附—洗涤—洗涤—洗涤—洗脱
3)优点:
a.磁珠提取特异性高,受标本因素影响小,灵敏度高
b.易于实皮轿现自动化
4)缺点:
a.成本较高、并需要一定的仪器(半自动、全自动)。
b.完全手工工作,工作量太大。
应用套式聚合酶链反应(nPCR)检测技术
根据HIV-1 gag.pol和env基因序列设计了套式聚合酶链反应(nesled polymerasechain reaction,nPCR)引物。将外周扮握培血单个核细胞裂解液先用外侧引物扩增,其产物再经内侧引物扩增,直接走凝胶电泳判定结果。nPCR的敏感性。较常规PCR高100~1000倍,可检测到0.5fg质粒DNA和50μ1HIV-1感染者外周血样中的HIV基因。
根据专业文献记载,用本法检测63名HIV-1感染者全为阳性,而61名健康人和可疑者均为阴性,后者经追踪检测抗体排除了HIV-1感染。
由此可知,nPCR是一种敏感性极高、特异性很强、操作简便易行的HIV-1基因检测技术。它已经在早期诊断和外周血病毒含量检测中发挥了重要作用,而且有着更广阔的应用前景。
艾滋病核酸检测的优点
人体感染艾滋病病毒后,一般需要2-12周,平均42天左右血液中才可检测到HIV抗体。在这段时期内,常规检测技术根本无法检测出HIV病毒,这就是常说的“HIV窗口期”。“窗口期”的存在,也解释了为什么一些病人在接受了正规医院输血后却感染艾滋病的原因。
在感染过程中,首先出现的是病毒RNA,这时可以用PCR的方法检测出来,之后出现的是IgM抗体,使用双抗原夹心法即可以检测出来,然后出现的是IgG抗体,使用间接法可以检测出来。
现在省市疾病控制中心和厅唯检测试纸,使用的检测方法都是检测抗体抗原,无法避免“HIV窗口期”因素的干扰。所以说,常规检测技术在HIV窗口期内存在重大缺陷。
⑤ 磁珠法核酸提取的磁珠法核酸提取过程
取10-20mg左右的组织,用液氮研磨为粉末,转入1.5mL 离心管内,加入100 μL 生理盐水,振荡15秒 (或直接在100 μL 生理盐水中将组织匀浆为细胞悬液),加入200 μL 裂解液, 20 μL biog复合消化液,充分混匀,56℃温育12分钟(如组织匀浆不充分,可适当延长消化时间至组织完全消化)。
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冷却到室温,加入300μL异丙醇,雀岁充分混匀,再加入20μL磁珠复合液(每次使用前须充分混匀),振荡混匀3min(注意不要颠倒混匀,以防磁珠粘附于管盖内壁),静置2min。
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将离心管置于磁力架上放置约20s至磁珠完全吸附,开盖,彻底吸弃上清液(注意枪头不要接触磁珠)。
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加入800μL配制后的洗涤液,将离心管从磁力架上取下,充分振荡2min,确保磁珠完全分散。将离心管置于磁力架上放置约20s至磁珠完全吸附,开盖,彻底吸弃上清液(注意枪头不要接触磁珠)。
↓
将离心管从磁力架上取下,开盖,干燥约3-5min,至无明显乙醇老岁物气味。
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加入50-100 μL洗脱液,振荡至磁珠充分散开,室温静置2min,再振荡混匀1min。
↓
将离心管置于磁力架上,待侍液磁珠完全吸附后,小心吸取上清液至一新的1.5mL离心管中,提取的核酸可直接用于下游实验,或-20℃保存备用。
⑥ 核酸提取一步法和磁珠法区别
磁珠法是此次疫情中使用的方法,适合快速大量提取样品。
2、一步法适合快速精制样品。正兆一步法成本最高,限制了嫌睁它的普及芹清岁和大量使用。
⑦ 核酸提取仪原理
1. 根据仪器型号大小不同划分 [1]
1) 自动液体工作站
自动液体工作站是功能非常强大的设备,液体分液、吸液等自动完成,甚至能通过整合扩增、检测等功能,实现标本提取、扩增、检测全自动化。提取核酸只是其功能的一个应用,不太适合常规实验室提取核酸,一般都应用在单一类标本并且一次提取标本量非常大(至少96个,一般几百个)的实验需求上。自动工作站的平台建立及平台的运作,需要比较大的资金。
2) 小型自动核酸提取仪
小型的自动化仪器是通过运行结构的特殊性来达到自动提取核酸的目的,可以在任何实验室得到应用。
2. 根据提取原理不同划分
1) 采用离心柱法的仪器
离心柱法核酸提取仪主要采用离心机和自动移液装置相结合的方法,通量一般在1-12个样本,操作时间和手工提取差不多,并不能提高实际工作效率,且价格昂贵,不同型号仪器的耗材也不能通用,仅适合经费充足的大型实验室使用。
2) 采用磁珠法的仪器
以磁珠为载体,利用磁珠在高盐低PH值下吸附核酸,在低盐高PH值下与核酸分离的原理,再通过移动磁珠或转移液体来实现核酸的整个提取纯化过程。由于其原理的独特性,所以可设计成很多种通量,既可以单管提取,也可以提取8-96个样本,且其操作简单快捷,提取96个样本仅需30-45min,大大提高了实验效率,且成本低廉,因而可以在不同实验室使用,是目前市场上的主流仪器。
磁珠法核酸提取仪的基本原理
磁珠法核酸提取仪一般分为抽吸法和磁棒法两种 [2] :
1. 抽吸法,也叫移液法,是通过固定磁珠、转移液体来实现核酸的提取,一般通过操作系统控制机械臂来实现转移。提取过程如下:
1) 裂解:在样品中加入裂解液,通过机械运动及加热实现反应液的混匀及充分反应,细胞裂解,释放核酸。
2) 吸附:在样品裂解液中加入磁珠,充分混匀,利用磁珠在高盐低PH值下对核酸具有很强亲和力的特点,吸附核酸,在外加磁场作用下,磁珠与溶液分离,利用吸头将液体移出弃至废液槽,吸头弃掉。
3) 洗涤:撤去外加磁场,换用新吸头加入洗涤缓冲液,充分混匀,去除杂质,在外加磁场作用下,将液体移出。
4) 洗脱:撤去外加磁场,换用新吸头加入洗脱缓冲液,充分混匀,结合的核酸即与磁珠分离,从而得到纯化的核酸。
⑧ 磁珠法提取核酸的原理
磁珠法提取核酸的原理是依据与硅胶膜离心柱相同的原理,运用纳米技术对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良和表面修饰后,制备成超顺磁性氧化硅纳米磁珠。
磁珠能在微观界面上与核酸分子特异性地识别和高效结合。
利用二氧化硅包被的纳米磁性微球的超顺磁性,在Chaotropic盐(盐酸胍、异硫氰酸胍等)和外加磁场的作用下,能从血液、动物组织、食品、病原微生物等样本中分离出DNA和RNA,可应用在临床疾病诊断、输血安全、法医学鉴定、食品安全检测、分子生物学研究等多种领域。
③安全无行塌毒,不使用传统方法中的苯、氯仿等有毒试剂,对实验操作人员的伤害减少到最少,完全符合现代环保理念;
④磁珠茄含与核酸的特异性结合使得提取的核酸纯度高、浓度大。