细胞刮刀的使用方法

① 细胞刮刀会刮坏细胞吗

正常情况下是不会的，实验室用的晶安生物25cm细胞刮刀，希望可以帮到您。

② 染色质免疫共沉淀的一般流程

ChIP 的一般流程：
甲醛处理细胞---收集细胞，超声破碎---加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合---加入ProteinA，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀---对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合---洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物---解交联，纯化富集的DNA-片断---PCR分析。
在PCR分析这一块，比较传统的做法是半定量-PCR。但是现在随着荧光定量PCR的普及，大家也越来越倾向于Q-PCR了。此外还有一些由ChIP衍生出来的方法。例如RIP（其实就是用ChIP的方法研究细胞内蛋白与RNA的相互结合，具体方法和ChIP差不多，只是实验过程中要注意防止RNase，最后分析的时候需要先将RNA逆转录成为cDNA）；还有ChIP-chip（其实就是ChIP富集得到的DNA-片段，拿去做芯片分析，做法在ChIP的基础上有所改变，不同的公司有不同的做法，要根据公司的要求来准备样品）。
具体操作流程：
第一天：
（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎。
1、取出1平皿细胞（10cm平皿），加入243 ul 37%甲醛，使得甲醛的终浓度为1%（培养基共有9ml）。
2、37摄氏度孵育10min。
3、终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125M。450 ul 2.5M甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置5min即可。
4、吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。
5、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中（PBS依次为5ml，3ml和3ml）。预冷后2000rpm 5min收集细胞。
6、倒去上清。按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。这样每100ul溶液含1×106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设MCF7长满板为5×106个细胞。本次细胞长得约为80%。即为4×106个细胞。因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。将2管混在一起，共800ul。
7、超声破碎：VCX750，25%功率，4.5S冲击，9S间隙。共14次。
（二）、除杂及抗体哺育。
8、超声破碎结束后，10000g 4℃离心10min。去除不溶物质。
留取300ul做实验，其余保存于-80℃。
300ul中，100ul加抗体做为实验组；100ul不加抗体做为对照组；100ul加入4ul5MNaCl（NaCl终浓度为0.2M），65℃处理3h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。
9、在100ul的超声破碎产物中，加入900ul ChIP Dilution Buffer和20ul的50×PIC。
再各加入60ul ProteinA Agarose/Salmon Sperm DNA。4℃颠转混匀1h。
10、1h后，在4℃静置10min沉淀，700rpm离心1min。
11、取上清。各留取20ul做为input。一管中加入1ul抗体，另一管中则不加抗体。4℃颠转过夜。
（三）、检验超声破碎的效果。
取100ul超声破碎后产物，加入4ul 5M NaCl，65℃处理2h解交联。分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。
第二天：
（一）、免疫复合物的沉淀及清洗。
12、孵育过夜后，每管中加入60ul ProteinA Agarose/Salmon Sperm DNA。4℃颠转2h。
13、4℃静置10min后，700rpm离心1min。除去上清。
14、依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤：加入溶液，在4℃颠转10min，4℃静置10min沉淀，700rpm离心1min，除去上清。
洗涤溶液：a.low salt wash buffer-one wash
b.highsalt wash buffer-one wash
c.LiCl wash buffer-one wash
d.TE buffer-two wash
15、清洗完毕后，开始洗脱。洗脱液的配方：100ul10%SDS，100ul 1MNaHCO3，800ul ddH2O，共1ml。
每管加入250ul洗脱buffer，室温下颠转15min，静置离心后，收集上清。重复洗涤一次。最终的洗脱液为每管500ul。
16、解交联：每管中加入20ul 5M NaCl（NaCl终浓度为0.2M）。
混匀，65℃解交联过夜。
第三天：
（一）、DNA样品的回收
17、解交联结束后，每管加入1ul RNaseA（MBI），37℃孵育1h。
18、每管加入10ul 0.5MEDTA，20ul 1MTris.HCl（PH6.5），2ul 10mg/ml蛋白酶K。
45℃处理2h。
19、DNA片段的回收----omega胶回收试剂盒。最终的样品溶于100ul ddH2O。
（二）、PCR分析

③ 细胞刮刀可以重复使用吗

只要能够彻底清洗就可以重档稿复使用。但是如腊渣果经费允许的话，尽量不要重复使用，因为清轮蠢悄洗、灭菌过程很繁琐，不能保证彻底无菌，另外，清洗后会对铲面造成损害，可能会影响使用效果。但是塑料的不建议重复使用，读书时候实验室都是老师统一订购的，用的是晶安生物的。

④ 收集细胞蛋白要不要用细胞刮

收集细胞蛋升渗白是需要用细胞刮的，步骤是这样，先吸取培养基，预冷pbs清洗细胞三次，再用细胞刮刮脱细链陪胞到离心管，离心15分棚笑蠢钟，转移洗净就好了。

⑤ chip实验原理及步骤

第三天：

(一)、DNA样品的回收

17、解交联结束后，每管加入1ulRNaseA(MBI)，37度孵育1h。

18、每管加入10ul0.5MEDTA，20ul1MTris.HCl(PH6.5)，2ul10mg/ml蛋白酶K。45度处理2h。

19、DNA片段的回收―――omega胶回收试剂盒。终的样品溶于100ulddH2O。

(二)、PCR分析

ChIP技术总结

(一)关于细胞

细胞的生长状态要好。因为细胞的生长状态直接影响细胞内部的基因表达调控网络，也很有

可能影响你所研究的TF与其靶Promoter的结合。一般细胞长到75%-80%比较好。

(二)关于抗体

抗体是实验成败的致命因素之一!必须是IP级别的抗体，另外如果经济条件许可的话，尽量买大厂的抗体。不推荐国产抗体和santacruz的抗体，即使是IP级别的。

单抗与多抗的选择也需要仔细考虑。两种抗体各有利弊。单抗特异性强，背景低。但是单抗有一个致命的弱点，就是识别位点单一，而在ChIP甲醛交联的过程中，很有可能该位点被其它蛋白或核酸结合而被封闭，导致单抗不能识别靶蛋白。多抗虽然没有这个问题，但是多抗特异性较差，背景可能会偏高。

一般而言，如果没有十足把握(单抗的识别位点远离靶蛋白与核酸结合的区域)，选择多抗比较稳妥一些。

(三)关于交联与超声破碎

这一块的确是ChIP实验中比较难把握的部分。交联的程度会影响到超声破碎的效果，交联的程度越高，超声破碎就越不易把基因组打碎成小片段。

交联不充分，只有一部分靶蛋白与其Promoter相结合，富集得到的Promoter的量不高，实验假阴性。交联过充分，基因组上结合了太多的蛋白，对超声破碎造成障碍。另外也会增加背景。

一般来讲，按照经验，交联条件取决于细胞类型。不同的细胞系，交联的条件也不一样。例如：NIH-3T3的交联条件是室温(25摄氏度)下15min，1%的甲醛浓度，而别的细胞系则可能完全不一样。而超声破碎的条件，机器不一样，条件也不一样。当然如果你有bioruptor这样的神器，那么超声破碎对你而言就是小菜一碟了。一般，理想的超声破碎得到的片段大小是200bp-1000bp。但是200bp-2000bp的范围也是可以接受的。

(四)关于操作

希望尽可能的保持低温(4度)。沉淀的时候可以先在4度放置一会，等它自然沉降一些，再超低转速(500rpm等)离心使其完全沉降。虽然说明书上说ChIP实验的过程中有几个可以停顿的地方，我还是希望你能够连续把它做完，直到PCR结果出来为止。尽量避免实验中不可预知的影响因素。

(五)关于解交联

虽然说明书上说4小时已经足够，但是我还是希望你可以解交联过夜。因为在那样的环境里，DNA不会降解，过夜解交联更充分些。只是不要忘记在EP管口封上封口膜。

(六)关于DNA片段的回收

需要注意的是：样品中SDS样品较高，普通的PCR产物回收试剂盒回收，很有可能会在终的样品中混入SDS，影响PCR实验结果。小Tip：过柱前，在样品中加入一定量的异丙醇，能有效的消除SDS沉淀。

⑥ 什么是染色质免疫共沉淀技术（ChIP）

染色质免疫共沉淀技术是在保持组蛋白和DNA联合的同时，通过运用对应于一个特定组蛋白标记的生物抗体，染色质被切成很小的片断，并沉淀下来的技术。

这项技术主要用来分析目标基因有没有活性、或者分析一种已知蛋白（转录因子）的靶基因有哪些。该技术主要应用于以下几方面：

1.组蛋白修饰酶的抗体作为“生物标记”

2.转录调控分析

3.药物开发研究

4.有丝分裂研究

5.DNA损失与凋亡分析

(6)细胞刮刀的使用方法扩展阅读：

实验步骤：

1、细胞固定

甲醛能有效的使蛋白质-蛋白质，蛋白质-DNA，蛋白质-RNA交联，形成生物复合体，防止细胞内组分的重新分布。甲醛的交联反应是完全可逆的，便于在后续步骤中对DNA和蛋白质进行分析。交联所用的甲醛终浓度为1%，交联时间通常为5分钟到1个小时，具体时间根据实验而定。

值得注意的是，交联时间如果过长，细胞染色质难以用超声波破碎，影响ChIP结果，而且实验材料也容易在离心过程中丢失。交联时间如果过短，则交联不完全，产生假阴性。甲醛的交联反应可被加入的甘氨酸终止。

2、染色质断裂

交联后的染色质可被超声波或Micrococcal Nuclease切成400~600 bp的片段（用琼脂糖凝胶电泳检测），以便暴露目标蛋白，利于抗体识别。超声波是使用机械力断裂染色质，容易引起升温或产生泡沫，这都会引起蛋白质变性，进而影响ChIP的效率。

所以在超声波断裂染色质时，要在冰上进行，且要设计时断时续的超声程序，保证低温。另外，超声探头要尽量深入管中，但不接触管底或侧壁，以免产生泡沫。总超声时间也不要太长，以免蛋白降解。

技术应用：

1、Micrococcal Nuclease可以将染色质切成一到几个核小体，比超声波处理的结果更精致，更均一。另外，酶反应的条件比较温和，对DNA和DNA-蛋白复合物的损伤较小，而且蛋白不易变性。酶处理染色质适用于新鲜的细胞或组织样品和冰冻样品。在研究组蛋白时，经常采用没经过甲醛固定的Native ChIP（N-ChIP）的研究方法。

因为N-ChIP没经过甲醛固定，超声波处理会打断组蛋白和DNA的结合，所以只能选择酶处理染色质的方法。对于甲醛固定的样品，一般选择超声波处理方法。也有研究人员使用酶处理的方法研究甲醛固定较温和的样品。

2、染色质免疫沉淀的DNA适用于多种分析方法。如果目的蛋白的靶序列是已知的或需要验证的，可采用狭缝杂交（Slot blot）的方法，把靶序列特异性探针与染色质免疫沉淀的DNA杂交，来验证目的蛋白与DNA靶序列的特异性结合。

还可以根据靶序列设计引物，用半定量PCR的方法进行测定，或采用Real-time PCR方法进行定量分析。如果目的蛋白的靶序列是未知的或高通量的（high-throughput），可采用Southern杂交。但因为免疫沉淀的DNA量较少，所以在研究时通常要用PCR方法扩增DNA探针，再进行整个基因组扫描。

还可以把沉淀的DNA克隆到载体中，进行测序，寻找该序列附近的开放阅读框，发现新的基因调节序列。

3、目前，随着人类基因组测序工作的基本完成，研究目的蛋白和整个基因组的相互作用逐渐成为研究的热点。由于基因组中的信息量非常大，上述常规方法通常无法满足科研的需要。近年来发展起来的ChIP-chip技术将基因组DNA芯片（chip）技术与染色质免疫沉淀技术（ChIP）相结合，为研究目的蛋白与整个基因组相互作用提供了可能。

ChIP-chip 技术通过标记染色质免疫沉淀富集的DNA片段，和另一个被标记不同探针的对照组样品一起，与DNA芯片杂交，再利用各种生物信息学方法对收集到的信号进行分析，具体的实验步骤请参考Dr. Richard Young在Nature Protocols上的文章。

ChIP-chip技术已经被广泛应用于研究转录因子在整个基因组中的信号网络，染色质修饰机制在基因组中的调控，DNA的复制，修复以及修饰，基因的转录与核运输等诸多方面。

4、染色质免疫沉淀技术还可用于分析两种蛋白共同结合的DNA序列，即ChIP reChIP方法。ChIP reChIP是在第一次ChIP的基础上不解交联，而继续进行另一个目的蛋白的免疫沉淀，从而得到与两种目的蛋白都结合的DNA序列。

值得注意的是，因为通过两次免疫沉淀富集的DNA量比较少，所以在分析时通常要把多次免疫沉淀的DNA浓缩后再进行操作。

5、随着染色质免疫沉淀技术受到广泛的关注，运用该技术发表的文章也逐渐增多，大家越来越多的开始关注如何改进ChIP的方法。Millipore最新推出的Magna ChIP试剂盒，利用磁珠分离DNA-蛋白-抗体复合物，提高了ChIP的效率，简化了操作的过程，缩短了实验的时间，还为同时进行多个目的蛋白的研究提供了可能，是经常使用ChIP技术的研究人员的理想选择。

6、近年来ChIP技术也被用于研究RNA-蛋白的相互作用，其原理与DNA类似，也包括甲醛固定，超声波破细胞，免疫沉淀，交联逆转，RNA纯化和RNA鉴定等步骤。所不同的是，交联逆转只用Proteinase K，要进行RNA纯化和不含RNase的DNase处理，分析时用RT-PCR，芯片杂交要用cDNA芯片等。

⑦ 细胞刮能重复使用吗

我们每次处理完细胞后都会将细郑仿胞刮放到75%酒精里浸泡，重复利用，刚开始细胞也一直好好的。之前细胞刮刮过污染的细胞，依然在75%的酒精里浸泡，重复利用，但后来培养的细胞总是污染，具体从什么时侯开始一直污染肢丛缺我也历辩记不清了。