酶的使用方法

⑴ 酶活性分析的常用方法

一、量气法

在封闭的反应系统中如有气体变化，通过测量变化后的气体体积或压力很容易计算出气体变化量，这是量气法的基本原理。曾在检验科广泛应用的Van-slyke测二氧化碳结合力的方法就是量气法的一个典型例子。Warburg进一步加以发展，设计出专用于测定酶活性的华勃呼吸仪。这种仪器特别适用于测定那些在反应中产生或消耗气体的酶，例如氧化酶反应涉及到O2的消耗，脱羧酶会产生CO2。但也不仅限于这些酶，科学家采用与CO2气体保持平衡过的重碳酸盐体系，可用来测定各种产生H+的酶反应，如各种还原酶，可使NADH变为NAD和H+，而H+会促使反应体系中重碳酸盐变为CO2气体。

二、比色法与分光光度法

在20世纪上半个世纪华勃仪得到研究实验室广泛的应用，并在酶学上得到丰硕的成果。但此法操作烦琐，技术要求高而且灵敏度低。临床常规中很少使用。多使用简单易行的比色法测酶活性。在上半个世纪建立了一些适用于常规工作的测酶活性浓度的方法，如测定淀粉酶的Somogyi法，碱性磷酸酶的Bodansky法、King法等等。这些方法都是在酶和底物作用一段时间后停止酶反应，加入各种化学试剂与产物或基质反应呈色，用比色计在可见光处比色，同时将被测物质作标准管或标准曲线，比较后计算出在此段时间内产物生成量或底物消耗量，从而求得反应速率v。

比色法从50年代起逐步被分光光度法所取代。这是因为分光光度法有以下几个显着优点：一是测定范围不只局限在可见光，还可扩展到紫外和红外部分。这就为扩大测定酶范围提供了可能性。二是提供了寻找一类不需停止酶反应就可直接测定产物生成量或底物消耗量方法的可能性。例某一酶催化下列反应A－＞B＋C，A、B、C三种物质用分光光度法的吸收光谱如图17-1所示。

图17-1 A、B、C三种物质的吸收曲线

可以看到C在560nm处有一吸收峰，而A和B在此处无吸光度变化因此无需停止酶反应，只要在560nm处测定吸光度变化就很容易计算出C的变化速度，而且C物质比A、B二物质有更高的吸收峰，即灵敏度最高。

这类方法中最成功的是Warburg在50年代利用NAD（P）H和NAD（P）吸收光谱差异建立的测酶活性浓度方法。NAD（P）H在340nm处有一吸收峰，而NAD（P）在此波段却毫无吸光性。因此建立了一类和原来比色法截然不同方法。不需停止酶反应，在340nm根据吸光度变化，就可观察到酶反应变化全过程。

第三个优点是不需要如比色法那样，作标准管或标准曲线，因为分光光度计使用近似单色光的光源，在此条件下，某一特定物质的吸光度为常数，即人们所熟悉的摩尔吸光度（molar absorbance）。根据此值从吸光度△A/△T不难计算出酶催化反应速度v。

分光光度计的这些简便、准确等特点使它在近年来已逐步取代比色法而成为目前最流行的方法。其缺点是需要精确带恒温装置的分光光度计，在经济不发达地区尚难推广。

分光光度法的技术多样化。设计得当可用于各种酶的测定。表17-2是一些可用于分光光度法的氧化还原物质特性。

除了前述的NAD(P)H系统可用于脱氢酶测定外，可利用黄素单核苷酸（FMN）和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）来测定各种含这二个辅基的酶。它们的氧化型在450nm有一很强吸收峰，而还原型的吸光度很低，同样细胞色素还原型在可见光有一个非常明显和很窄的吸收峰，都使人们很容易用分光光度法研究这些酶的作用。上述物质主要用于氧化还原酶的测定。

科学家还设计出一系列人工合成酶的底物，用于其它酶的分光光度法测定。例如合成了很多对硝基酚的衍生物，用于各种水解酶的测定。碱性磷酸酶底物磷酸对硝基酚就是一个成功例子。又如测芳香基硫酸酯酶，可使用人工合成的硫酸对硝基酚为底物，其分解产物的吸收峰由原来的278nm变为318nm，Webb成功地在330nm进行此酶监测

表17-2 一些氧化还原物质的特性

物质 波长（nm） 克分子吸光度
还原型 氧化型
NAD，NADP 340 6300 0
FMN 450 12200
FAD 450 11300
细胞色素C 550 29500 8300
亚甲蓝（等消光点） 610 0 41000
二氢酚吲哚酚 600 0 21000
吩嗪甲酯硫酸 388 1500 22000
抗坏血酸 265 15100
连二亚硫酸盐 314 8000 0
氰化铁（亚铁） 420 0 1020

分光光度法的上述原理还可以用于其它酶的测定，如烯醇化酶、延胡索酸水解酶的底物由于含不饱和键，在330nm处有很强吸收峰，而酶作用产物无此不饱和键。则不难在330nm处对这些酶进行直接测定。

此后在分光光度法的发展过程中又导入了酶偶联技术。使得分光光度法几乎能测定所有的酶。因此临床实验室工作者如不能很好掌握分光光度法的技术，不了解各种影响因素，要作好酶的测定是很困难的。

三、荧光法和同位素法

分光光度法有一个缺点，即灵敏度较低。有些标本中酶浓度很低时往往测不出来。此时可考虑改用荧光法，可将测定灵敏度提高2-3个数量级。如科学家合成了一系列甲基伞形酮的衍生物，可取代对硝基酚衍生物做为一些水解酶的底物，由于水解产物甲基伞形酮有强烈荧光，大大提高测定的灵敏度，就是分光光度法中最常用的NAD(P)H反应系统，也可改用荧光法，在340nm紫外线激发下NAD(P)H产生强烈的蓝色荧光，而NAD(P)不被激发。此外，还可使用在荧光法基础上发展起来的时间分辨荧光法，例如北京医院就曾利用此种灵敏度极高方法测定很难用其它方法检测的脑脊液中微量的烯醇化酶。荧光法不易掌握，对所用的试剂、容器和仪器都要求很高，否则易产生非特异荧光干扰测定，或者引起荧光的淬灭使测定不准，故此种方法多用于研究实验室，少用于常规实验室。为提高灵敏度，还可使用同位素标记的底物进行酶测定，例如，有人以C12标记的乙酰胆碱为底物测定胆碱酯酶，在酶作用后以离子交换法分离出含C14的乙酸。同位素方法由于对人体有害，操作麻烦，目前已很少使用。

四、其它方法

离子选择电极法，旋光法等有时用于测定特定的酶，当酶反应牵涉到有酸碱变化时，很容易用pH仪直接观察酶反应过程中H+的变化。直接用pH仪测酶反应有两个缺点：一是随pH变化，会偏离酶作用的最适pH值，不可避免地引起酶反应速度变慢。其二是如测定的标本不是纯酶时标本中其他蛋白及其它有缓衡能力的物质将会影响所测pH变化的程度。此时如改用电位滴定仪则更为适合。此仪器可在酶反应过程中不断向反应体系中加入酸或碱以维持反应体系pH的恒定，而加入的酸碱量只与体系中H+变化量相关，和反应体系中缓衡能力无关。

同样如酶反应中有O2变化，可使用氧电极来监测酶反应过程，这可用来测定葡萄糖氧化酶活性，Chappell还成功地将此技术用于测线粒体的氧化能力。还曾有人尝试用二氧化碳和氨电极测酶，由于这些电极反应时间较慢，不利于检测酶反应速度。有些酶的反应物为光学异构体，则可根据旋光度变化来追踪酶反应。某些反应物如羟基酸本身虽无旋光性，但与钼结合后产生很高的旋光性。根据此特性建立了测定延胡索酸水合酶的方法。还有个别酶的测定使用了极谱法、高效液相色谱法等。总之，实验室工作者完全可以根据实验室现有仪器和技术，创造性地建立一些新的测活性浓度的方法。

⑵ 木瓜蛋白酶的作用，用法，用量，适用范围是什么

木瓜蛋白酶papain属巯基蛋白酶，具有较宽的底物特异性，作用于蛋白质中L-精氨酸、L-赖氨酸、甘氨酸和L-瓜 木瓜蛋白酶氨酸残基羧基参与形成的肽键。此酶属内肽酶，能切开全蛋蛋白质分子内部肽链—CO—NH—生成分子量较小的多肽类。 存在于木瓜胚乳中的蛋白酶。EC3．4．22．2。作为植物来源的蛋白酶来说，此酶研究进展的最快。此酶主要是以内肽酶的形态起作用。活性的产生，而半胱氨酸残基是不可缺少的，所以是硫基蛋白酶的一种，底物的特异性不太严格，分子量为23400，氨基酸残基数212。 木瓜蛋白酶是一种在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质的蛋白酶。它的外观为白色至浅黄色的粉末，微有吸湿性。 酪蛋白被木瓜蛋白酶降解生成的酪氨酸在紫外光区 275nm 处有吸收峰。 木瓜蛋白酶（Papain）简称木瓜酶，又称为木瓜酵素。是利用未成熟的番木瓜（Carica papaya）果实中的乳汁，采用现代生物工程技术提炼而成的纯天然生物酶制品。它是一种含疏基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力，同时，还具有合成功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。溶于水和甘油，水溶液无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。最适合PH值5.7(一般3～9.5皆可)，在中性或偏酸性时亦有作用，等电点18.75；最适合温度55～60℃(一般10～85℃皆可)，耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。木瓜蛋白酶在各个行业的应用1.医药工业应用： 含有木瓜蛋白酶的药物，能起到抗癌、肿瘤、淋巴性白血病、原菌和寄生虫 、结核杆菌等，可消炎、利胆、止痛、助消化。治疗妇科病、青光眼、骨质增生、枪刀伤口愈合、血型鉴别、昆虫叮咬等。 2.食品工业应用： 可利用酶促反应，使食品大分子的蛋白质水解成小分子肽或氨基酸。用于水解动植物蛋白、制成嫩肉粉、水解羊胎素、水解大豆、饼干松化剂、面条稳定剂、啤酒饮料澄清剂、高级口服液、保健食品、酱油酿造及酒类发酵剂等。有效转化蛋白质的利用，大大提高食品营养价值，降低成本。有利于人体的消化和吸收。 3.美容化妆品工业应用： 将木瓜蛋白酶加入到含有蛋白质和油脂的化妆品中，具有独特的美白嫩肤、美颜保健、祛斑除污垢、促进血液循环、改善肌肤等功效，提高产品档次。可制成减肥茶、美容护肤品等。 4.日化品工业应用： 用于香皂、肥皂、洗涤剂、洗衣粉、洗手液等，去污力强，除菌消毒、安全放心。 5.饲料工业应用： 用于饲料添加剂，开发蛋白源，利于吸收，提高饲料的利用率，节约成本，有助于牲畜消化，加速生长。如在猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅、鱼、虾等饲料中添加。还可以作为蔬菜水果高级复合肥料的添加剂。 6.皮革工业应用： 利用木瓜蛋白酶制成脱毛剂，鞣制皮革，具有毛孔细腻，皮纹光亮效果。 纺织工业应用：可用于处理羊毛、蚕蛹脱胶、蚕丝精炼，能达到手感柔软、舒适、抗收缩、抗张强度等效果。 7.细胞培养： 木瓜蛋白酶在准备细胞培养液（cell culture）的第一步中被用于分离细胞。用酶处理小组织块10分钟后，就可以将连接细胞的细胞外基质打断；然后再用蛋白酶抑制剂来停止反应，防止木瓜蛋白酶进一步裂解细胞本身；最后用Pasteur pipette将组织块打散为单细胞悬浮液。 8. 免疫学： 在免疫学中，木瓜蛋白酶可被用于将免疫球蛋白（即抗体）的Fc片段（可结晶）和Fab片段（抗原结合）切割开。

⑶ 简述酶的固定的方法及优点

与自然酶相比，固定化酶和固定化细胞具有明显的优点（也就是为什么要进行酶的固定化）： 一、可以做成各种形状如颗粒状、管状、膜状，装在反应槽中便于取出，便于连续、反复使用。
二、稳定性提高，不易失去活性，使用寿命延长。
三、便于自动化操作，实现用电脑控制的连续生产。
方法：物理方法包括物理吸附法、包埋法等。化学法包括结合法、交联法。
各种方法优缺点
1·吸附法 ：利用各种吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使酶固定的方法。 常用吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等。 采用吸附法固定酶，其操作简便、条件温和，不会引起酶边形或失活，且载体廉价易得，可反复使用。
2·包埋法 酶被裹在凝胶的细格子中或被半透性的聚合物膜包围而成为格子型和微胶囊型两种。优点酶包埋在聚合物中不易漏出;操作条件温和、对外界环境的缓冲作用大，可防止酶体的机械损伤,易于再生,产物分离提取容易。3·共价结合法（属化学法中的结合法）即酶蛋白的非必需基团通过共价键和载体形成不可逆的连接。共价结合法酶与载体之间结合紧密，不易脱落，稳定性好，但反应条件激烈，操作复杂，控制条件苛刻，活力损失较大
4·交联法 依靠双功能团试剂使酶分子之间发生交联凝集成网状结构，使之不溶于水从而形成固定化酶，此法制备的细胞与载体结合紧密，但制备麻烦，活力损失较大

⑷ 糖化酶的使用方法

酒精工业：原料经蒸煮冷却到60℃，调PH值至4.0-4.5左右，加糖化酶，参考用量为80-200单位/克原料，保温30-60分钟，冷却后进入发酵。
淀粉糖工业：原料经液化后，调PH值到4.0-4.5左右，冷却到60℃，加糖化酶，参考用量为100-300单位/克原料，保温糖化。
啤酒工业：在生产“干啤酒”时在糖化或发酵前加入糖化酶，可以提高发酵度。
酿造工业：在白酒、黄酒、曲酒等酒类生产中，以酶代曲，可以提高出酒，并应用于食醋工业。
其他工业：在味精、抗菌素、柠檬酸等其他工业应用时，淀粉液化冷却到60℃，调PH4.0-4.5，加糖化酶，参考用量100-300单位/克原料。

⑸ 保软酶的使用方法

在制作年糕、麻薯、青团子、干吃汤圆等糯米制品过程中，添加适量糯米制品专用保软酶，就能使产品口感更软、更糯，将工业化生产的熟糯米制品从生产后到消费者食用前始终保持刚生产时的柔软新鲜，保质期延长到6个月。

并且使用方法也非常的简单，等蒸熟的糯米粉冷却到65~70度时，将适量的糯米制品专用保软酶用少量温水溶解后添加到熟糯米粉中揉匀，接下来正常成型操作即可。糯米制品专用保软酶的添加量仅为生糯米粉用量的0.6~1.0%左右，一般夏天用量低，冬天用量略大些。

保软酶是过氧化氢酶。过氧化氢酶的使用方法根据应用领域有很大的区别，比如夏盛过氧化氢酶在工业领域的应用和食品领域的应用用法完全不同，而且根据工艺的不同也有较大的区别。

过氧化氢酶（CAT），是催化过氧化氢分解成氧和水的酶，存在于细胞的过氧化物体内。过氧化氢酶是过氧化物酶体的标志酶, 约占过氧化物酶体酶总量的40%。过氧化氢酶存在于所有已知的动物的各个组织中，特别在肝脏中以高浓度存在。过氧化氢酶在食品工业中被用于除去用于制造奶酪的牛奶中的过氧化氢。过氧化氢酶也被用于食品包装，防止食物被氧化。

以上参考来源:网络-过氧化氢酶

⑹ 单宁酶的详细使用方法

单宁酶现在已经实现国产了。找北京卫诺恩问问吧！他们有这方面的解决方案。

⑺ 阿替普酶的用法用量

1.静脉注射：将50mg的本药溶解为1mg/ml的浓度，注射给药。2.静脉滴注：将本药100mg溶于注射用生理盐水500ml中，在3h内按以下方式滴完，即前2min先注入本药10mg，以后60min内滴入50mg，最后120min内滴完余下的40mg。1.负荷给药法(front loading)：总剂量为100mg，先弹丸(bolus)注射15mg，然后30min内再静脉滴注50mg，接着1h内静脉滴注剩余35mg。2.按体重法：先静脉弹丸注射15mg，接着30min静脉滴注0.75mg/kg，然后1h内静脉滴注0.5mg/kg。3.二次弹丸法(two bolus)：总量100mg，分2次静脉弹丸注射，间隔30min，此方法可有88%的再通率。

⑻ 注射用血凝酶的用法用量

静脉注射、肌肉注射，也可局部使用。儿童：每次0.3-0.5-1.0KU， 。或遵医嘱。成人：每次1.0—2.0KU， 紧急情况下，立即静脉注射1.0KU，同时肌肉注射1.0KU。各类外科手术：手术前1小时，肌肉注射1.0KU，或手术前15分钟，静脉注射1.0KU。手术后每日肌肉注射1.0KU，连用三天，或遵医嘱。在用药期间，应注意观察病人的出、凝血时间。应防止用药过量，否则疗效会下降。

⑼ α淀粉酶使用方法 温度 时间 浓度

真菌α—淀粉酶的最适作用温度为55℃左右，超过60℃开始失活；而细菌α—淀粉酶最适作用温度高（中温α—淀粉酶70～80℃，耐高温α—淀粉酶为95～105℃）
一般的工业用α—淀粉酶最适温度在70℃左右

⑽ 请教木瓜蛋白酶的使用方法

木瓜蛋白酶最适作用温度在60℃左右，500cc的水，那就放0.1g就够了