组织学切片最常用的切片方法

A. 医院做的切片检查是怎么进行的

从患者身体的病变部位取出小块组织（根据不同情况可采用钳取、切除或穿刺吸取等方法）或手术切除标本制成病理切片，观察细胞和组织的形态结构变化，以确定病变性质，作出病理诊断。

为探讨器官、组织或细胞所发生的疾病过程，可采用某种病理形态学检查的方法，检查他们所发生的病变，探讨病变产生的原因、发病机理、病变的发生发展过程，最后做出病理诊断。

(1)组织学切片最常用的切片方法扩展阅读：

切片检查已经大量应用于临床工作及科学研究。在临床方面主要进行尸体病理检查及手术病理检查。手术病理检查的目的。

为了明确诊断及验证术前的诊断，提高临床的诊断水平；诊断明确后，可决定下步治疗方案及估计预后，进而提高临床的治疗水平。通过临床病理分析，也可获得大量极有价值的科研资料。

单纯形态学观察进行病理诊断的方法，即纯定性的方法、形态学的方法仅能进行粗略的定量估计，如根据瘤细胞的核分裂数目，尤其是病理性核分裂来判断恶性肿瘤的恶性变 。

B. 常用切片技术有哪些

切片伴随着显微镜技术和免疫实验等的发展而得到广泛的应用。本文对其中的冰冻切片、石蜡切片、碳蜡切片、超薄切片、塑料切片等几种常用的实验方法相关操作步骤

C. 常用的组织切片法有哪些

大概有冰冻切片、石蜡切片、碳蜡切片、超薄切片、塑料切片等几种常用的实验方法，

D. 怎么做标本

标本制作分很多种：血涂片、植物压片、金相切片等
举一个组织标本制作的方法
石蜡切片标本制作法：
这是最常用的组织学标本的制作方法。这种方法包括以下几个步 骤：取材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色和封固。

1．取材、固定：动物组织在死后及离体后会很快解体，这可能是由于细菌或是由于组织 本身所含酶的分解所致。所以，被检动物在乙醚麻醉下或以不同方法处死后，应立即进行取 材和固定，以停止其分解作用，尽可能保存细胞、组织生前结构和成分，还能抵抗后继各步 骤处理时所产生的影响。 1)取材：即从动物体内取下被检的器官或组织。以肝为例，取材的步骤为：将动物麻醉 或处死后，腹部向上固着在蜡盘上，打开腹部，暴露肝，用锋锐的小剪或手术刀细致而又迅 速地取下一块厚度和大小适宜(0．5cm’)的肝，立即投入固定液内‘：。：
2)固定：固定是把组织用化学试剂浸泡，使其蛋白质等成分迅速凝固，尽量保持生前形 态结构而不发生死后的变化。固定时所使用的化学溶液，称为固定液。
常用固定液的配方：
①Susa液(HeidenhainfsSusafluid) I液： 氯化汞(升汞)饱和水溶液 B液： 氯化钠 三氯醋酸 冰醋酸 40％甲醛 蒸馏水 50．0ml o．58g 2．08g 4．oIml 20．0m1 80．0ml临用时取等量的I液和2液混合后，将组织块投入，固定12h。
Helly液（Helly`s fluid) 重铬酸钾 2．5g 氯化汞 5．0g 硫酸钠 1．0g 蒸馏水 100．0m1 40％甲醛 5．0m1(临用时加入) 。
⑧甲醛(10％nelltralformalin) 40％甲醒 10．0m1 蒸馏水 90．0m1。
④Bouin液(Bouinfsfluid) 苦味酸饱和水溶液 75．0m1 40％甲醛 25．0m1 冰醋5．0m1。
⑤Carnoy液(Carnoy`s fluid) 无水酒精 6ml 氯仿 3m1 冰醋酸 1m1 。

2．脱水、透明、浸蜡、包埋：这几个步骤是为了将组织包埋在较硬的物质即石蜡中，以 便于制备薄的切片。
1)脱水：普通固定液多是水溶液，必须先脱去水分，为浸蜡创造条件。脱水剂通常用酒 精。脱水的步骤是逐步升高酒精溶液的浓度，以去净组织块内的水分，并完全由无水酒精取 代。Susa液固定的组织块，须先入含碘的95％酒精，脱水并洗去组织内的汞沉淀，然后换 90％、95％酒精和无水酒精。10％甲醛液固定后的组织块，脱水时应依次经70％、80％、 90％、95％酒精和无水酒精。
2)透明：因石蜡不溶于酒精而溶于二甲苯，因而组织块经脱水后须再用二甲苯替代出酒 精。组织块浸入二甲苯后逐渐变得透明，故此步骤称为透明。透明时间依组织块大小及性质 而定。
3)浸蜡：将透明好的组织块置入已在温箱(56—58℃)内熔化的石蜡内，放置适当时间， 使石蜡浸入组织并替换出二甲苯。
4)包埋：在包埋器的内壁涂一层甘油，倾入熔化的石蜡，将浸透蜡的组织块放到里面， 摆好方位，挨蜡液表面凝固后，将包埋器投入冷水浴中，使石蜡冷却凝固，即得坚硬的组织 蜡块，经过修整即可用于切片。

3．切片：一般用轮转式切片机制作组织学切片。切片机一般结构为：切片刀固定台、载 物台(机头或标本固定台)、切片厚度调节装置、机轮等部件。切片时：①将组织蜡块固着在 木托或金属托上，再将蜡块托固定于载物台；⑧将磨好的切片刀固定于切片刀固定台，调好 蜡块与刀的距离；②调整切片厚度调节装置，一般调至切6ym厚度的小格上；④转动机轮，每 转动一周，载物台就向切片刀侧移动6ym，同时还垂直下降上升往返一次，于是切得6ym厚 度的切片一张；如机轮连续转动，就可得一条连续的切片蜡带。
取下切片，置于涂布一层蛋白甘油的载玻片上，滴上适量水，于酒精灯上徐徐加温，至 切片在水面展平，倾去水，摆好切片位置，放入烤片箱。待切片干燥并牢固地附着于载玻片 后，即可取出，进行染色。

4．染色、封固：染色的目的是使组织内的不同结构染上不同藏色以便于在显微镜下观察。 染色的方法很多，可根据研究目的选用。组织学和病理学教学标本最常用的基本染色方法是 苏木精·伊红染色(H．E染色)。该方法可将细胞核染成蓝紫色，细鲍质染成粉红色，使细 胞结构对比分明。因此，现将该方法介绍如下。至于在实习过程中遇到的其它特殊染色法，将 分别介绍于首次出现之处。
苏木精·伊红染色(hematoxylin and eosinstain，简称H．E染色)：
1)染色的配方：
①Erich苏木精染液(Ehrlich’shematoxylin) ； 苏木精 2．98 95％酒精 100．0ml 蒸馏水 100．0m1 钾矾 3．0g 冰醋酸 10．0m1 甘油 100．Oml ‘的染液在至气中氧化2个月左右即可使用。
②1％伊红染液(1％Eosin) 伊红 1．08 蒸馏水 100．0
2)染色步骤：
①脱蜡：将裱好的干燥切片放入二甲苯浸2次，每次放置5。10min，以便将石蜡脱净。．
②下行酒精到水：脱蜡后，切片入无水酒精浸2次，每次2min，以便洗去二甲苯；然后 经95％、90％、80％和70％酒精，每次2min；随后入蒸馏水浸洗。若组织是用含汞的固定液 (如Susa液、Helly液)固定，还须经含碘的70％酒精脱汞后再入70％酒精及蒸馏水。
②苏木精染色：将蒸馏水浸洗后的切片放入Ehrich苏木精染液中，浸染5一10min。
④蓝化和分色：切片由染液取出以后，用自来水冲洗，挨切片变成蓝色后，再用稀盐酸 70％酒精溶液进行分色，脱去多余的染料(因为苏木精染色后，往往胞核着色较深，胞质及 结缔组织纤维等亦稍着色，影响下步染色及观察)。然后再用自来水冲洗，使之蓝化，约需15 ~30min。
⑤伊红染色：切片用蒸馏水浸洗后，放入1％伊红染液，浸染5—10min。
⑧上行酒精脱水：将切片用蒸馏水洗去附在载玻片上的染液后，经70％、80％、90％95％ 酒精和2次无水酒精脱水，每次一般为2min。：
⑦透明：切片入二甲苯2次，每次2min。
⑦封固：从二甲苯中取出切片，在切片的组织上滴加适量树胶(balsam)，上面再加一盖 玻片，使树胶布满于盖玻片与载玻片之间的间隙，封固即告完成。将封好的切片标本放入烤 箱．待盖玻片粘着牢固后，即得可供长期观察和保存的H．E染色标本。

E. 请教教我，做标本。非常感谢

标本制作分很多种：血涂片、植物压片、金相切片等
举一个组织标本制作的方法
石蜡切片标本制作法：
这是最常用的组织学标本的制作方法。这种方法包括以下几个步 骤：取材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色和封固。

1．取材、固定：动物组织在死后及离体后会很快解体，这可能是由于细菌或是由于组织 本身所含酶的分解所致。所以，被检动物在乙醚麻醉下或以不同方法处死后，应立即进行取 材和固定，以停止其分解作用，尽可能保存细胞、组织生前结构和成分，还能抵抗后继各步 骤处理时所产生的影响。 1)取材：即从动物体内取下被检的器官或组织。以肝为例，取材的步骤为：将动物麻醉 或处死后，腹部向上固着在蜡盘上，打开腹部，暴露肝，用锋锐的小剪或手术刀细致而又迅 速地取下一块厚度和大小适宜(0．5cm’)的肝，立即投入固定液内‘：。：
2)固定：固定是把组织用化学试剂浸泡，使其蛋白质等成分迅速凝固，尽量保持生前形 态结构而不发生死后的变化。固定时所使用的化学溶液，称为固定液。
常用固定液的配方：
①Susa液(HeidenhainfsSusafluid) I液： 氯化汞(升汞)饱和水溶液 B液： 氯化钠 三氯醋酸 冰醋酸 40％甲醛 蒸馏水 50．0ml o．58g 2．08g 4．oIml 20．0m1 80．0ml临用时取等量的I液和2液混合后，将组织块投入，固定12h。
Helly液（Helly`s fluid) 重铬酸钾 2．5g 氯化汞 5．0g 硫酸钠 1．0g 蒸馏水 100．0m1 40％甲醛 5．0m1(临用时加入) 。
⑧甲醛(10％nelltralformalin) 40％甲醒 10．0m1 蒸馏水 90．0m1。
④Bouin液(Bouinfsfluid) 苦味酸饱和水溶液 75．0m1 40％甲醛 25．0m1 冰醋5．0m1。
⑤Carnoy液(Carnoy`s fluid) 无水酒精 6ml 氯仿 3m1 冰醋酸 1m1 。

2．脱水、透明、浸蜡、包埋：这几个步骤是为了将组织包埋在较硬的物质即石蜡中，以 便于制备薄的切片。
1)脱水：普通固定液多是水溶液，必须先脱去水分，为浸蜡创造条件。脱水剂通常用酒 精。脱水的步骤是逐步升高酒精溶液的浓度，以去净组织块内的水分，并完全由无水酒精取 代。Susa液固定的组织块，须先入含碘的95％酒精，脱水并洗去组织内的汞沉淀，然后换 90％、95％酒精和无水酒精。10％甲醛液固定后的组织块，脱水时应依次经70％、80％、 90％、95％酒精和无水酒精。
2)透明：因石蜡不溶于酒精而溶于二甲苯，因而组织块经脱水后须再用二甲苯替代出酒 精。组织块浸入二甲苯后逐渐变得透明，故此步骤称为透明。透明时间依组织块大小及性质 而定。
3)浸蜡：将透明好的组织块置入已在温箱(56—58℃)内熔化的石蜡内，放置适当时间， 使石蜡浸入组织并替换出二甲苯。
4)包埋：在包埋器的内壁涂一层甘油，倾入熔化的石蜡，将浸透蜡的组织块放到里面， 摆好方位，挨蜡液表面凝固后，将包埋器投入冷水浴中，使石蜡冷却凝固，即得坚硬的组织 蜡块，经过修整即可用于切片。

3．切片：一般用轮转式切片机制作组织学切片。切片机一般结构为：切片刀固定台、载 物台(机头或标本固定台)、切片厚度调节装置、机轮等部件。切片时：①将组织蜡块固着在 木托或金属托上，再将蜡块托固定于载物台；⑧将磨好的切片刀固定于切片刀固定台，调好 蜡块与刀的距离；②调整切片厚度调节装置，一般调至切6ym厚度的小格上；④转动机轮，每 转动一周，载物台就向切片刀侧移动6ym，同时还垂直下降上升往返一次，于是切得6ym厚 度的切片一张；如机轮连续转动，就可得一条连续的切片蜡带。
取下切片，置于涂布一层蛋白甘油的载玻片上，滴上适量水，于酒精灯上徐徐加温，至 切片在水面展平，倾去水，摆好切片位置，放入烤片箱。待切片干燥并牢固地附着于载玻片 后，即可取出，进行染色。

4．染色、封固：染色的目的是使组织内的不同结构染上不同藏色以便于在显微镜下观察。 染色的方法很多，可根据研究目的选用。组织学和病理学教学标本最常用的基本染色方法是 苏木精·伊红染色(H．E染色)。该方法可将细胞核染成蓝紫色，细鲍质染成粉红色，使细 胞结构对比分明。因此，现将该方法介绍如下。至于在实习过程中遇到的其它特殊染色法，将 分别介绍于首次出现之处。
苏木精·伊红染色(hematoxylin and eosinstain，简称H．E染色)：
1)染色的配方：
①Erich苏木精染液(Ehrlich’shematoxylin) ； 苏木精 2．98 95％酒精 100．0ml 蒸馏水 100．0m1 钾矾 3．0g 冰醋酸 10．0m1 甘油 100．Oml ‘的染液在至气中氧化2个月左右即可使用。
②1％伊红染液(1％Eosin) 伊红 1．08 蒸馏水 100．0
2)染色步骤：
①脱蜡：将裱好的干燥切片放入二甲苯浸2次，每次放置5。10min，以便将石蜡脱净。．
②下行酒精到水：脱蜡后，切片入无水酒精浸2次，每次2min，以便洗去二甲苯；然后 经95％、90％、80％和70％酒精，每次2min；随后入蒸馏水浸洗。若组织是用含汞的固定液 (如Susa液、Helly液)固定，还须经含碘的70％酒精脱汞后再入70％酒精及蒸馏水。
②苏木精染色：将蒸馏水浸洗后的切片放入Ehrich苏木精染液中，浸染5一10min。
④蓝化和分色：切片由染液取出以后，用自来水冲洗，挨切片变成蓝色后，再用稀盐酸 70％酒精溶液进行分色，脱去多余的染料(因为苏木精染色后，往往胞核着色较深，胞质及 结缔组织纤维等亦稍着色，影响下步染色及观察)。然后再用自来水冲洗，使之蓝化，约需15 ~30min。
⑤伊红染色：切片用蒸馏水浸洗后，放入1％伊红染液，浸染5—10min。
⑧上行酒精脱水：将切片用蒸馏水洗去附在载玻片上的染液后，经70％、80％、90％95％ 酒精和2次无水酒精脱水，每次一般为2min。：
⑦透明：切片入二甲苯2次，每次2min。
⑦封固：从二甲苯中取出切片，在切片的组织上滴加适量树胶(balsam)，上面再加一盖 玻片，使树胶布满于盖玻片与载玻片之间的间隙，封固即告完成。将封好的切片标本放入烤 箱．待盖玻片粘着牢固后，即得可供长期观察和保存的H．E染色标本。

F. 组织学最常用的制片方法是

石蜡切片。石蜡切片操作要点。

切片前，把切片机上相关锁杆或螺旋拧紧，否则可能出现跳片、切片厚薄不均现象。

刮净包埋盒周边的余蜡，否则样品夹持可能松动，影响切片质量。

正确修块，先粗修，厚度大约在15-30微米，质地较硬的组织或较小的组织应再薄一些。粗修至组织全部暴露后，再进行细修。

选择蜡块握雀冷冻方式，冰盒优于冷冻台。使用冰盒能加水润湿蜡块，冷冻速度快，体积小，使用成本低，无须外接电源。

切片时轻握手轮，用力均匀轻柔，摇速不宜过快或过慢。过快会导致切片厚薄不均，切片难以展开；过慢会使切片增厚。切片要求完整、薄、均匀。

正确固定

组织离体后，必须在1小时内固定。固定液须是组织体积的4-10倍，浓度准确，过稀或过浓都会影响组织中扮形态和固定效果。如发现固定液变质，如甲醛液体产生白色沉淀，应立即更段培早换。

固定温度宜室温或放于35-37℃的全封闭组织处理机内，温度过高，会加快组织自溶和过度收缩，破坏细胞内的抗原和DNA。固定时间不超过40小时，根据室温和标本不同而调整。

G. 组织学常用的切片是石蜡切片，常用的染色法是和伊红染色，简称__染色，

苏木精，HE，嗜酸性，嗜碱性

H. 200分求科研实验切片的操作

石蜡切片法 ：
石蜡切片法是以石蜡作包埋剂,用旋转切片机将材料切成薄片,经一系列处理制成永久制片的方法.在研究植物的细胞,组织,胚胎以及形态等方面石蜡切片法是最理想的制片方法.
石蜡切片法的一般流程为:取材→固定→抽气→洗涤→脱水→透明→浸蜡→包埋→修块→切片→粘片→染色→封片.
取材
用锋利的刀片切取新鲜的植物材料,选定适宜的材料,立即固定.
取材的注意事项如下:
(1)取材料要新鲜.动作要迅速,以免挤压损坏组织;取病理材料时,应设置对照材料.
(2)所取材料大小要适当:根和茎一般直径≤5mm,切取成5-10mm小段;叶片一般取过中脉处,切成2-5mm宽,5-8mm长.在切材料时,必须注意刀片与中轴成直角,两切面平行,否则制成的切片细胞是斜的. 雌,雄蕊一般不需分割.
(3)取材时间可根据切片要求有所区别.如:在进行植物发育的研究过程时,需要找到细胞分裂相,一般在晴天的早晨9:00-10:00时取材,此时植物细胞分裂活动较明显.
(4)取材不易过老,否则制片有难度(过老的材料须在滑走切片机上进行);对纵切的材料适当多取材,如根尖,茎尖等,因为切到材料正中的概率较低.
(二)固定
将已切好的材料尽快地浸入相当于材料10-15倍体积的固定液中.借助固定液的作用,使细胞的新陈代谢瞬时停止,并保持细胞或组织的形态构造及其内含物的状态不发生变化.从而达到使组织变硬从而便于切片,增强内含物的折光度,令细胞易于着色的目的,同时具有防腐作用.以新鲜配制固定液效果较好.固定的时间依材料的种类,性质,大小等而定.材料固定完毕,保存于加盖的容器内,贴上标签.
良好的固定剂,应是穿透力强,使细胞立刻致死,原生质全部凝固;不发生任何变形,增强折光率,并且不妨碍染色.
常用固定液:
简单固定液 以一种化学药品配制的固定液.
⑴ 乙醇 为凝固型固定剂.常用无水乙醇或95%乙醇.
⑵ 甲醛 为非凝固性固定剂.具强烈刺激性气味.纯净的甲醛为无色透明液体.固定用的浓度为4%-10%.
⑶ 醋酸 为凝固型固定剂.为无色透明的液体,刺激性极强,低温下凝结成冰,故又名冰醋酸.
2. 混合固定液:
由几种试剂,适量配制而成.混合遵循原则:① 优缺点互补;② 膨胀与收缩相互平衡;③ 强氧化剂与还原剂应分别配置.
常用混合固定液有下列几种:
⑴ FAA 固定液(福尔马林-冰醋酸-乙醇) 广泛适用于根,茎,叶,花药,子房的组织切片,所以又称为万能固定液.一般固定时间不低于24 h.该固定液优点是在较低温度下(10℃左右)适用于材料的长期保存,可兼作保存液.并且固定的材料,不妨碍染色,但用于细胞学上的固定效果较差.

⑵ 纳瓦兴(Navaschjn's)固定液 1912年首创.适用于细胞学与组织学研究的切片观察.但渗透慢,不能长期保存;主要用于显示分裂相.
(三)抽气
植物材料内部多由于含有空气,导致固定液不能完全深入.材料投入固定液后需要立即抽气.以便让固定液有效透入材料组织中,并排除材料内气泡的干扰.
一般抽气时间为20-30 min.抽过气的材料在停止抽气,应沉入底部.
(四)洗涤
固定液中的成分有可能会妨碍染色或发生沉淀或结晶,影响观察;有的还会继续作用,使材料变质等.因此,在使用材料时,需根据固定液的种类,用水,缓冲液或70%乙醇洗去渗入细胞内部的固定液.如:用FAA固定的材料在脱水时用70%乙醇反复洗涤数次.如用水洗涤,可将材料自固定液中取出,放入指形管,加入半管水,用纱布将管口扎紧,置于水槽内,进行流水冲洗.流水冲洗时间一般为12-24 h.
(五)脱水
材料经洗涤后含有部分水分,会使材料分解.而且透明剂与水是不相混合的,不利于材料的透明和包埋等后期处理.因此需用脱水剂逐渐除去材料中的水分,以便让石蜡渗透进细胞.所以,脱水是制片的关键环节.脱水剂要求能与水混合,而且能与其他有机溶剂互相替代.
脱水必须在有盖的玻璃器皿中进行,防止吸收空气中的水分;在更换高一级的脱水剂时,最好不要移动材料,以免损坏材料.
(六)透明
透明剂要具有既能与脱水剂相混合又能和石蜡相混合的性质,可以将材料中的脱水剂置换出来,使石蜡能顺利进入材料中.
二甲苯是目前应用最广的透明剂,作用迅速,但易使材料变脆..
(七)浸蜡
是指逐步清除材料中的透明剂,以使石蜡充分渗透于材料内部的过程.这样,材料的各部分都能保持原来的结构与位置,切片不致发生破裂或其他变形.
浸蜡是一个渐进的过程,常用的正丁醇.
每次浸蜡的时间,视材料大小而调节.
(八)包埋
材料经过足够时间的浸蜡后,需包入蜡块,以备切片.
操作方法:根据切片材料大小,确定所需纸盒的尺寸,用表面光滑的磅纸预先叠好纸盒.
(九)切片
即将包埋好的材料块用切片机切成所需厚度的切片带.
(十)贴片
是用黏贴剂把切片平铺贴在载玻片上,以便于染色和观察.
常用的粘片剂有下列二种:
(1) 明胶黏片剂
(2) 蛋清黏片剂
(十一) 染色
即根据植物细胞中不同的化学性质,用染料分别进行染色,以利于观察切片中细胞与组织的形态与构造及其内含物等.染色基本程序为脱蜡,染色,分色封片.
染色方法可分为下列几类:
① 单染 只用一种染料染色.
② 双重染色 两种染料染色,如番红--固绿;苏木精---曙红.
③ 多重染色 多种染料染色,如番红—固绿—桔红G;酸性品红—苯胺蓝—桔红G等.
(十二) 封藏
封藏于中性树胶中,使材料能在显微镜下清晰地显示出来,并能长期保存.
方法:将含材料的载玻片放在吸水纸上(切片一面向上),迅速地在切片的中央滴一滴树胶(必须在二甲苯干燥前进行),用右手持小镊子轻轻地夹住盖玻片的右侧,稍微倾斜使其左侧与封藏剂接触,然后再缓慢地放下,避免产生气泡.
冷冻切片法：
冷冻切片的制作方法

（1）低温恒冷箱冷冻切片制作法

1．本室现有Shandon As 620 E型恒温箱冷冻切片机的主要性能。该机的箱面上有电子控制板，装有即时冷冻键和除霜键，启动即时冷冻键，机器马上进行工作状态，并可持续10mins。启动即时除霜键，可将工作间顶部后面的制冷栅上的霜除掉，并可持续15mins。有照明键一个，启动该键可照明工作间，有利工作及观察组织的冰冻状况。配有消毒键一个，当进行一周的工作或者一天的工作后，启动该键，可对工作间进行消毒。当每天工作完毕时，可启动密锁键，锁住工作间。除此之外，箱面的左边有四个按键，两个为快速自动进退键，两个为微小进退键，还有一个手动旋钮，调节修组织块时的进退。

冷冻箱内左边的冷冻台，温度可达-60℃左右，冷冻箱的中间为一台切片机，工作间的温度在0-30℃间可任意调节，并在箱面上的荧屏显示出来。

2．操作方法及步骤：

①取材，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，最好为24×24×2mm。

②取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻，形成一个小台后，再放上细小组织，滴上包埋剂。

③将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。

④调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在5～10um间。

⑤调好防卷板。制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。切片时，切出的切片能在第一时间顺利地通过刀防卷板间的通道，平整地躺在持刀器的铁板上。这时便可掀起防卷板，取一载玻片，将其附贴上即可。

⑥应视不同的组织选择不同的冷冻度。冷冻箱中冷冻度的高低，主要根据不同的组织而定，不能一概而论。如：切未经固定的脑组织，肝组织和淋巴结时，冷冻箱中的温度不能调太低，在-10- -15℃左右，切甲状腺、脾、肾、肌肉等组织时，可调在-15～20℃左右，切带脂肪的组织时，应调至-25℃左右，切含大量的脂肪时，应调至-30℃。

3．冰冻切片时的注意事项：

①防卷板及切片刀和持刀架上的板块应保持干净，需经常用毛笔挑除切片残余和用柔软的纸张擦。有时需要每切完一张切片后就用纸擦一次。因为这个地方是切片通过和附贴的地方，如果有残余的包埋剂粘于刀或板上，将会破坏甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。

②多例多块组织同时需做冰冻切片时，可各自放于不同的支承器上，于冷冻台上冻起来，然后依据不同的编号，依序切片，这样做既不费时也不会乱。

③放置组织冰冻前，应视组织的形状及走势来放置，所谓“砍柴看柴势”，切片也是如此，如果胡乱放置，就不能收到很好的效果。

④组织块不须经各种固定液固定，尤其是含水的固定液，在未达到固定前，更不能使用。临床快速冰冻切片，不须要预先固定，一是为了争取时间，二是固定了的组织，反而增加了切片的难度。如果使用未完全固定的组织做冰冻切片，就会出现冰晶。这是因为含水的固定液在组织未经固定前，其中的水份也可渗入到组织中去，当冰冻发生时，这些水份就存留于组织中，形成了冰晶。

⑤当切片时，如果发现冰冻过度时，可将冰冻的组织连同支承器取出来，在室温停留片刻，再行切片，或者用口中哈气，或者用大拇指按压组织块，以此来软化组织，再行切片。另者，调高冰冻点。

⑥用于附贴切片的载玻片，不能存放于冷冻处，于室温存放即可。因为当附贴切片时，从室温中取出的载玻片与冷冻箱中的切片有一种温度差，当温度较高的载玻片附贴上温度较低的切片时，由于两种物质间温度的差别，当它们碰撞在一起时，分子彼此间发生转移而产生了一种吸附力，使切片与载玻片牢固地附贴在一起。如果使用冷藏的载玻片来附贴切片，由于温度相同，没有发生上述的现象。

4．冰冻切片的快速染色法

冰冻切片附贴于载玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定1分钟后即可染色。以往，为了防止切片脱落，当切片附贴于载玻片后，即用电吹风吹干后再固定。根据实验对比认为这种做法欠妥未经固定的切片，强热作用后，蛋白发生变性，核内含有的物质由于热的作用融合在一起，染色后镜下分辨不出核内的各种物质。冰冻切片附贴于载玻片后，立即放入恒冷箱中的固定液固定，这样可以使切片中细胞内各种物质都在没有任何变化的情况下被固定起来，经一年多来1000例冰冻切片的制作实践认为这样制作固定切片好，核染色质清晰，核仁明显，其他物质都完好保存。

方法：

① 切片固定30秒－1分钟。

② 水洗。

③ 染苏木素3－5分钟。

④分化。

⑤ 于碱水中返蓝20秒。

⑥ 伊红染色10－20秒。

⑦脱水，透明，中性树胶封固。

冰冻组织1－2分钟，切片1分钟，固定1分钟，染色共五分钟。总共在10分钟内完成快速制片过程，结果与石蜡切片不相上下。

冰冻切片的方法还有很多种，如甲醇循环的半导体冰冻切片法，二氧化碳冰冻切片法，半导体冰冻切片法和氯乙烷冰冻切片法等，这些方法在目前来说已很少使用，因此在这里不作阐述。

I. 组织学常用切片技术的原理都是一样的吗

是的。
在组织学中，最常用到的有石蜡切片与冰冻切片。两者各有优缺点，在实验的应用上也有所不同，比如石蜡切老携败片常用于进行免疫组化实验，冰冻切片常用于免疫荧光实验。而两个实验都是应用免疫学基本原理——即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色隐前来确定组织细胞内蛋白质，对其进行定位、侍颤定性及相对定量的研究。
石蜡切片与冰冻切片在组织学中，蕞常用到的有石蜡切片与冰冻切片。

J. 谁有组织切片的制作过程

一、制备显微标本的切片法
一石蜡包埋切片制作法
这是最常用的切片法。以石蜡作为组织的填充支持介质，将整块组织加以包埋，最后凝固成均匀一致的固态结构。用切片机制取极薄的切片。为了让石蜡能浸入组织内部，需将组织经过脱水等处理。过程大致如下：
⑴固定：生物标本脱离机体或培养环境，细胞会发生自溶，腐败分解。因此，需用固定剂处理，使蛋白质凝固停止濒死或死后变化。凡供永久保存的标本都需经固定处理。
常用的固定剂是甲醛、乙醇等，能使蛋白质凝固。还有由几种试剂配成的固定液，例如Carnoy固定液，由无水酒精、氯仿、冰醋酸配成，固定力更快更强，不含水分，可避免水溶性物质如糖原等在固定过程中损失。
⑵脱水：是将组织细胞所含水分除去。通常用乙醇（Alcohol，酒精），浓度递升到 100%。此过程还使组织块进一步硬化。
⑶透明：是用既能溶于纯酒精又能融解石蜡的有机溶剂，将组织中的酒精取代，以便石蜡浸入。通常用二甲苯（xylene）为透明剂。
⑷浸蜡：在温箱内进行。已透明的组织块放入加热融解的石蜡中，让石蜡浸透组织，作为支持介质。
⑸包埋：将已浸蜡的组织块放入热融的包埋石蜡中，迅速冷凝，组织决便被蜡包埋。
⑹切片：用切片机。常用的切片机有轮转式、平推式的。用轮转式的易于切出连续切片。切片厚度随制片目的而调整。教学标本厚度多是5~6μm。
⑺贴片烤干：石蜡切片在温水上展平后，移在玻片上，烤干，即可供染色处理。染色后用树胶、盖坡片封固，可永久保存。
二冷冻切片法
冷冻切片法是借组织在低温下，冻结变硬而达到符合切片要求。冷冻切片法需有冷冻切片机，或在普通切片上配制冷设施。恒冷切片机是高级冷冻切片设备。它有一个恒冷箱，标本致冷台和切片机都装在箱内。恒冷箱的作用类似冰箱，可在一定范围内调整温度，其结构有利于保持箱内恒定低温，减少箱门打开时环境温度的干扰。切片机的轮转把手装在箱外，便于操纵切片。
冷冻切片法的优点是：在处理得当时，它可以最大限度地保持组织的新鲜状态。并且，由于不需经脱水、透明、浸蜡等过程中有机溶剂的处理，及湿箱浸蜡热的影响，甚至可不经固定。所以能很好地保存组织细胞的各种成分和酶的活性，因此在酶的组织化学研究中常用此切片法。
二、显示标本结构成分的染色法
一苏木素伊红染色法（HE染色法）
为最常用的染色法。该法应用于各种组织的染色，是组织学技术的基本方法，对任何液体固定的组织和各种包埋的切片均可使用，只是对不同包埋的切片法处理略有不同。下面简介石蜡包埋切片的HE染色法。
1、脱蜡：石蜡切片的组织内部充满石蜡，不能使水溶性染液着色，因此在染色前必须首先用二甲苯将石蜡脱掉，共两次。
2、下行入水：将已脱蜡的标本浸入无水酒精及各级酒精，使组织逐步接近水。3、蒸馏水略洗。
4、苏木素溶液染色约5—15分钟
5、自来水洗去多余染料。
6、入稀释的盐酸酒精溶液中分色，边分色边镜检，至核呈红紫色，细胞质无
色为合适。
7、分色后用自来水或加数滴氨水碱化，直至细胞核变成蓝色。这一步骤也可称为“蓝化”。
8、入蒸馏水洗去碱性水分。
9、入70%酒精→80%酒精各5分钟。
10、入伊红染液染色30秒至数分钟。
11、以95%酒精对伊红分色，至胞浆，结缔组织等呈桃红色。
12、上行脱水：染色后的切片，因组织内含水而不透明，不能清晰地观察其微细结构。因此，须将组织内的水分经各级酒精→无水酒精逐步置换，最后进入不含水份的透明剂内。
13、透明：入二甲苯透明剂，二次（各数分钟）。
14、取出切片：将组织周围多余的二甲苯擦去，滴树胶后加盖玻片封固。
结果：细胞核蓝紫色，胞浆、胶原纤维、肌纤维为桃红色，嗜酸性颗粒为鲜红色，弹性纤维呈明亮桃红色。
二组织化学和细胞化学染色法
组织化学和细胞化学，是将物理和化学的技术运用到组织标本，用显微镜和化学分析方法来研究组织和细胞内的化学成分，并观察该化学成分在组织、细胞内的定位、含量及其变化规律。这些化学成分借着化学反应所产生的不溶性着色物质来显示。对于某些化学成分，例如：Fe++糖原、核酸等，可以用直接或间接的化学反应产生着色沉淀而显示其部位和相对含量。对于酶类，显示它的活性，须有该种酶的底物（被该种酶作用的物质），由酶对底物的分解，直接或间接地生成着色物质而被显示。凡是在光学显微镜下观察细胞原位显示的化学物质，称组织化学，若用电镜观察细胞原位化学成分的着色部位，则称电镜细胞化学，下面从原理方面简要介绍几种常用的组织化学染色技术：
1、显示琥珀酸脱氢酶（SDH）活性的硝基-BT法：
（Succinate dehydrogenase）
⑴酶的定位及生物学意义：
琥珀酸脱氢酶是线粒体标志酶，其存在于所有有氧呼吸的细胞，和线粒体内膜紧密结合。该酶不需辅酶而自身有黄素蛋白（FP,Flavoprotein）为辅基。在组化反应中常用来反映三羧酸循环的情况。其催化过程如下：
弱-单甲（紫红色）
HOOC-CH2-CH2-COOHFPH2四唑（甲）↓
（有色）强-双甲（深紫蓝色）
（琥珀酸）（黄素蛋白）
HOOC-CH=CH=COOHFPH2四唑（无色）
（延胡索酸）
⑵原理：上述的反应最后一步的原理是，硝基-BT（Nitro-blue tetrozolyum，四唑氮蓝）系异环族化合物四唑盐，当它接受氢时，本身被还原为有色沉淀产物（甲
）（Formazan）。
⑶孵育液配制：
A液（贮备液）
0.2M磷酸缓冲液（PH7.6）10ml等量混合
0.2M琥珀酸钠（S01.succinate） 10ml备用
B液：
硝基四唑（Nitro-Br）2mg
2ml
0.2M磷酸缓冲液（PH7.6） 2ml
取：A液2ml
B液2ml孵育液
聚乙烯吡烷酮（PVP） 300mg
⑷方法：
①新鲜恒冷箱冷冻切片，厚6~8μm，平贴在盖玻片上。
②滴染法：将有冷冻切片的盖玻片（标本面朝上）平放于预热好的培养皿中（底部垫一湿滤纸），滴加孵育液至全部覆盖组织，于37℃温箱中孵育45~60分钟（肝，心肌组织15分钟即可）。
③于生理盐水中冲洗二次（轻晃，以防脱片）。
④10%福尔马林生理盐水固定10分钟。
⑤15%酒精浸洗5分钟（换二次）。
⑥甘油明胶封片。
⑸结果：酶活性强处呈蓝色颗粒（双甲沉淀），酶活性较低时形成紫红色单甲。在光镜下，该酶活性于肝小叶内分布呈明显分带现象，周边带强于中央带。在心肌细胞纵切面，酶活性颗粒沿心肌细胞长轴整齐排列，相邻心肌细胞的空白处为闰盘。

2、显示葡萄糖-6-磷酸酶（G-6-Pase）活性的铅法：
（Glucosel-phosphate phosphohydrolase）
①酶的定位及其生物学意义：
该酶主要位于内质网，是内质网的标志酶。G-6-Pase参与糖代谢，能水解葡萄糖-6-磷酸而释放出葡萄糖和磷酸。
⑵原理：G-6-Pase将底物（葡萄糖-6-磷酸钾盐）水解产生磷酸离子，后者被孵育液中的硝酸铅所捕获，最终反应物为颗粒状的硫化铅沉淀，其反应式如下：
酶Pb(NO3)2
葡萄糖-6-磷酸钾+H2O葡萄糖+磷酸

(NH4)2S
Pb2(PO4)2PbS↓
(无色)（棕色）
（试剂配制及方法详见组织学技术专着）
⑶结果：酶活性部位呈棕色硫化铅颗粒沉淀。在光镜下G-6-Pase活性颗粒较均匀地分布于胞质中。
3、显示碱性磷酸酶（APL）的钙钴法（Alkaline phosphohydrolase）
⑴酶的定位及其生物学意义：
ALP在碱性环境下能催化各种醇和酚的磷酸酯水解，参与磷酸根的跨膜转运过程，并有磷酸转移的作用，故在细胞膜上运输较活跃，如毛细血管内皮细胞，肾近曲小管刷状缘，肠上皮纹状缘等处，该酶的活性较高。
⑵原理：ALP将磷酸盐底物（如β-甘油磷酸钠等）分解产生磷酸根离子，后者为孵育液中的氯化钙捕获生成磷酸钙沉淀，但该沉淀为非金属盐，需加入硝酸钴，使其生成磷酸钴沉淀，因无色，再需通过硫化铵处理，形成棕黑色硫化钴沉淀而被显示。在PH9.2—9.4环境中表现最大活性。反应式如下：
ALPCa++
β-甘油磷酸钠磷酸离子Ca2(PO4)2

Co(NO3)2(NH4)2S
CO2（PO4）2CoS↓
（无色）（棕黑色）
⑶结果：酶活性部位为棕黑色CoS沉淀。
4、显示核酸的甲绿一派喏宁（Methyl green-pyronln）染色：
⑴原理：甲绿和派喏宁都是碱性染料，对两种核酸（DNA和RNA）能分别染色，其机制可能在于两种核酸分子都是多聚体，但聚合程度有所不同。甲绿具有两个带电荷的氨基，而派喏宁只有一个。因此在混合的染液中，二者竞争的结果是甲绿易与聚合程度较高的DNA结合呈现蓝绿色，而派喏宁则与聚合程度较低的RNA结合呈现红色。
（试剂制备及方法详见组织学技术专着）
⑶结果：核内DNA呈蓝绿色，核仁及胞质内RNA呈桃红色。
5、显示糖原的过碘酸雪夫氏（PAS）反应：
⑴原理：糖原是一种动物多糖，无色，富含于肝细胞和肌细胞胞质中。PAS反应（Periodic acid schiff Reaction）能在糖原所在部位生成紫红色物质，从而将之显示。RAS反应分为两步：首先是强氧化剂过碘酸（Periodic acid,分子式为HIO4），将糖原中的葡萄糖分子的C-C键打开，将CHOH-CHOH氧化，生成二醛基，然后Schiff试剂中的无色亚硫酸品红分子与糖的醛基结合，生成新的紫红色复合物。
HIO4schiff试剂
多糖醛基紫红色反应产物
（氧化）
（试剂配制及方法详见组织学技术专着）
⑵结果：糖原呈紫红色颗粒状。