㈠ 双层平板法测噬菌体效价的优缺点
双层平板法的优点:
①加了底层培养基后，可使原来底面不平
的玻璃皿的缺陷得到了弥补;
②所形成全部噬菌闷培体斑都接近处于同一平面上，因此不仅每一-噬菌斑的大小接近、边缘清晰，而且不致发生上下皮答噬菌斑的重叠现象;
③因上层培养基中琼脂较稀，故形成的燃罩慧噬菌斑较大，更有利于计数。
㈡ 微生物学基础，微生物的特征检查噬菌体有哪些方法
5 方法
5.1 噬菌体的检查
5.1.1 样品采集
将2～3g土样或5mL水样（如阴沟污水）放入灭菌三角瓶中，加入对数生长期的敏感指示菌（大肠杆菌(Escherichia coli)）菌液3～5mL，再加20mL二倍肉汤蛋白胨培养液。
5.1.2 增殖培养
30℃振荡培养12～18h, 使噬菌体增殖。
5.1.3 离心分离
将上述培养液以3000rpm离心15～20min, 取上清液，用pH7.0，1%蛋白胨水稀释至10-2～10-3，用于噬菌体检查及效价测定。
5.1.4 生物测定法
5.1.4.1双层此凳琼脂平板法
5.1.4.1.1 倒下层琼脂
融化下层培养基，倒平板（约10mL/皿）待用。
5.1.4.1.2倒上层琼脂
融化上层培养基，待融化的上层培养基冷却至50℃左右时，每管中加入敏感指示菌 (大肠杆菌(Escherichia coli)) 菌液0.2mL，待检样品液或上述噬菌体增殖液0.2～0.5mL，混合后立即倒入上层平板铺平。
5.1.4.1.3恒温培养
30℃恒温培养6～12h观察结果。
5.1.4.1.4 观察结果
如有噬菌体，则在双层培养基的上层出现透亮无菌圆形空斑──????噬菌斑。
5.1.4.2 单层琼脂平板法
省略下层培养基，将上层培养基的琼脂量增加至2%，融化后冷却至45℃左右，如同上法加入指示菌和检样，混合后迅速倒平板。30℃恒温培养6～16h后观察结果。
5.1.5 离心分离加热法（快速检查）
取大肠杆菌(Escherichia coli)正常培养液和侵染有噬菌体的异常大肠杆菌(Escherichia coli)培养液，4000rpm离心20min，分别取两组发酵液的上清液(A1)，一部分于721分光光度计上测定OD650光密度值，另外各取5mL上清液于试管中，置水浴中煮沸2min（A2），检测A2溶液OD650光密度值，记录结果。
5.2 噬菌体效价的测定
5.2.1 倒平板
将融化后冷却到45℃左右的下层肉膏蛋白胨固体培养基倾倒于11个无菌培养皿中，每皿约倾注10mL培养基，平放，待冷凝后在培养皿底部注明噬菌体稀释度。
5.2.2 稀释噬菌体
按10倍稀释法，吸取0.5mL大肠杆菌(Escherichia coli)噬菌体，注入一支装有4.5mL1%蛋白胨水的试管中，即稀释到10-1，依次稀释到10-6稀释度。
5.3 噬菌体与菌液混合
将11支灭菌空试管分别标记10-4、10-5、10-6和对照。森漏旅分别从10-4、10-5和10-6噬菌体稀释液中吸取0.1mL于上述编号的无菌试管中，每个稀释度平行做三个管，在另外两支对照管中加0.1mL无菌水，并分别于各管中加入0.2mL大肠杆菌(Escherichia coli)菌悬液，振荡试管使菌液与噬菌体液混合均匀，置37℃水浴中保温5min，让噬菌体粒子充分吸附并侵入菌体细胞。
5.4.4 接种上层平板
将11支融化并保温于45℃的上层肉膏蛋白胨半固体琼脂培养基5mL分别加入到含有噬菌体和敏感菌液的混合管中，迅速搓匀，立即倒入相应编号的底层培养基平板表面，边倒入边摇动平板使其迅速地铺展表面。水平静置，凝固后置37℃培养。
5.5 观察并计数
观察平板中的噬菌斑，并将结果记录于实验报告表格内，选取每皿有30～300个噬菌斑的平板计搜睁算噬菌体效价。
计算公式： N=Y/V?X
（N：效价值，Y：平均噬菌斑数／皿，V：取样量，X：稀释度）
例如：当稀释度为10-6时，取样量为0.1 mL/皿，同一稀释度中3个平板上的噬菌斑的平均值为186个，则该样品的效价为：N＝186／0.1×10-6＝1.86×109。
6 结果
6.1 噬菌体检查
6.1.1离心分离加热法
处理方法 OD650光密度值
正常发酵液（对照） 异常发酵液（试验）
离心上清液(A1)
离心上清液加热煮沸后(A2)
A2/A1
6.1.2 绘出平板上的噬菌斑检测结果，指出噬菌斑和宿主细菌。
6.2 噬菌体效价测定
6.2.1 平板上噬菌斑数目
噬菌体稀释度 10-4 10-5 10-6 对照
噬菌斑数（个）/皿
平均每皿噬菌斑数目
6.2.2 计算噬菌体效价(即噬菌斑形成单位pfu, plague-forming unit).
7 思考
1有哪些方法可检查发酵液中确有噬菌体存在？比较其优缺点。
2测定噬菌体效价的原理是什么？要提高测定的准确性应注意哪些操作？
3噬菌体与菌液混合后保温时间越长其吸附率越高的说法对吗？
回复
吸收率：在噬菌体和过量菌液混合后，菌/噬菌体混合液中未感染的噬菌体颗粒经过氯仿处理后，在不同时间点检测其数量。一般情况下几分钟内噬菌体即可大部分吸附到宿主菌上.
潜伏期：细菌与噬菌体混合作用5分钟后，彻底清洗以除去未结合的噬菌体。然后用新鲜的培养基重悬至相同体积。该重悬液在370C下孵育，其间有规则地收集噬菌体测滴度。
裂解量指的是单个宿主细菌被噬菌体完全裂解后所释放的噬菌体数量.具体检测方法本人也不是很清楚.
㈢ 扩毒时如何保证效价
保证效价的步骤：
一步生长曲线的实验方法如下：先把在对数期生长的敏感细菌悬浮液与适量的噬菌体混合，通常噬菌体和细菌的混合比例为1:10，避免几个噬菌体同时侵染毁知芹一个细菌细胞。经数分钟吸附后，混合液中加入一定量的该噬菌体的抗血清，以中和尚未吸附的噬菌体。然后再用培养液进行高倍稀释，以免发生第二次吸附和感染。培养后定时取样，将含噬菌体的样品与敏感猛念细菌混合，在平板上培养，计算噬菌斑数。结果可见，在吸附后的开始一段时间内（5～10min），噬菌斑数不见增加，说明噬菌体尚未完成复制和组装，这段时间称为噬菌体的潜伏期。紧接着在潜伏期后的一段时间（感染后20～30min），平板中的噬菌斑数突然直线上升，表示噬菌体已从寄主细胞中裂解释放出来，这段时间称为裂解期。每个被感染的细菌释放新的噬菌体的平均数称为裂解量。当宿主全部裂解，溶液中的噬菌体的效价达到最高点时称为平稳期。
定量描述烈性噬菌体生长规律的实验曲线。其基本步骤是用噬菌体的稀悬液感染高浓度的宿主细胞，以保证每个细胞至多不超过纤毕一个噬菌体吸附。数分钟后中止吸附并稀释后置于该细菌最适生长温度下培养。在一定时间内，每隔数分钟取样作效价测定。以效价为纵坐标，培养时间为横坐标所绘成的曲线即为一步生长曲线，它可以反映每种噬菌体的三个最重要的特性参数：潜伏期、裂解期、裂解量
㈣ 什么是噬菌体效价如何测定
噬菌体效价--------指噬菌体的浓度,即每毫升样品含噬菌体的个数.通常是在含敏感菌的平板上形成噬菌斑进行噬菌体的计数,以每毫升中含有的噬菌斑形成单位(plaque
forming
unit/ml或pfu/ml)表示其效价.
例如,若每块平皿加1
l稀释106倍的样品,可形成10个噬菌斑,则噬菌体效价为1010pfu/ml.(106*10*1000=1010;1ml=1000ml)
㈤ 测定噬菌体效价时,其他细菌的菌落是否会影响
不会。
噬菌体的效价就是一毫升培养液中所含活噬菌体的数量。效价测定的方法，一般应用双层琼脂平板法。由于含有特异宿主细菌的琼脂平板上，一个噬菌体产生一个噬菌体斑，因此，能进行噬菌体的计数。
操作步骤
1稀释噬菌体
2、噬菌体与菌液混合
3、混合液加入上层培养基内
4、接了种的上层培养基倒入底层平板上。
5、观察平板中的噬菌斑，将每一稀释度的噬菌斑数目记录于实验报告表格内，并选取30—300个噬菌斑的平板计算每毫升未稀释的原液的噬菌体数（效价）。
噬菌体效价=噬菌斑数*稀释倍数*10
㈥ 测定噬菌体效价需要严格控制哪些关键步骤
1.系列轿毁启稀释,即梯度稀释时,要换枪头,确保稀释准确
2.做平行试验,每个稀释度的倒3个平板
3.摸索噬菌斑大小的条闭如件,避免出现针尖状的余凯噬菌斑
㈦ 什么是噬菌体效价,简述双层平板法的原理与主要操作
噬菌体的分离纯化及效价的测定
1
目的
1.1
了解噬菌体效价的含义及其测定原理。
1.2
学会检查噬菌体的方法。
1.3
掌握用双层琼脂平板法测定噬菌体效价的操作技能。
2
原理
噬菌体是一类专性寄生于细菌和放线菌等微生物的病毒，
其个体形态极其微小，
用常规
微生物计数法无法测得其数量。
当烈性噬菌体侵染细菌后会迅速引起敏感细菌裂解，
释放出
大量子代噬菌体，
然后它们再扩散和侵染周围细胞，
最终使含有敏感菌的悬液由混浊逐渐变
清，
或在含有敏感细菌的平板上出现肉眼可见的空斑──噬菌斑。
了解噬菌体的特性，
快速
检查、分离，并进行效价测定，对在生产和科研工作中防止噬菌体的污染具有重要作用。
检样可以是发酵液、空气、污水、土壤等（至于无法采样而需检查的对象，可以用无菌
水浸湿的棉花涂拭表面作为检查样品）
。为了易于分离可先经增殖培养，使样品中的噬菌体
数量增加。
采用生物测定法进行噬菌体检查，
约需
12h
左右，
因而不能及时判断是否有噬菌体污染。
通过
快速检查可大致确定是否有噬菌体污染
，
以采取必要的防治措施。
根据
正常发酵
（培养）
液离心后菌体沉淀，
上清液蛋白含量很少，
加热后仍然清亮；
而侵染有噬菌体的发酵
（培养）
液经离心后其上清液中因含有自裂解菌中逸出的活性蛋白，
加热后发生蛋白质变性，
因而在
光线照射下出现丁达尔效应而不清亮
。
此法简单、
快速，
对发酵液污染噬菌体的判断亦较准
确。
但不适于溶源性细菌及温合噬菌体的诊断，
对
侵染噬菌体较少的一级种子培养液
也往往
不适用。
噬菌体的效价即1
mL
样品中所含侵染性噬菌体的粒子数。效价的测定一般采用双层琼
脂平板法。
由于在含有特异宿主细菌的琼脂平板上，
一般一个噬菌体产生一个噬菌斑，
故可
根据一定体积的噬菌体培养液所出现的噬菌斑数，
计算出噬菌体的效价。
此法所形成的噬菌
斑的形态、大小较一致，且清晰度高，故计数比较准确，因而被广泛应用。
㈧ 查氏培养基的基本原理
实验一 常用培养基的制备、灭菌与消毒
一、实验目的
了解培养基的配制原理；掌握配制培养基的一般方法和步骤；了解常见灭菌、清毒基本原理及方法；掌握干热天菌、高压蒸汽灭菌及过滤除菌的操作方法。
二、实验原理
培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢产物所需要的营养物质的混合物。培养基的原材料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因素和水。根据微生物的种类和实验目的不同，培养基也有不同的种类和配制方法。
牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供微生物生长繁殖之用。
干热天菌、高压蒸汽灭菌方法主要是通过升温使蛋白质变性从而达到杀死微生物的效果。
三、试剂与器材
1.器材 试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、培养基、分装器、天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH度纸、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、吸管、培养皿、电烘箱、注射器、微孔滤膜过滤器、镊子等。
2.试剂 牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂
四、实验内容
1.称量→溶化→调pH→过滤→分装→加塞→包扎→灭菌→无菌检查
2.干热灭菌：装入待灭菌物品→升温→恒温→降温→开箱取物
3.高压蒸汽灭菌：加水→装物品→加盖→加热→排冷空气→加压→恒压→降压回零→排汽→取物→无菌检查
4.过滤除菌：组装灭菌→连接→压滤→无菌检查→清洗灭菌
五、关键步骤及注意事项
1.要严格按配方配制。
2.调pH不要过头。
3.干热灭菌要注意物品不要堆放过紧，注意温度的时间控制，70ºC以下放物、取物。
4.高压灭菌要注意物品不要过多，加热后排除冷空气，到时降压回零取物。
5.过滤除菌要注意各部件灭菌，压滤时，压力要适当，不可太猛太快，滤膜要注意清洗保存。
六、思考题
1.培养基配好后，为什么必须立即灭菌?如何检查灭菌后的培养基是无菌的?
2.在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题?为什么?
3.培养微生物的培养基应具备哪些条件?为什么?
4.培养基的配制原则是什么?
实验二
土壤中微生物分离纯化培养
一、实验目的
掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术；了解不同的微生物菌落在斜面上、半固体培养基和液体培养基中的生长特征；进一步熟练和掌握微生物无菌操作技术；掌握微生物培养方法。
二、实验原理
从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的分离、纯化方法：单细胞挑取法，稀释涂布平板法，稀释混合平板法，平板划线法 稀释涂布平板法步骤：倒平板－制备土壤污水稀释液－涂布－培养－挑菌落；平板划线法步骤：倒平板－标记培养基名称－划线。
三、试剂与器材
1.器材 盛9m1无菌水的试管、盛90m1无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶、无菌玻璃涂棒、无菌吸管、接种环、酒精灯、无菌培养皿、显微镜、血细胞计数板等。
2.试剂 牛肉膏蛋白胨培养基，高氏1号培养基，查氏培养基
四、实验内容
1.土壤稀释液的制备
2.微生物分离纯化：稀释涂平板法，平皿划线分离法，微生物培养技术
五、关键步骤及注意事项
1.掌握含菌培养基的配制，严格控制温度。
2.平板划线应防止染菌，同时应注意划线深度及密度。
六、思考题
1.如何确定平板上某单个菌落是否为纯培养?请写出实验的主要步骤。
2.如果要分离得到极端嗜盐细菌，在什么地方取样品为宜?并说明理由。
实验三
菌种保藏
一、实验目的
1.学习并掌握菌种保藏的基本原理。
2.掌握常用的几种不同的菌种保藏方法。
二、实验原理
微生物个体微小、代谢旺盛、生长繁殖快，如果保存不妥容易发生变异和杂菌污染，甚至导致细胞死亡等现象。因此，保存好菌种是非常必要和重要的。常用的菌种保藏方法包括传代培养法、载体法、悬液法、冷冻法和真空干燥法
三、试剂与器材
1.材料 大肠杆菌、青霉菌、放线菌
2.试剂 液体石蜡、甘油、五氧化二磷、95％乙醇、10％盐酸、无水氯化钙、食盐、干冰
3.器材 无菌吸管、无菌滴管、无菌培养皿；安额管、冻干管、40目与100目筛子、油纸、滤纸条(0.5X1.2cm)、干燥器、真泵器、真空泵、真空压力表、喷灯、L形五通管、冰箱、低温冰箱(—30℃)、超低温冰箱和液氮罐等。
四、实验内容
1.斜面保藏法
2.液体石蜡法
3.穿刺保藏法
4.砂土管保藏法
5.冷冻真空干燥保存法
五、关键步骤及注意事项
1.清楚各种保藏方法的优缺点，针对不同要求选择适宜的保藏方法。
2.熔封安瓶时防止封闭不严。
3.液氮冻存操作应防止冻伤。
六、思考题
根据你自己的实验。谈谈1--2种菌种保藏方法的利弊?
实验四
细菌形态观察及单染色
一、实验目的
1.了解简单染色法的原理，并掌握其操作方法。
2.学习并掌握微生物涂片、染色的基本技术和无菌操作技术。
3.巩固显微镜(油镜)的使用方法。
4.初步认识细菌的形态特征。
二、实验原理
细菌个体微小，且较透明，必须借助染色法使菌体着色，与背景形成鲜明的对比，以便在显微镜下进行观察。根据实验目的不同，可分为简单染色法、鉴别染色法和特殊染色法等。简单染色法是最基本的染色方法，是利用单一染料对细菌进行染色。此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。常用碱性染料进行简单染色。
三、试剂与器材
1.材料 大肠杆菌，枯草芽孢杆菌
2.试剂 吕氏碱性美蓝染液(或草酸铵结晶紫染液)、齐氏石炭酸复红染液。
3.器材 显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、双层瓶(内装香柏油和二甲苯)等。
四、实验内容
简单染色法：涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→镜检
五、关键步骤及注意事项
1.涂片时，生理盐水及取菌不宜过多，涂片应尽可能均匀，
2.水洗步骤水流不宜过大，过急，以免涂片薄膜脱落。
六、思考题
1.你认为制备细菌染色标本时，尤其应该注意哪些环币?
2.为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察?
3.如果你的涂片未经热固定，将会出现什么问题?如果加热温度过高、时间太长，又会怎样呢?
实验五
放线菌及霉菌形态观察
一、实验目的
1.了解放线菌、霉菌形态观察的原理。
2.学习并掌握观察放线菌、霉菌形态的操作方法。
3.初步了解放线菌、霉菌的形态特征。
二、实验原理
放线菌是指能形成分枝丝状体或菌丝体的一类革兰氏阳性细菌。常见放线菌大多能形成菌丝体，紧贴培养基表面或深入培养基内生长的叫基内菌丝(简称“基丝”)，基丝生长到一定阶段还能向空气中生长出气生菌丝(简称“气丝”)，并进一步分化产生孢子丝及孢子。有的放线菌只产生基丝而无气丝。在显微镜下直接观察时，气丝在上层、基丝在下层，气丝色暗，基丝较透明。孢子丝依种类的不同，有直、波曲、各种螺旋形或轮生。
霉菌可产生复合分枝的菌丝体，分基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。霉菌菌丝体(尤其是繁殖菌丝)及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多，常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍，因此，用低倍显微镜即可观察。人们设计了各种培养和观察方法，这些方法的主要目的是为了尽可能保持放线菌自然生长状态下的形态特征。本实验采用插片法。
插片法：将放线菌接种在琼脂平板上，插上灭菌盖玻片后培养，使放线菌菌丝沿着培养基表面与盖玻片的交接处生长而附着在盖玻上。观察时，轻轻取出盖玻片，置于载玻片上直接镜检。这种方法可观察到放线菌自然生长状态下的特征，而且便于观察不同生长期的形态。
三、试剂与器材
1.材料 黑曲霉、青霉和根霉，细黄
㈨ 生物 求解 请问效价该怎么计算
噬菌体效价=噬菌斑数×稀释倍数×10。
噬菌体的效价就是一毫升培养液中所含活噬菌体的数量。在使用双层琼脂平板法测定噬菌体效价时，由于在含有特异宿主细菌的琼脂平板上，一个噬菌体产生一个噬菌斑，因此，能进行噬菌体的计数。但因噬菌斑计数方法其实际效率难以接近100%(一般偏低，因为有少数活噬菌体可能未引起感染)，所以为了准确地表达病毒悬液的浓度(效价或滴度)一般不用病毒粒子的绝对数量而是用噬菌斑形成单位(Plaque-forming units,简写成pfu)表示。
㈩ 噬菌体检测上限
噬菌体效价的测定5.2.1 倒平板将融化后冷却到45℃左右的下层肉膏蛋白胨固体培养明缓仿基倾倒于11个无菌培养皿中，激纤每皿约倾注10mL培养基，平放，待冷凝后在培养皿底部注明噬菌体稀释度。5.2.2 稀释噬菌体按10倍稀释法，吸取0.5mL大肠杆菌噬菌体，注入一支装有4.5mL 1%蛋白胨水的试管中，即稀释到10-1，依次稀释到10-6稀释度。5.3 噬哪孙菌体与菌液混合将11支灭菌空试管分别标记10-4，10-5，10-6和对照。分别从10-4，10-5和10-6噬菌体稀释液中吸取0.1mL于上述编号的无菌试管中，每个稀释度平行做3个管，在另外2支对照管中加0.1