用于测定抗体最常用的方法是

❶ 艾滋病抗体的检查方法

艾滋病病毒抗体检测
艾滋病病毒抗体检测：检测血液中的艾滋病病毒抗体是目前最常用的检测艾滋病病毒感染的实验室方法，一般要经过两个步骤：首先做初筛试验，如果为阳性，再做确认试验，确认试验阳性才可诊断为艾滋病病毒感染。
常用的方法有：
1病原检测病原检测主要指用病毒分离培养、电镜形态观察、病毒抗原检测和基因测定等方法从宿主标本中直接检测病毒或病毒基因。由于前两种方法难度大，且需要特殊设备和专业技术人员。因此仅抗原检测和RT-PCR(反转录－PCR)可用于临床诊断。
2 抗体检测血清中HIV抗体是判断HIV感染的间接指标。根据其主要的适用范围，可将现有HIV抗体检测方法分为筛检试验和确证试验。
3 确证试剂筛检实验阳性血清的确证最常用的是Western blot（WB），由于该法相对窗口期较长，灵敏度稍差，而且成本高昂，因此只适合作为确证实验。随着第三代和第四代HIV诊断试剂灵敏度的提高，WB已越来越满足不了对其作为确证实验的要求。FDA批准的另一类筛检确证试剂是-免疫荧光-试验（IFA）。IFA比WB的成本低，而且操作也相对简单，整个过程在1-1.5小时内即可结束。此法的主要缺点是需要昂贵的荧光检测仪和有经验的专业人员来观察评判结果，而且实验结果无法长期保存。现在FDA推荐在向WB不能确定的供血员发布最终结果时以IFA的阴性或阳性为准，但不作为血液合格的标准。
4筛检试验筛检试验主要用于对供血员进行筛查，因此要求操作简便，成本低廉，而且灵敏、特异。目前世界上主要的筛检方法仍然是ELISA，还有少数的颗粒凝集试剂和快速ELISA试剂。ELISA有很高的灵敏度和特异性，操作简单，仅需要实验室配备酶标仪和洗板机即可应用，特别适合于试验室大规模筛检使用。颗粒凝集实验是另一种操作简单方便，成本低廉的检测方法，该方法结果可通过肉眼判定，灵敏度很高，特别适合发展中国家或大量筛选供血员时使用，缺点是必须使用新鲜样品，特异性较差。80年代后期发展起来的斑点印迹检测（Dot-blot assay）是一种快速ELISA（Rapid ELISA）方法，这种方法操作极为简便，过程短暂，整个过程多数在5-10分钟内甚至3分钟内即可结束，但该法比ELISA和颗粒凝集试剂昂贵得多。金免疫测定是以胶体金为标记物，以硝酸纤维素膜为载体的固相免疫测定，分为渗滤和层析两种形式。用于HIV抗体检体金试纸条属于金免疫层析，且大多数为间接法及双抗原夹心法，两种方法各有优缺点，但都简单而快速，数分钟即可得出结论，不需仪器设备，操作人员不需特殊训练，试剂稳定，适用于单份测定等。

❷ 指出ELISA有哪几种常用方法各种方法在操作上有什么异同

• 也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂。双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）时，操作步骤如下：

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• 1） 将特异性抗体与固相载体联结。RF是一种自身抗体，即先包被与固相抗原相应的抗体，然后加入抗原。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。

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• 假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，例如HBsAg的a决定簇。

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• 2;夹心复合物"，血清中的其他成份在洗涤过程中被洗去，以提高试验的特异性.间接法测抗体

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• 间接法是检测抗体常用的方法。乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同。小分子激素，HBsAg有adr，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作一步检测。

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• 在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时。采用F（ab'）或Fab片段作酶结合物的试剂，由于去除了Fc段。抗原中也不能含有与酶标抗人Ig反应的物质，例如来自人血浆或人体组织的抗原，如不将其中的Ig去除，测知标本中抗原的量，直接包被不易成功，可采用捕获包被法、hCG等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。

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• 3）加酶标抗抗体。可用酶标抗人Ig以检测总抗体。

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• 4.竞争法测抗体

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• 当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质，此时反应后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的吸光值相同，如按常法测读，形成固相抗原。洗涤除去抗原中的杂质;（conjugate）：

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• 1）将特异性抗原与固相载体联结，故称为间接法。操作步骤如下，多为IgM型，能和多种动物IgG的Fc段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF，它可充当抗原成份.Coli成份，很可能与受过E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗体发生反应。此法中受检标本不需稀释。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，但一般多用酶标抗人IgG检测IgG抗体，与结合在固相上的抗原反应。抗HBe的检测一般采用此法。

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• 5.竞争法测抗原

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• 小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合，非特异IgG可直接吸附到固相载体上，应注意可测范围的最高值，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成"。如抗原为高纯度的，可直接包被固相。如抗原中会有干扰物质;（immunosorbent）、ayr，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体.双抗原夹心法测抗体

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• 反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型：

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• 1.双抗体夹心法测抗原

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• 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时，反应甚至可不显色而出现假阴性结果、adw，固相载体上只留下特异性抗体；（2）酶标记的抗原或抗体，称为"结合物"：（1）固相的抗菌素原或抗体，保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，在检测过程中标本须先行稀释（1。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关。

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• 4）加底物显色

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• 本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。

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• 间接法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果，可直接用于测定，这也是用单抗作夹心法应注意的问题。

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• 双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（RF）的干扰，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。

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• 3） 加酶标抗体。另外如抗原中含有无关蛋白，也会因竟争吸附而影响包被效果，然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应，也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在HBsAg的检测中应注意亚型问题，已被列为这类试剂的一项考核指标。

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• 间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性。病人血清中受检的特异性IgG只占总IgG中的一小部分。

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• 3。

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• 4） 加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色、AFP。

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• 双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，寻找合适的标记方法。另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合，洗涤后再加入酶标抗体，试验中也发生假阳性反应:40~1:200）。IgG的吸附性很强，即"免疫吸附剂"，例如HBsAg，但应尽可能予以纯化。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物，所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应（hook effect）。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳性反应，例如以E.Coli为工程酶的重组抗原，如其中含有E，从而消除RF的干扰。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。竞争法测抗体有多种模式，因此其敏感度相对高于间接法；（3）酶反应的底物、ayw4个亚型，因其不能形成两位点夹心，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。

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• 2）加稀释的受检血清、HBeAg，有时也可吸附到包被抗原的表面。因此在间接法中，抗原包被后一般用无关蛋白质（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封闭（blocking）固相上的空余间隙。另外，以避免过高的阴性本底影响结果的判断，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。

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• 2） 加受检标本、药物等ELISA测定多用此法。

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• 6.捕获包被法测抗体

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• IgM抗体的检测用于传染病的早期诊断中。间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或IgG抗体。如用抗原包被的间接法直接测定IgM抗体，因标本中一般同时存在较高浓度的IgG抗体，后者将竞争结合固相抗原而使一部份IgM抗体不能结合到固相上。因此如用抗人IgM作为二抗，间接测定IgM抗体，必须先将标本用A蛋白或抗IgG抗体处理，以除去IgG的干扰。在临床检验中测定抗体IgM时多采用捕获包被法。先用抗人IgM抗体包被固相，以捕获血清标本中的IgM（其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM）。然后加入抗原，此抗原仅与特异性IgM相结合。继而加酶标记针对抗原的特异性抗体。再与底物作用，呈色即与标本中的IgM成正相关。此法常用于病毒性感染的早期诊断。甲型肝炎病毒（HAV）抗体的检测模式。

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• 类风湿因子（RF）同样能干扰捕获包被法测定IgM抗体，导致假阳性反应。因此中和IgG的间接法近来颇受青睐，用这类试剂检测抗CMV IgGM和抗弓形虫IgM抗体已获成功。

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• 7.ABS-ELISA法

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• ABS为亲和素(avidin)生物素(biotin)系统(system)的略语。亲和素是一种糖蛋白，分子量60000，每个分子由4个能和生物素结合的亚基组成。生物素为小分子化合物，分子量244。用化学方法制成的衍生物素-羟基琥珀酰亚胺酯可与蛋白质和糖等多种类型的大小分子形成生物素标记产物，标记方法颇为简便。生物素与亲和素的结合具有很强的特异性，其亲和力较抗原抗体反应大得多，两者一经结合就极为稳定。由于一个亲和素可与4个生物素分子结合，因此如把ABS与ELISA法可分为酶标记亲和素-生物素（LAB）法和桥联亲和素-生物素（ABC）法两种类型。两者均以生物素标记的抗体（或抗原）代替原ELISA系统中的酶标抗体（抗原）。在LAB中，固相生物素先与不标记的亲和素反应，然后再加酶标记的生物素以进一步提高敏感度。在早期，亲和素从蛋清中提取，这种卵亲和素为碱性糖蛋白，与聚苯乙烯载体的吸附性很强，用于ELISA中可使本底增高。从链霉菌中提取的链霉亲和素则无此缺点，在ELISA应用中有替代前者的趋势。由于ABS-ELISA较普通ELISA多用了两种试剂，增加了操作步骤，在临床检验中ABS-ELISA应用不多。。其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体。在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合，抗HBc ELISA一般采用此法，虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性

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❸ 抗体效价怎样检查

医院测抗体一般是用ELISA方法。灵敏度很高的。
在其他地方，还有血凝抑制试验，琼脂扩散试验，抗体蛋白纯化定量，抗体活性检测等。
根据要求不同，选择不同的方法，现在医院最常用。使用方便的就是ELISA试剂盒。
原理是:在反应板上包上抗原，然后加入检测样品液(血清，组织液等，需要处理一下)，如果检测样品中有抗体，就可以与抗原结合，再加入酶标记的抗抗体，就可以和样品中抗体结合，加入显色剂，显色后，检测，通过吸光度的多少，确定抗体的含量。

❹ ELISA检测方法的原理及其优缺点是什么

ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、牵9体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。即:用于检测抗体的间接法(图a)、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。
优点：操作方便，实验可靠，缺点：暂未发现

❺ 免疫学的检测方法

免疫学检测方法可分为体液免疫和细胞免疫。

❻ elisa试剂盒实验原理

上海科艾博生物（COIBO）科技
从大的方面说ELISA属于酶免疫技术。 免疫酶技术是将酶作为标记物，标记抗体或抗原后，与相应的抗原或抗体发生反应，通过标记酶相应底物的颜色反应作抗原抗体的定性和定量的检测依据。
目前应用最多的免疫酶技术是酶联免疫吸附实验（ELISA），如果要分类的话，它属于异相固相酶免疫技术。所谓异相是指在检测时不需要将酶标记抗原抗体和游离抗原抗体分开，所谓固相就是指的ELISA的96孔板固相载体了。看下面均相酶免疫测定的原理图：
ELISA的主要原理很简单，有这么三个， 1、包被 抗原或者抗体能以物理性吸附于固相载体表面，可能原理是蛋白质和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，吸附之后能保持抗原抗体反应等免疫活性； 2、标记 抗原或者抗体可通过共价键与酶连接成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫活性和酶的催化特点； 3、显色 酶结合物与相应包被在固相载体的抗原或者抗体结合后，也被固定在固相载体上，加入酶的底物之后可出现显色反应，根据反应的颜色深浅可计算抗原或者抗体的相对含量。ELISA 实验设计根据检测对象的不同，我分别给童鞋们介绍抗原的检测方法设计和抗体的检测方法设计。抗原的检测设计 1、双抗夹心法 针对至少2个抗原决定簇的多价抗原。首先介绍一下抗原决定簇，抗原决定簇就是决定抗原性的特殊化学基团，也叫抗原表位，理论上一个抗原决定簇能诱导产生一种单克隆抗体（可能有童鞋又要问单克隆抗体是神马东东了，以后介绍啊）。由6－12氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列（线性表位）组成或由不连续的蛋白质三维结构（构象表位）组成。临床上具有2个抗原决定簇的多价抗原有很多，比较常见有HBsAg、AFP、HCG等大分子抗原。检测步骤也简单，就是包被、洗涤、加样、洗涤、加样、洗涤、显色。具体说来是先将纯化的相应抗体包被在固相载体上，再加入待测样品，若其中含有待测抗原就会与固相抗体结合，洗掉杂质后，再加入酶标记的检测抗体进行反应，洗掉多于的酶标抗体后，加入底物显色，显色与否以及颜色的深浅就代表了待测抗原是否存在以及相对含量了，简单吧。
对于双抗夹心法检测大分子抗原要注意几点，1.固相抗体和酶标检测抗体一定是分别针对待测抗原的两个不同抗原决定簇，不然两个抗体就会为争同一个决定簇而打架，会出现假阴性的不良结果；2.如果检测的样本是血清，就要注意风湿病患者体内内风湿因子RF这种奇葩异种抗体的存在，它能够神奇地结合固相抗体和检测抗体，造成假阳性的不良结果；3.包被的固相抗体含量一定是高于样品中的抗原含量，不然检测到的含量会比实际含量低；4.如果有童鞋想高端省事一些，将待测样品与酶标检测抗体同时加入固相载体，在酶标检测抗体高于样品中的待测抗原的情况下，会出现假阴性结果，这种现象书本叫钩状效应。 2、竞争法 针对小分子抗原。这种方法也可以用于大分子抗原，只是相对双抗夹心法这种强悍的策略，竞争法完全没有优势，所以竞争法只在检测小分子这个边缘地带发挥余热了。临床上主要用于T3、T4、孕酮等激素以及药物等。检测步骤与双抗夹心法更简单，包被、洗涤、加样、洗涤、显色，少了一步加样的过程，但是设计上复杂一些，首先将纯化的相应抗体包被在固相载体上，然后每组样本需要分两组，一组同时加入事先混匀好的酶标检测抗原和样本的混合物，一组只加入酶标记抗原，两组颜色只差便是待测抗原的含量，有点晕啊。
对于竞争法也需要注意一点，酶标记抗原和待测样本一定要事先混匀好，然后同时加入固相载体，不然会造成不公平竞争，检测出现偏差；抗体的检测设计 就方法来说，有间接法、双抗原夹心法、竞争法和捕获法四种设计。 1、 间接法，这个是检测抗体最常用也最简单的方法。操作步骤与双抗夹心一样，只是包被是纯化的相应抗原而不是抗体了，加入样品后洗涤，再加入的酶标记抗抗体，然后显色，颜色深浅与样品中待测抗体的浓度正相关。这个间接法的原理和步骤与双抗夹心一样一样的，为了区分就把包被抗原检测抗体叫做间接法了，以此类推，之前的双抗夹心法也可以叫做直接法，命名其实就是这么回事，规则多了就容易让人糊涂。间接法也有一些自己的特点，1.酶标记抗抗体可选择性检测抗体的亚型，可用于鉴别感染时期，如果是IgM那么提示感染早期；2.酶标抗抗体检测抗体特异性不高，容易产生假阳性，如果封闭不完全，可出现全板阳性，挺吓人的。临床上常用该方法检测抗HCV抗体、抗HEV抗体、抗CMV抗体、抗HSV抗体、抗沙眼衣原体抗体等等。
2、 双抗原夹心法，这个完全是山寨双抗夹心法的。原理和步骤也与双抗夹心一样一样的，与间接法相比，具有优越的灵敏度和特异性，但不是很常用，因为就目前的技术条件，想得到能用于ELISA检测的纯化抗原还是有一定的难度。临床上常用于检测HIV抗体初筛，TP抗体和抗HBs抗体等，这些检测对特异性和灵敏度，准确性都要求特别高。
3、 竞争法，和检测抗原设计的竞争法完全一致，临床上用的不多，我仔细总结了一下两个很具有代表性的，也各具特点。1、抗HBc抗体，检测方法与抗原相同，包被抗原之后，分两组，一组加入预先混匀的酶标抗体和待测样品，一组只加入酶标抗体，两组的显色之差可代表待测抗体的相对含量，需注意的是待测抗体与酶标抗体是同一物质；2、抗HBe抗体检测，方法与抗原竞争法设计稍有区别，包被的抗HBe抗体后，检测也分两组，一组先加入酶标HBeAg再立即加入待测样品，一组只加酶标HBeAg，两组显色之差代表待测抗体的相对含量，这种设计中包被抗体和待测抗体是同一物质。值得注意的是混合组不是事先混匀再加入，而是先加入待测抗体后再加入酶标抗原。所有的这些复杂的注意事项确实很容易把人搞晕，但是童鞋们只需要记住一条，竞争很残酷，我们就要想尽一切办法保证竞争的公平性，这样就不会错。
4、 捕获法，这种方法比较少用，由于具有识别抗体类型的优点，仅用于需要早期诊断的急性感染或者具有爆发性感染的疾病，如HAV-IgM、HBc-IgM、ToRCH等等。原理还是逃不脱经典的双抗夹心，具体方法是先包被能识别抗体类别的抗抗体，洗涤后加样品，再洗涤，加酶标记抗原，洗涤后显色，这些步骤闭上眼睛都能写出来。

最后说两句，与抗原检测不同，抗体检测的设计不是根据抗体的结构特点了，这么多种设计方法，童鞋们用的时候就会选择障碍了，掌握2个原则，1.实验要求，如果需要特异性和准确性特别高，那肯定是双抗原夹心法，要求马马虎虎，那就间接法，如果要明确抗体类型，最好的选择就是捕获法了；2.实验成本，与纯化抗体不一样，有时候想要获得纯化的抗原是非常困难的，更别说两种不同的纯化抗原了，所以双抗原夹心法临床上用的并不多。ABS-ELISA顺便说一下ABS-ELISA设计，其实是和上面说的一样的，通过亲和素-生物素系统（ABS）方法显色反应，增加检测灵敏度而已，但是增加操作步骤与实验成本，而且现在单克隆抗体的技术越见成熟，抗体特异性和亲和力大大提高，灵敏度已经不是问题，所以这些次等装备已经不常用。
结果判定最后和童鞋说说ELISA结果判定，分定性和定量两种。对于定性试验，参比阴、阳性对照的吸光度，以P/N或者S/CO比值形式报告。1. P/N比值是指（待测样本-空白对照）/（阴性样本-空白对照），一般以P/N≥2.1判为阳性，或许求知欲旺盛的童鞋会问，那么竞争法用P/N比值怎么判，呵呵，这里先不说，卖个乖，你可以网络或者私信我啊；2. S/CO比值，S是待测样本吸光度值，CO为CUT-OFF值，通常取值阴性对照平均值的2.1倍。S/CO比值≥1为阳性，竞争法S/CO比值≤1为阳性。定量检测没有什么可说的，老老实实做标准曲线，既锻炼实验操作能力，又可作为实验内部参照。
记得有这么个规定，定性检测不能目测判断，要凭借酶标仪检测，定量要在每次实验都得与待测样本相同实验条件下绘制标准曲线，有一难度，但是为了对实验负责，你就从了吧。

❼ 指出ELISA有哪几种常用方法各种方法在操作上有什么异同应用有什么异同

ELISA的类型
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗菌素原或抗体，即"免疫吸附剂"（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原或抗体，称为"结合物"（conjugate）；（3）酶反应的底物。根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件，可设计出各种不同类型的检测方法。用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型：
1.双抗体夹心法测抗原
双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：
1） 将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。
2） 加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。
3） 加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。
4） 加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作一步检测。
在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成"夹心复合物"。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，此时反应后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的吸光值相同，如按常法测读，所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应（hook effect），因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时，反应甚至可不显色而出现假阴性结果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）时，应注意可测范围的最高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。
假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，例如HBsAg的a决定簇，也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在HBsAg的检测中应注意亚型问题，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4个亚型，虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性，这也是用单抗作夹心法应注意的问题。
双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（RF）的干扰。RF是一种自身抗体，多为IgM型，能和多种动物IgG的Fc段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF，它可充当抗原成份，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳性反应。采用F（ab'）或Fab片段作酶结合物的试剂，由于去除了Fc段，从而消除RF的干扰。双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响，已被列为这类试剂的一项考核指标。
双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。
2.双抗原夹心法测抗体
反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体。与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。
3.间接法测抗体
间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：
1）将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。
2）加稀释的受检血清，保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，血清中的其他成份在洗涤过程中被洗去。
3）加酶标抗抗体。可用酶标抗人Ig以检测总抗体，但一般多用酶标抗人IgG检测IgG抗体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关。
4）加底物显色
本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。
间接法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果，但应尽可能予以纯化，以提高试验的特异性。特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质，例如以E.Coli为工程酶的重组抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能与受过E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗体发生反应。抗原中也不能含有与酶标抗人Ig反应的物质，例如来自人血浆或人体组织的抗原，如不将其中的Ig去除，试验中也发生假阳性反应。另外如抗原中含有无关蛋白，也会因竟争吸附而影响包被效果。
间接法中另一种干扰因素为正常血清中所含的高浓度的非特异性。病人血清中受检的特异性IgG只占总IgG中的一小部分。IgG的吸附性很强，非特异IgG可直接吸附到固相载体上，有时也可吸附到包被抗原的表面。因此在间接法中，抗原包被后一般用无关蛋白质（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封闭（blocking）固相上的空余间隙。另外，在检测过程中标本须先行稀释（1:40~1:200），以避免过高的阴性本底影响结果的判断。
4.竞争法测抗体
当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。如抗原为高纯度的，可直接包被固相。如抗原中会有干扰物质，直接包被不易成功，可采用捕获包被法，即先包被与固相抗原相应的抗体，然后加入抗原，形成固相抗原。洗涤除去抗原中的杂质，然后再加标本和酶标抗体进行竞争结合反应。竞争法测抗体有多种模式，可将标本和酶标抗体与固相抗原竞争结合，抗HBc ELISA一般采用此法。另一种模式为将标本与抗原一起加入到固相抗体中进行竞争结合，洗涤后再加入酶标抗体，与结合在固相上的抗原反应。抗HBe的检测一般采用此法。
5.竞争法测抗原
小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。
6.捕获包被法测抗体
IgM抗体的检测用于传染病的早期诊断中。间接法ELISA一般仅适用于检测总抗体或IgG抗体。如用抗原包被的间接法直接测定IgM抗体，因标本中一般同时存在较高浓度的IgG抗体，后者将竞争结合固相抗原而使一部份IgM抗体不能结合到固相上。因此如用抗人IgM作为二抗，间接测定IgM抗体，必须先将标本用A蛋白或抗IgG抗体处理，以除去IgG的干扰。在临床检验中测定抗体IgM时多采用捕获包被法。先用抗人IgM抗体包被固相，以捕获血清标本中的IgM（其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM）。然后加入抗原，此抗原仅与特异性IgM相结合。继而加酶标记针对抗原的特异性抗体。再与底物作用，呈色即与标本中的IgM成正相关。此法常用于病毒性感染的早期诊断。甲型肝炎病毒（HAV）抗体的检测模式。
类风湿因子（RF）同样能干扰捕获包被法测定IgM抗体，导致假阳性反应。因此中和IgG的间接法近来颇受青睐，用这类试剂检测抗CMV IgGM和抗弓形虫IgM抗体已获成功。
7.ABS-ELISA法
ABS为亲和素(avidin)生物素(biotin)系统(system)的略语。亲和素是一种糖蛋白，分子量60000，每个分子由4个能和生物素结合的亚基组成。生物素为小分子化合物，分子量244。用化学方法制成的衍生物素-羟基琥珀酰亚胺酯可与蛋白质和糖等多种类型的大小分子形成生物素标记产物，标记方法颇为简便。生物素与亲和素的结合具有很强的特异性，其亲和力较抗原抗体反应大得多，两者一经结合就极为稳定。由于一个亲和素可与4个生物素分子结合，因此如把ABS与ELISA法可分为酶标记亲和素-生物素（LAB）法和桥联亲和素-生物素（ABC）法两种类型。两者均以生物素标记的抗体（或抗原）代替原ELISA系统中的酶标抗体（抗原）。在LAB中，固相生物素先与不标记的亲和素反应，然后再加酶标记的生物素以进一步提高敏感度。在早期，亲和素从蛋清中提取，这种卵亲和素为碱性糖蛋白，与聚苯乙烯载体的吸附性很强，用于ELISA中可使本底增高。从链霉菌中提取的链霉亲和素则无此缺点，在ELISA应用中有替代前者的趋势。由于ABS-ELISA较普通ELISA多用了两种试剂，增加了操作步骤，在临床检验中ABS-ELISA应用不多。

❽ 酶联免疫反应的过程是什么样的

基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。

（一）双抗体夹心法

双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：

（1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。

（2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。

（3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。

（4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。

根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。

（二）双位点一步法

在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步（图15-5）。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显着提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。

在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。

（三）间接法测抗体

间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：

（1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。

（2）加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。

（3）加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人IgG抗体。

（4）加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。

本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。

（四）竞争法

竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。操作步骤如下：

（1）将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。

（2）待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。 （3）加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。

（五）捕获法测IgM抗体

血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法，先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。操作步骤如下：

（1）将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤。

（2）加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。

（3）加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。

（4）加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。

（5）加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。

（六）应用亲和素和生物素的ELISA

亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉和素（strepavidin）。生物素（biotin）又称维生素H，分子量244.31，存在于蛋黄中。用化学方法制成的衍生物，生物素－羟基琥珀亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与ELIS偶联起来，就可大提高ELISA的敏感度。

亲和素－生物素系统在ELISA中的应用有多种形式，可用于间接包被，亦可用于终反应放大。可以在固相上先预包被亲和素，原用吸附法包被固相的抗体或抗原与生物素结合，通过亲和素－生物素反应而使生物素化的抗体或抗在相化。这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。另外，在常规ELISA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素－酶结合物，以放大反应信号。