目前核酸提取常用方法

‘壹’ 核酸的检测

核酸的检测其实可以检测出部分病毒，比如艾滋病和新型冠状病毒之类的，不过核酸的检测在检测前是有注意事项的，比如能不能吃东西，能不能抽烟喝酒等等，这都可能影响检测结果，接下来我们来具体了解一下核酸的检测知识吧。

核酸的检测试剂及颜色变化

核酸的检测有试剂的检测，那么核酸的检测试剂及颜色变化是什么样的呢？

核酸的检测试剂及颜色变化为：红色是阳性，绿色是阴性。最常用的病毒快速检测方法主要有两大类：核酸检测，核酸（DNA 或 RNA）是病毒的遗传物质，筛选其中独一无二的特征核酸序列进行检测可准确确定病原体。

还有抗原抗体免疫检测，病毒作为抗原可激发人体免疫反应产生抗体，可以通过抗原抗体特异性相互结合的特性进行检测。当然，不论是哪种检测技术，只有操作简单，设备要求低，速度快，效率高才是王道。例如：针对新冠病毒的检测，主要是通过基于实时荧光PCR技术原理研发的核酸检测试剂进行快速确诊，基于抗体检测技术原理研发的核酸检测试剂进行补充检测。

核酸的检测方法有哪几种

核酸的检测方法并不只是有一种的，具体核酸的检测方法有哪几种呢？

核酸检测采用咽拭子检测，有口咽拭子采样和鼻咽拭子采样两种方式。口咽拭子采样就是在咽喉部位用棉签涂擦，取咽喉部上皮细胞的检测，检测方法一般是受检测者张口发出“啊——”的声音，检测人员用棉签采取样本，检测过程并没有创伤风险，是非常安全的检测。还有是鼻咽拭子采集，一般是将一根细棉签深入鼻孔，从下鼻道深入抵达鼻咽后壁，然后捻转棉签取样，一般检测很有可能会有呕吐的感觉，所以需要忍耐一下。

阳性(+)和阴性(-)是实验结果的判别方式之一，被称为定性检查。核酸检测阳性代表感染了病毒。核酸检测的操作要求较高，若因采样不当导致样本病毒含量低，或运输储存条件不当等情况，都有可能导致核酸检测可能出现假阴性结果。

核酸检测前注意事项

核酸检测前是有一些准备事项的，具体核酸检测前注意事项有哪些呢？

核酸在检测前，应当注意的是不要过度地吃东西，另外要少喝水，如果是在鼻子有症状或者是有咽喉症状的话，尽量不要去检测核酸。首先我们要知道这个核酸的检测，它是确定新型冠状病毒肺炎的一个很重要的方法。

其实通过核酸检测的结果，可以确诊或者是排除患者的新冠病毒的诊断，或者是确诊或者是排除。在检测的时候，医护人员会拿一个非常长的棉签，我们叫咽拭子，在咽后壁进行旋转、取样，如果我们吃太多的食物，很可能会引起恶心反射、咳嗽反射，从而导致误吸，一定要空腹。但是如果我们有咽喉部或者鼻部的炎症，也不适合去采样，容易出现大出血，所以还是等情况稳定的时候去做核酸。

核酸的检测时间怎么算

核酸的检测结果不会马上出来，那么对于核酸的检测时间怎么算呢？

核酸的检测一般是从做完核酸采样之后开始算时间。对于发热门诊患者的核酸检测，应在6小时内报告结果，并努力将报告时间缩短至4小时。对于普通门急诊患者、住院患者和护理人员的核酸检测，原则上应在12小时内报告结果。对于愿意接受检测的人的核酸检测，结果通常在24小时内报告。

目前，核酸的检测采用实时定量PCR方法被广泛应用于检测COVID-19特异性核酸片段。测试时，医生会用类似拭子的拭子擦拭扁桃体和咽凹附近的分泌物，或通过鼻腔清除鼻咽后部的分泌物，然后将其放入试管中，然后送到检验部门做相应的病毒核酸检测。核酸检测通过五个步骤完成：取样、样品保留、保存、核酸提取和计算机检测。

‘贰’ 认识核酸提取的知识笔记2020-05-07

一．核酸抽提原理：

核酸抽提包含样品的裂解和纯化两大步骤。其是：裂解样品中的核酸游离在体系；纯化游离的核酸，使之与体系中的其它成分分离（如蛋白质、盐及其它杂质彻底分离）。

常用的裂解液：包括去污剂 (如 SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20 等) 和盐 (如 Tris、EDTA、NaCl 等)。

去污剂的作用，是通过使蛋白质变性、破坏膜结构、解开与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中。

盐的作用，除了提供一个合适的裂解环境 (如 Tris)，还包括抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏 (如 EDTA)、维持核酸结构的稳定 (如NaCl) 等。

裂解体系中还可能加入蛋白酶，利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白质的分开，同时，也便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。也有直接使用高浓度的蛋白质变性剂 (如 GIT、GuHCl 等) 裂解的，该方法已经成为了 RNA 抽提的主流，却不是基因组 DNA 抽提的主流。

二．最常用的纯化方法

（一） PC 抽提（Phenol-chloroform extraction：酚氯仿抽提）+醇沉淀：利用PC对裂解体系进行反复抽提以去除蛋白质，实现核酸与蛋白质的分离，再用醇将核酸沉淀下来，实现核酸与盐的分离。

（二）介质纯化：利用某些固项介质，在某些特定的条件下，选择性地吸附核酸，而不吸附蛋白质及盐的特点，实现核酸与蛋白质及盐的分离。

（三）高盐沉淀去除蛋白质是第一种纯化方法的一个变体，省略了PC操作的麻烦，也有不纯化的抽提方法，但是用途多局限于简单的 PCR。

三．裂解方法的评价

（一）含蛋白酶的裂解方法是抽提基因组 DNA 的首选。包括裂解游离的膜蛋白与基因组 DNA 相连接的游离蛋白质。

（二）不使用蛋白酶的去污剂裂解方法，在细胞基因组 DNA 抽提方面仍然有优势。尤其是当得率和纯度要求不是最高，而经济性及操作简单很重要时，控制好裂解液/样品的比例是该方法成功的关键。该方法结合高盐沉淀，可以实现最简单的操作，但纯度及得率的稳定性可能会比用 PC 抽提的差一些。

（三）高浓度蛋白质变性剂 (如 GIT、GuHCl 等) 的裂解方法是抽提 RNA 的首选。

（四）含 CTAB 的裂解液，几乎成为富含多糖的样品，如细菌、植物的基因组 DNA 抽提的首选裂解方法。

（五）SDS 碱裂解法是质粒抽提的首选裂解方法，具有快速、得率高、几乎无基因组 DNA 污染的特点。

（六）PCR 模板的简易裂解方法，也是使用面很广的一类方法。该方法的特点是无须纯化，样品被裂解后即可直接取裂解液用于 PCR，非常快速。

四．纯化方法的评价

（一）PC 抽提/醇沉淀方法：稳定、可靠、经济、方便。PC 抽提可以彻底去除蛋白质，醇沉淀可以去除盐，对于一般的干净的样品 (杂质为蛋白质)，该方法完全可以获得高质量的核酸。

（二）高盐沉淀蛋白质/醇沉淀方法：同样也是一个非常不错的方法。与 PC 抽提方法相比，除了纯度的稳定性可能要低一点外，该方法几乎克服了 PC 抽提的所有缺点。更快、更轻松去除蛋白质所伴随的好处是，可以用于大规模抽提，不足是纯度 (蛋白质残留) 不够稳定。

（三）介质纯化方法：是一个越来越受到重视的方法。其最大特点是非常适合大规模核酸抽提，并且因为受人为操作因素影响小，纯度的稳定性很高 (虽然纯度不一定比PC 纯化方法更高)。其致命弱点是样品过量。介质可以分为两大类，一类是柱式的，即介质被预先装填在下面是通的柱子里；另外一类则是颗粒状 (如Glassmilk、磁性小珠等)。

五．醇的沉淀

醇的沉淀，目的是使核酸从裂解体系中沉淀下来，从而实现核酸与其它杂质（主要是盐）的分离。实际操作中，许多杂质也会与核酸一起被醇沉淀下来，尤其是当其它杂质的浓度也比较高的时候。醇的沉淀并不是非常特异性的，任何有机大分子及一些盐，当浓度达到一定水平后，都可能同步被沉淀下来。最有参考价值的是 TRIzol 提供的一个沉淀方案：一半异丙醇加一半高盐溶液替代纯粹的异丙醇，可以大大降低多糖残留。

PEG、LiCl、CTAB 都可以用于核酸沉淀。虽然它们远没有醇沉淀的高使用频率，但却各有特点。LiCl 可以沉淀 RNA 以去除DNA，CTAB 可以从含多糖的裂解体系中将核酸沉淀下来。PEG是沉淀病毒颗粒的方便手段。

六．洗涤

洗涤首先一定要将沉淀悬浮起来；第二就是要有一定的时间，尤其是当核酸沉淀比较大时 (使核酸沉淀最终蓬松)；第三是少量多次；第四则是去上清要彻底。

七．核酸质量的检测问题

目前用于正式实验前检测核酸质量的方法，一是电泳，二是紫外分光光度仪。

（一）电泳检测的主要是核酸的完整性和大小，只要核酸不是太小或者太大 (超出电泳分离范围)，电泳还可以用于估计核酸的浓度，但其准确度与经验有关；另外，电泳也可能提供某些杂质污染的信息。

（二）紫外分光光度仪检测的是纯度和核酸含量，该仪器的灵敏度非常高，A230 : A260 : A280 = 1 : 2 (DNA 为 1.8) : 1 为理论上的数据，实际测定时会有一些差别；但如果差别太大，就有问题了。如： A260/A230 > 2 就是纯的，如果 A260/A280

> 2.3 就是核酸降解，A260/A230比2大许多，一定是有杂质残留的。

八．核酸的溶解和保存

纯化后的核酸，最后多使用水或者低浓度缓冲液溶解；其中 RNA以水为主，DNA 则多以弱碱性的 Tris 或者 TE 溶解。经典的 DNA 溶解方法多提倡使用 TE 溶解，认为 EDTA 可以减少DNA 被可能残留下来的 DNase 降解的风险；如果操作过程控制得当，DNase 的残留几乎是可以忽略的，完全可以直接使用 Tris 或者水 (pH 接近 7) 溶解DNA。

实验室常用保存方法: -20℃保存的 DNA， -70℃保存的RNA。

‘叁’ 核酸几种方法

1.定磷法。简单快捷，灵敏度高，但易受蛋白质和核苷酸影响。
2.定糖法。灵敏度高，但特异性差，戊糖也会产生反应，容易产生干扰。
3.紫外线吸收法。适用于浓度大的核酸溶液，而人体感染新冠病毒后，咽部所含的病毒量极少，无法通过此种方法被检测。
4.荧光法。目前广泛被使用的是荧光定量RT-PCR检测法，通过对标本进行逆转录扩增、使病毒片段达到一定数量，可以被检测到，但是由于受采样标本、运输等多种因素影响，也有假阴性的可能。

‘肆’ 核酸提取中除去蛋白质的方法主要有哪几种

可以用氯仿抽提之后离心，离心后分三层，下层有机层中有一些脂溶性的杂质，中间层白色絮状沉淀是蛋白，上清液中即含有核酸。也有很多试剂盒，是可以把核酸挂在柱子上，把蛋白质等杂质离心掉，这个方法即快捷又方便。

凝胶过滤，这是很容易去除小分子杂质物质的方法。

如果蛋白样本和核酸的分子大小差别比较大，可以考虑用超滤的方法。

超滤是以压力为推动力的膜分离技术之一，以大分子与小分子分离为目的 。

加入核酸酶消化三个小时。

比如加一定量的DNAase 和RNAse酶消化。

(4)目前核酸提取常用方法扩展阅读：

核酸模板在核酸聚合酶、引物、四种单脱氧核苷酸存在条件下复制或转录时，如果在四管反应系统中分别按比例引入四种双脱氧核苷酸，只要双脱氧核苷酸掺入链端，该链就停止延长，链端掺入单脱氧核苷酸的片段可继续延长。

如此每管反应体系中便合成以共同引物为5’端，以双脱氧核苷酸为3’端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后，分四个泳道进行电泳。以分离长短不一的核酸片段（长度相邻者仅差一个核苷酸），根据片段3’端的双脱氧核苷酸，便可依次阅读合成片段的核苷酸排列顺序。

‘伍’ 核酸提取或纯化技术主要有哪几类

核酸提取或纯化技术主要有三类：

1、传统方法（操作复杂，耗时长）

2、离心柱法（试剂盒）

3、磁珠法（可单独采购磁珠或买成品试剂盒）

其中，磁珠法可实现自动化操作，是目前比较主流的方法。

核酸提取应用在疾病控制中心、临床疾病诊断、输血安全、法医学鉴定、环境微生物检测、食品安全检测、畜牧业和分子生物学研究等多种领域。

(5)目前核酸提取常用方法扩展阅读：

核酸提取的注意事项：

1、仪器的安装环境：正常的大气压(海拔高度应该低于3000m)、温度20-35℃、典型使用温度25℃、相对湿度10%-80%、畅通流入的空气为35℃或以下。

2、避免将仪器放置在靠近热源的地方，如电暖炉；同时为防止电子元件的短路，应避免水或者其他液体溅入其中。

3、进风口和排风口均位于仪器背面，同时避免灰尘或纤维在进风口聚集，保持风道的畅通。

4、核酸提取仪离其他竖直面至少10cm。

5、仪器接地：为了避免触电事故，仪器的输入电源线必须接地。

6、远离带电电路：操作人员不得擅自拆解仪器，更换元件或进行机内调节必须有持证的专业维修人员完成，不要在接通电源的情况下更换元件。

‘陆’ 核酸的提取方法有几种

DNA的提取方法有7种：酚抽提法、甲酰胺解聚法、玻璃棒缠绕法、异丙醇沉淀法、表面活性剂快速制备法、加热法快速制备、碱变性快速制备。核酸是一类生物聚合物，是所有已知生命形式必不可少的组成物质。核酸是脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）的总称。
脱氧核糖核酸（英文DeoxyriboNucleicAcid，缩写为DNA）是生物细胞内含有的四种生物大分子之一核酸的一种。DNA携带有合成RNA和蛋白质所必需的遗传信息，是生物体发育和正常运作必不可少的生物大分子。DNA由脱氧核苷酸组成的大分子聚合物。脱氧核苷酸由碱基、脱氧核糖和磷酸构成。其中碱基有4种：腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）。