神经毒素常用检测方法

Ⅰ 中毒预警：海洋毒素，身为吃货的你可要注意哟。

海洋毒素种类繁多, 其中贝类毒素是危害较大者之一 。贝类毒素包括麻痹性贝类毒素(PSP)、腹泻性贝类毒素(DSP)、神经性贝类毒素(NSP)和健忘性贝类毒素(ASP)。

1麻痹性贝类毒素

麻痹性贝类毒素因人食用了含这种毒素的贝类后会引起以外周神经 肌肉系统 麻痹 为初始症状的中毒效应而得名。 甲藻 类中的亚历山大藻、膝沟藻属、原甲藻属等一些赤潮生物种是PSP的直接生产者。

麻痹性贝类毒素的毒理主要是通过对细胞钠通道的阻断，造成神经系统传输障碍而产生麻痹作用。国际许可的安全剂量是每100mg贝类组织含80Lg毒素(以石房蛤毒素计)。

2腹泻性贝类毒素

腹泻性贝类毒素是从紫贻贝的肝胰腺中分离出来的一种脂溶性毒素，因被人食用后产生以 腹泻 为特征的中毒效应而得名。它主要来自于鳍藻属(Dinophysis)，原甲藻属(Prorocentrum)等藻类，它们在世界许多海域都可生长。

腹泻性贝类毒素，由三种不同的聚醚化合物组成，其中软海绵酸主要作用于小肠，可导致腹泻及吸收上皮细胞的退化，同时它也是很强的肿瘤促进剂。栉膜毒素通过小鼠实验表明是一种肝脏毒素，当对小鼠进行腹膜内注射时会导致肝脏坏死。而硫化物毒素会对小鼠的心肌造成损伤。

3神经性贝类毒素

神经性贝类毒素因人类一旦食用这些染毒贝类便会引起以麻痹为主要特征的食物中毒，或在赤潮区吸入含有有毒藻类的气雾，会引起 气喘、咳嗽、呼吸困难等中毒症状 而得名。神经性贝类毒素是贝类毒素中唯一的可以通过吸入导致中毒的毒素。神经性贝类毒素主要来自于短裸甲藻(Ptychodisusbrevis)、剧毒冈比甲藻(Gambierdiscums tox-incus)等藻类。

神经性贝类毒素的毒理是：与麻痹性毒素相似，作用于钠通道，作用位点与石房蛤毒素不同，引起钠通道维持开放状态，从而引起钠离子内流，造成神经细胞膜去极化。 对新鲜的、冷冻的或罐装制品的牡蛎、蛤类和贻贝的神经性贝类毒素最大允许限量为20MU/100g。

4健忘性贝类毒素

健忘性贝类毒素是一种强烈的神经毒性物质，因可 导致记忆功能的长久性损害 而得名。这类毒素主要来自于diatoms Nitzschiapungens和Nitzschia pseudodelicatissima，这些藻类主要生长在美国、加拿大、新西兰等海域。在日本海域的微藻Chondria armata也可导致健忘性贝类毒素的发生。

采用酶联免疫法定量检测 试剂盒 是水产检测部门常用的检测方式，免疫学测定方法以抗原一抗体特异性反应为基础，其中包括凝集反应、沉淀反应、补体反应等。可用于PSP，DSP和NSP的检测，其原理是将兔子等实验动物暴露在毒素中，以功能性抗原刺激兔子产生抗体，然后从兔子的血清中提取抗体。抗体可用放射性或荧光物质标记。提取的贝类毒素或匀浆后的贝类组织(如贻贝)暴露于标记物中，然后检测抗血清一抗原混合物中放射性或荧光强度以测定样品中的毒素的含量。

Ⅱ 石房蛤毒素的检测方法

在食品卫生和安全方面，随着海洋环境的恶化，赤潮的大量发生，世界对贝毒的检验更加重视。美国从1925年就建立了贝毒监测制度，1958年以后，贝产地STX允许量为80μg/100g（相当于400MU/100g）。日本、加拿大等都有类似的规定。饮水中的STX及类似物含量健康警戒线为3μg/L。
生物检测法包括：（1）生物毒性试验法。小鼠生物法是AOAC推广的检测麻痹性贝类毒素的标准方法，是国际上都能接受的唯一的方法。该方法在检测样本总毒性方面相当成功，但是无法准确定性样本中单个毒素。此外，还有家蝇生物分析法、蝗虫生物分析法。上述3种生物分析技术原理相似。（2）细胞毒性试验法。石房蛤毒素具有Na+通道阻滞剂的特性，可拮抗箭毒、藜芦碱的作用，以减少或“解救”细胞形态的改变及细胞裂解死亡，且该拮抗或“解救”作用与毒素的量呈对应关系。根据该对应关系可以计算出毒素的含量。早期建立的方法是用显微镜计数活细胞数以检测PSP毒素的量，但试验时间长，操作繁琐，所需细胞量大。在该原理之上发展起来一种STX的快速诊断装置MIST，已成功用于酸性粗毒中PSP总毒性的测定及STX、neoSTX、GTX和dcSTX相关毒性的测定，该装置的灵敏度高，检测迅速且无需组织培养的设备及专业知识。（3）免疫分析技术。随着抗STX抗体的获得，免疫分析技术如血球凝聚反应、放射免疫分析（RIA）和酶联免疫分析（ELISA）等逐渐发展起来，其中直接竞争ELISA法是最常用的一种方法，检测限可达3pg/ml，间接ELISA的检测限也可达到10pg/ml。免疫方法灵敏度高，方便迅速，但抗体的获得是其关键，各毒素的交叉反应低，不能完全体现样品的毒性来源。（4）受体分析法。即固相受体结合法（solid-phase receptor binding assay），主要是根据PSP毒素能与Na+通道蛋白质结合的特点，应用同位素标记以检测PSP类毒素的量，具有快速、可靠、准确的特点。Llewellyn等以一种特异结合STX的类似转铁蛋白Saxiphilin代替Na+通道蛋白质，其对STX的鉴定具有专一性，从而与TTX的鉴定相区别。
仪器测定法包括（1）HPLC法及其联用技术。HPLC 法灵敏度高，专一性强，检出限量低，分析时间短，能够提供更多的毒素信息，是毒素检测的主要手段。但石房蛤毒素分子本身的生色基团很微弱，不易被检测，因而检测前要将其氧化成荧光生色团，用荧光检测器进行检测。氧化手段主要有柱前氧化和柱后氧化，柱后氧化在分离柱后另加的一个柱上进行，简化了操作步骤。随着质谱技术的发展，液质联用技术成为物质鉴定的一个强有力手段。（2）薄层色谱法（TLC）。TLC法是检测PSP毒素的传统方法之一，使用已较少。但新的检测设备的出现为其发展提供了新的空间。I在层析柱上对STX及其同系物进行棒状薄层层析分离，以火焰热离子检测器（FTID）进行检测，结果STX的检出限为5ng，其余同系物的检出限也均达到ng级。另外，气相色谱、离子交换柱层析、电泳法等均是检测STX毒素的传统技术，方法优劣各异。 小鼠生物测定法（mouse bioassay，MBA）是在STX得到鉴定之前就已经研究出来的检测方法，并且其它的检测方法都以该方法作为参照。MBA用于检测STX已经有很长的历史，是AOAC于1958年确认的法定检测方法。大部分国家依然在使用该方法。该方法技术上简单易行且不需特殊设备。鼠类的神经细胞对STX的反应与人类神经细胞的反应一样，因此，该方法的测定结果直接关系到人类健康的风险评估。多数国家规定海洋贝类产品中STX可接受的最大含量为80μg STXeq/100g，墨西哥控制在30μg STXeq/100g，菲律宾控制在40μg STX eq/100g。但也有人认为80μg STXeq/100g的检测限可以保证人类的健康不受威胁。这类毒素在饮用水中的含量规定也不同。1999年研究人员等通过实验计算出了饮用水中PSTs可接受的最大含量为3μg STXeq/L。后来，澳大利亚将这个浓度应用到了饮用水标准中，巴西将其定为强制性的法规标准，新西兰将这个浓度定为饮用水中可接受的最大含量。但是，MBA对该浓度的敏感度不够，样品不经过浓缩很难检测出来。MBA的最低检测限为40μg STXeq/100g，相当于0.2μg/mLSTX，或200μg/L STX。因此，尽管MBA一直被广泛应用于检测经生物富集作用而STX含量高的海产品中，却不适用于饮用水中STX含量的检测，同时无法准确定性样本中单个毒素，而且实验动物检测方法在某些地区已经被禁止。针对存在的这些问题，逐渐研究出一些新的检测贝毒的方法，如化学、生物化学、毒性测定等方法，同时也可用于检测淡水蓝藻和被污染的水源。
运用细胞生物测定法来检测PSTs含量的方法已经建立，并且可以代替MBA进行毒性检测，该方法专门用于检测像STX这类可以阻断电压门控Na+通道的毒素。神经瘤细胞测定是在神经细胞内的Na+通道水平上检测PSTs。STX是一种Na+通道阻断剂，其功能是可以通过与打开钠通道的藜芦定的拮抗作用检测出来。最初建立的细胞生物测定法是通过鼠神经母细胞瘤的形态学作为端点来评估测定结果，随后Jellet和Manger对这种方法进行了改进，采用色度法显示有更好的选择性。因此，如果实验室能承担得起基于MS的检测方法的仪器费用，那么这种检测方法在将来很可能会代替STX的色谱分析。 通过末点来测定细胞的活力，从而使其更便于自动控制。在这种测定方法中，神经瘤细胞培养于96孔细胞培养板中，用Na+通道激活剂藜芦定处理，增强Na+以及Na+/K+-ATP酶抑制剂乌本甙的内流，从而阻断Na+外流。在PSTs的存在下，通过使用MTT（3-[4，5-二苯基-2羟基]-2，5-二苯基四唑来测定细胞活力。通过使用标准量的藜芦定和乌本甙，细胞受保护的程度可以通过与PSTs的标准量对比，以此来定量PSTs的总量，然后结果转换成STX当量。鼠和人的成神经瘤细胞都可以用于该测定方法。
Saxiphilin是一种结构与转铁蛋白相似的蛋白，研究表明，其与PSTs有很高的亲和力。然而，不同的Saxiphilin对不同的类似物有不同的亲和力。到为止，从热带蜈蚣（Ethmostigmus rubripes）体内分离的Saxiphilin在试验中有最小的选择性。利用这一特性，Llewellyn LE等建立了检测PSTs的特异受体法，该方法的检测限为6.3μg STXeq/L，或1.3μg STXeq/100g贝肉。但研究人员声明，在没有额外的基质干扰下，如果增大样本容量，该方法的检测限会降低。从热带蜈蚣体内提取粗Saxiphilin的程序很简单，制备的产物很稳定，可以反复冻融，在-80℃下可以保存一年以上。编码Saxiphilin蛋白的基因克隆，以及文库的构建已经完成，可以通过真核表达系统表达该蛋白，并且得到的表达产物具有生物活性。更进一步的研究证明，同时采用SCBA 和Saxiphilin受体检测法检测介虫和贝类体内的非PSTs钠离子通道活性，其实用性很好，因为非PSTs如河鲀毒素（TTX）不与Saxiphilin结合，而且检测结果与HPLC和MBA的结果有很好的相关性。
该方法最初是用来监测贝类和鱼类产品中的海洋毒素，并且在检测海洋神经毒素类方面得到了很好的验证。其他的研究人员也运用此法检测在淡水蓝藻细菌中占优势的PSTs的衍生物，进一步对该法进行了的验证。研究表明，神经细胞瘤生物测定法得出的结果与鼠生物法测定的结果很接近（相关系数R2=0.96），而且有敏感性更高的的优点，其检测限为10ng STXeq/mL提取物（相当于2.0μg STXeq/100g 贝肉）。通过细胞生物测定法获得的结果与色谱法得到的结果也有很好的相关性。然而，生物测定法有其独特的优点，即对任何可以抑制Na+通道的毒素，无论是已知的PSTs类似物，还是未知的变异体，都有很好的敏感性。正如Humpage 等所描述，该测定方法可以检测未定性的、不能被色谱法检测出来的很多毒素。细胞生物测定法不能区分相似的毒素，只能提供一个所有毒素的累积效应值，因此与MBA相比，在细胞培养测定中该方法很难确定相关毒素类似物的毒性反应，除非将每个类似物进行单个的分析。然而，Llewellyn等提供的相关数据表明，当使用复杂的PSTs混合物时，细胞生物测定法与MBA相比是一个很好的毒性预测器。Llewellyn等还同时使用MBA、细胞培养测定、HPLC和放射性受体测定对含有复杂的PSTs的21种贝肉提取物进行了分析，在这四种检测技术中，与MBA相关的细胞培养测定法的测定结果与预期的毒性最接近。但是，细胞生物测定法依然存在一些缺点。首先，由于该方法依赖藜芦定和乌本甙的拮抗作用，必须使用适当的浓聚物以使其与PSTs反应敏感。正如Jellet等所讨论的，任何毒素浓聚物浓度的改变都会降低该方法对PSTs检测的敏感性。其次，该方法的标准检测装置运行慢，需要很长的细胞孵育时间（24-48 h），才能对成神经瘤细胞形成细胞毒性作用。 HPLC 被广泛用于有机化合物的分离，同时也是第一种用于检测PSTs的仪器分析方法。然而，该技术也存在一些缺点，首先需要毒素标准品作参照，其次缺少用来制备荧光产物的光反应酶或后置柱衍生物化法的载色体，尤其是在样品制备过程中PSTs可能会发生化学转化。这种转化经常会使低毒的毒素变成毒性强的毒素，导致无法确定原始样品中毒素的真实毒性。因此，毒素的变异促使检测方法也不断发展，促进更精确的抽提和分离方法的发展。最早的STX理化检测方法是由Bates和Rapoport提出的，由于缺乏STX的载色体，这种方法只能在碱性环境下，将STX用过氧化氢氧化成荧光化合物以达到检测的目的。那时，人们认为这种方法的敏感度比鼠生物法的要高，并且建议用这种方法来进行贝类样品的常规检测。然而，这种方法操作很复杂，使用好几种溶剂和10步以上的化学过程。他们对这种方法进行了改进，增加了精确度和可重复性，但这种方法的操作依然很复杂。
在20世纪80年代，许多研究机构使用诸如X射线衍射、薄层色谱-荧光检测、高速液相色谱（HSLC）等方法发现了新的化合物。1975年，Shimizu等第一次描述了gTX1、GTX2、和gTX3的存在。使用葡聚糖凝胶g或生物胶P-2聚丙烯酰胺凝胶柱，通过稀乙酸洗脱，从gTX成分里分离出了STX，然后使用HSLC将gTX的峰值分解成三种不同的毒素。1987年，Oshima和他的合作者开发了一种后置柱氧化法，该方法可以详细地分析天然甲藻、水华、贻贝、牡蛎等抽提物中所含的PSTs。与Oshima的后置柱氧化法相反，Lawrence等研制了使用前置柱氧化的液相色谱法，来产生带荧光的PSTs衍生物。他们证明，使用过氧化氢氧化对分析非羟基化毒素的敏感性更强，而高碘酸盐氧化作用对分析羟基化毒素的敏感性更强。在这一时期，他们改进了这种技术，例如向高碘酸盐氧化剂中添加了铵甲酸盐，从而改善了neoSTX、GTX1、B2和C3的分析结果，而且由于添加了这种化合物到流动相，使neoSTX和B2的色谱分析更好。由于在检测过程中，pH对检测结果的影响很大，研究人员在检测过程中对pH进行了控制。Gago-Martinez等使用前置柱方法时，分别将高碘酸盐和过氧化物氧化过程的pH调节到7.2-12和8.2-12.8，最后得到的荧光氧化产物的产量不同。当pH在8.2时，通过高碘酸盐氧化作用neoSTX的产量达到了最大，而pH在10-11.5时，STX、GTX2/3、dcSTX和gTX5的产量也都达到了最大。Lawrence等声明采用柱前氧化pH很容易控制，因此结果的可重复性更强，因为在后置柱氧化时pH变化很小，相应对标记上荧光的产物的产量影响很小。然而，尽管柱前方法相对比较简单，但是一些PSTs形成了相同的氧化产物，另外一些形成了不只一种荧光产物。这种方法被建议作为一种筛选方法来为监测程序服务。最初的提议是首先使用高碘酸盐氧化方法，当检测出大多数PSTs，并且毒素浓度超过常规检测限80μg STXeq/100g时，接着采用过氧化氢氧化。色谱氧化法已经用于检测贝类中的毒素，研究PSTs在不同地区鼠脑的分布，他们认为这种方法很合适，敏感度也很高，因此该方法已被欧洲国家确定为检测PSTs的官方检测方法之一。然而，Ben-Gigirey等进行了实验室研究，推断尽管该方法适合于检测研究，但对含有更复杂毒素的样品进行分析时，得到的结果不理想，并且也不是对所有的PSTs都有效。此外，该法只是针对STX、GTX2/3、dcSTX、dcGTX2/3等毒素类似物，可以得到满意的检测结果。Turner等使用该标准对Lawrence的方法进行了进一步的验证，主要包括其选择性、线性、检测限、准确性、回收率、精确度、可重复性、适用性，同时也包括添加dcNeoSTX、dcGTX2/3等PSTs。Turner等对该方法进行了改进，以增加氧化产物的稳定性，改善了固相离子交换的纯度，最终推断该方法可以得到满意的结果。
液相色谱-质谱联用法（Liquid chromatography–mass spectrometry，LC-MS）是一种有效的检测技术，可以用来鉴定未知的化合物，定量已知的物质，阐明新分子的化学性质和结构，实现检测的高敏感度、可选择性、精确定量和高通量。然而，LC-MS价格昂贵，需要有专业知识的技术人员操作和维护。尽管如此，Quilliam建议将LC-MS检测方法作为检测海洋毒素的普遍方法。MS检测PSTs面临的挑战之一是离子配对剂对目标化合物的离子化产生干扰，因此离子配对剂要对PSTs有高效的反相色谱。因此，Jaime等研制了一种色谱方法，该方法使用基于非离子配对洗脱和后置柱电化学氧化的阴阳离子串联交换柱。Dell’Aversano等开发了一种实用的亲水性液相色谱法，该方法不仅可以分离主要的PSTs，而且还可以分离蓝藻细菌中的甲醛类毒素、柱孢藻毒素等。采用该方法，在质谱仪运行选择性反应监控程序时，检测出了15种PSTs，并鉴定出了新的毒素类似物。Diener及其合作者使用两性离子亲水作用色谱法分别与MS和荧光检测联用，在单个梯度下来检测PSTs，他们推断这两种方法都可以得到可靠的定量结果，能够很好的分离更多相关的PSTs。这两种检测方法的检测限只有微小的不同，荧光检测仪有更好的敏感性，而MS检测仪在更短的运行时receptor-binding assay，RBA）、免疫学分析技术等。随着科学技术的发展，又出现了一些新的研究方法应用于检测STX及其类似物，例如生物传感器法、色谱-质谱连用法、荧光定量PCR等方法。 由于ELISA方法具有敏感、快速、操作简便的优点，已经广泛用于检测中，尤其是医学和食品检测领域。该技术所面临的挑战是检测像PSTs这样的多种相关化合物的混合物时，需要保持其识别靶物质结构多样性的能力，同时忽略复杂的基质中其它化合物的影响，对此Usleber等概述了建立抗体检测技术的研究进展。研究显示，抗STX的抗体与neoSTX有很弱的交叉反应，而且这种选择性可以应用于该家族的所有类似物。Chu 等研究发现基于抗STX抗体和抗neoSTX抗体的测定之间有很弱的相关关系，结合这两种测定结果，检出率虽然得到了改善，但是依然不高，只有MBA的80-85%，阳性结果较低。Kawatsu等建立了针对gTX2/3的单克隆抗体，以完善先前建立的针对STX和neoSTX的抗体。该抗体保持着与STX/neoSTX家族其它抗体的差别，但是和gTX2/3、dcGTX2/3、C1/2有着很相似的亲和力。Garthwaite等对多重检测方法进行了深入的研究，并建议使用一整套的ELISA，不仅检测贝类样品中的PSTs，也检测遗忘性贝类毒素、腹泻性贝类毒素和神经毒性贝类毒素。荧光定量PCR法Al-Tebrineh J等建立了一种SYBRgreen的特殊定量PCR 方法，来定量检测鱼腥藻属蓝藻细菌产生的STX。该方法主要是通过确定蓝藻细菌中已鉴定的STX基因簇中独特的多聚乙酰序列拷贝数来推断样品产毒性的能力。Al-Tebrineh J等使用这种方法检测了从澳大利亚不同地方的湖泊、水库、河流中采集的水样，通过HPLC和显微细胞计数确定了水华中STX的富集和蓝藻细菌细胞密度。通过实验证实，STX富集确实与STX基因拷贝数相关，这就表示后者可以作为一种测量鱼腥藻属和其它水华蓝藻细菌的产毒潜能的方法。定量PCR 方法的靶向STX基因也可以用于水华鱼腥藻属和其它几种蓝藻细菌产STX的能力的监测和生态生理学研究。

Ⅲ 化学品毒性鉴定技术规范的鉴定程序和方法

化学品毒性鉴定分为4个阶段
（1）第一阶段（急性毒性试验、眼刺激试验和皮肤刺激试验）
主要是急性毒性参数的测定和了解受试样品对皮肤、粘膜的刺激性以及致敏性，为毒性分级和标签管理提供依据。同时，可了解受试样品对机体造成急性损害的可能性和严重程度，并为第二阶段各项试验的剂量设计提供依据。在测定LD50时，一般要求用两种动物，染毒途径应包括所有人体可能的接触途径。
· 急性吸入毒性试验
· 急性经皮毒性试验
· 急性经口毒性试验
· 急性眼刺激性/腐蚀性试验
· 皮肤刺激性/腐蚀性试验
· 皮肤变态反应试验（皮肤致敏试验）
（2）第二阶段（亚急性毒性试验和致突变试验）
主要是了解受试样品的亚急性毒性和遗传毒性，为第三阶段各项试验剂量设计和观察指标的选择提供依据，并对受试样品的致癌性进行预测。
· 鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验（Ames试验）
· 体外哺乳动物细胞染色体畸变试验
· 体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验
· 体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验
· 哺乳动物精原细胞/初级精母细胞染色体畸变试验，或
· 精子畸形试验
· 啮齿类动物显性致死试验
· 免疫毒性评价试验方法
· 亚急性吸入（14/28天）毒性试验
· 亚急性经皮（21/28天）毒性试验
· 亚急性经口（28天）毒性试验
（3）第三阶段（亚慢性毒性试验、致畸试验、繁殖试验）
通过亚慢性试验进一步确定多次重复染毒的毒作用性质和靶器官，初步确定NOAEL或LOAEL，为第四阶段各项试验的剂量设计和观察指标的选择提供依据；通过致畸试验判断受试样品的胚胎毒性及其是否有致畸性。通过繁殖试验，可判断受试样品对生殖过程的损害作用。通过迟发性神经毒性试验，可判断受试样品是否具有迟发性神经毒作用。
· 亚慢性吸入毒性试验
· 亚慢性经皮毒性试验
· 亚慢性经口毒性试验
· 致畸试验
· 两代繁殖毒性试验
· 迟发性神经毒性试验
（4）第四阶段（慢性毒性试验和致癌试验）
通过慢性毒性试验可确定受试样品的NOAEL和LOAEL，为推算受试样品的安全接触限值提供依据。通过致癌试验可以确定受试样品对受试实验动物的致癌性。通过代谢动力学试验可以了解受试样品的吸收、分布、代谢和排泄特点，了解蓄积毒性作用及其可能的靶器官和毒作用机理。
· 慢性吸入毒性试验
· 慢性经皮毒性试验
· 慢性经口毒性试验
· 致癌试验或慢性毒性试验合并致癌试验
· 毒物代谢动力学试验
参考方法
· 皮肤变态反应试验-局部淋巴结法
· 大肠杆菌回复突变试验
· 酵母菌基因突变试验
· 体外哺乳动物细胞正向基因突变试验
· 果蝇伴性隐性致死试验
· 枯草杆菌基因重组试验
· 体外哺乳动物细胞程序外DNA合成（UDS）试验
· 体内哺乳动物外周血细胞微核试验
· 体外哺乳动物姊妹染色单体交换（SCE）试验
· 体内哺乳动物骨髓细胞姊妹染色体交换（SCE）试验
· 繁殖/生长发育毒性筛选试验
· 亚急性毒性合并繁殖/发育毒性筛选试验
· 一代繁殖试验
· 神经毒性筛选组合试验