1. 独立实验室里，诊断试剂的存放方式与使用方法
独立实验室但不得少于60平方米(住宅用房不得用做仓库)，库区环境整洁,无污染源，库房内墙,顶和地面应光洁,平整,门窗结构严密，诊断试剂储存作业区应与经营,办公等其他区域有效隔离
免疫诊断试剂使用注意事项
一.试剂准备
1）试验前将所需试剂盒组分在室温或37℃平衡30 分钟；
2）试剂盒及其组分的保存按试剂盒操作说明书进行；
3）保存试剂盒的冰箱应经常检查储存温度并作好记录；
4）保存试剂盒的冰箱应避免频繁开关。
二.标本准备
1）抽血时，应尽量避免溶血；
2）非抗凝血自然凝固1-2 小时后，3000rpm 离心15 分钟以制备血清标本；
3）用含有抗凝刘的采血管采血后，应立即颠倒混合5-10次并放置一段时间后，3000rpm离心15
分钟以制备血浆标本；
4）标本若在五天内检测，应在2-8℃冰箱中保存，标本若需长期贮存，应于-20℃中密封保存，
长期贮存的标本应为血清或血浆；
5）用于ELISA 一步法检测的标本，不能使用NAN3防腐；
6）标本如需稀释，请用人血清或小牛血清稀释（说明书有指明的除外）。
三.加样
1）加样应严格按照试剂盒说明书中所规定的量和顺序进行；
2）加样时应将标本加在微孔反应板底部；
3）如不慎将样本或试剂溅出孔外时，应用吸水纸轻拭吸干，并做好记录；
4）手工操作时，微孔反应板加样后应及时温育；
5）标本加样过多时应分批操作，以免加样后温育前等待时间过长。
四.温育
1）测量温度应使用校准过的水银温度计；
2）温育容器的温度应衡定为37℃；
3)如果使用恒温箱温育时,除保证恒温箱内温度为37℃外,还应注意尽量少开启恒温箱门；温育时
微孔板不要叠加；
4)微孔板不要置室温温育；
5)严格按试剂盒操作说明书控制温育时间，不能人为延长或缩短温育时间；
6)微孔反应板温育时要加贴封片，这样可以防止孔内液体成分蒸发或水珠等杂质滴入孔内影响检
测结果；封片不能重复使用。
五.洗板
1）配置洗涤液需要新鲜、干净，为无细菌污染的蒸馏水或去离子水，洗涤液应现用现配；
2）盛放洗涤液的塑料容器应经常使用清洗剂彻底清洗，清洗干净后的容器方可使用；
3）洗板时应保证洗涤液注满微孔反应板的每个孔，洗完板后将微孔反应板在吸水板上轻轻拍干；
4）为保证洗板前洗板针的畅通，应经常用细针清除掉洗板针内积存的纤维蛋白等杂质；
5）使用洗板机洗板时，合理安排洗板时间和洗板间隔，避免因反应板过多造成洗板等待时间长；
6）微孔反应板洗板次数要保持一致，不能过多或过少；
7）如果微孔反应板需要拼接于板架上,必须确保板条放平,以免影响洗板机操作而造成洗板不彻
底。
六、显色
1）OPD 显色剂要在使用前配置，不能使用过期显色剂；请勿使用肉眼可见浅蓝色TMB 显色剂；
2）添加显色剂时，注意不能溅出孔外；
3）显色剂应避免接触金属器械。
七.终止
加终止液应避免产生气泡，以免比色时结果不准确。
八.结果判读
1）酶标仪读数时应保证微孔反应板底部清洁；
2）按说明书的规定进行读数和结果判读。
九.全过程
ELISA 试验的整个操作过程中保证微孔反应板不接触次氯酸
2. 怎么样正确的进行ELISA试剂盒的检测
最全的ELISA试剂盒说明书在这里（通用版）
规格：96T 48T
用途：科研实验（仅供实验室研究使用）
保存：2-8℃。
有效期：6个月
结合物的制备
1. 戊二醛交联法
戊二醛是一种双功能团试剂，它可以使酶与蛋白质的氨基通过它而联结。碱性磷酸一般用此法进行标记。交联方法一步法、两步法两种。在一步法中戊二醛直接加入酶与抗体的混合物中，反应后即得酶标记抗体。
ELISA中常用的酶一般都用此法交联。它具有操作简便、有效和重复性好等优点。缺点是交联反应是随机的，酶与抗体交联时分子间的比例不严格，结合物的大小也不均一，酶与酶，抗体与抗体之间也有可能交联，影响效果。在两步法中，先将酶与戊二醛作用，透析除去多余的戊二醛后，再与抗体作用而形成酶标抗体。也可先将抗体与戊二醛作用，再与酶联结。两步法的产物中绝大部分的酶与蛋白质是以1:1的比例结合的，较一步法的酶结合物更有助于本底的改善以提高敏感度，但其偶联的有效率较一步法低。
2. 过碘酸盐氧化法：本法只适用于含糖量较高的酶。辣根过氧化物酶的标记常用此法。反应时，过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基很活泼，可与蛋白质上的氨基形成Schiff氏碱而结合。酶标记物按克分子比例联结，其最佳比例为：酶/抗体=1-2/1。此法简便有效，一般认为是HRP最可取的标记方法，但也有人认为所有试剂较为强烈，各批实验结果不易重演。
按以上方法制备的酶结合物一般都混有未结合物的酶和抗体。理论上，结合物中混有的游离酶一般不影响ELISA中最后的酶活性测定，因经过彻底洗涤，游离酶可被除去，并不影响最终的显色。但游离的抗体则不同，它会与酶标抗体竞争相应的固相抗原，从而减少了结合到固相上的酶标抗体的量。因此制备的酶结合物应予纯化，去除游离的酶和抗体后用于检测，效果更好。纯化的方法很多，分离大分子化合物的方法均可应用。硫酸铵盐析法最为简便，但效果并不理想，因为此法只能去除留在上清中的游离酶，但相当数量的游离抗体仍与酶结合物一起沉淀而不能分开。用离子交换层析或分子筛分离更为可取，高效液相层析法可将制备的结合物清晰地分成三个部分：游离酶、游离抗体和纯结合物而取得最佳的分离效果，但费用较贵。
结合物制得后，在用作ELISA试剂前尚需确定其适当的工作浓度。使用过浓的结合物，既不经济，又可使本底增高；结合物的浓度过低，则又影响检测的敏感性。所以必须对结合物的浓度予以选择。最适的工作浓度就是指结合物稀释至这一浓度时，能维护一个低的本底，并获得测定的最佳灵敏度，达到最合适的测定条件和测定费用的节省。就酶标抗体本身而言，它的有效工作浓度是指与其相应抗原包被的载体作试验时，能得到阳性反应的最高稀释度。例如某一HRP：抗人IgG制剂标明的工作浓度为1:5000，表示该制剂经1:5000稀释后，在与人IgG包被的固相作ELISA试验时，将发生阳性反应。但在用于具体的ELISA检测中，酶标抗体的最适工作浓度受到固相载体的性质、包被抗原或抗体的纯度以及整个检测系统如标本、反应温度和时间等的影响，因此必须在实际测定条件下进行"滴配"选择能达到高敏感度的最大稀释度作为试剂盒中的工作浓度。
结合物的保存
酶标抗体中的酶和抗体均为生物活性物质，保存不当，极易失活。高浓度的结合物较为稳定，冰冻干燥后可在普通冰箱中保存一年左右，但冻干过程中引起活力的减低，而且使用时需经复溶，颇为不便。结合物溶液中加入等体积的甘油可在低温冰箱或普通冰箱的冰格中较长时间保存。早期的ELISA试剂盒中的结合物一般均按以上两种形式供应，配以稀释液（见3.2.5）临用时按标明的稀释度稀释成工作液。现在较先进的ELISA试剂盒均已用合适的缓冲液配成工作液，使用时不需再行稀释，在4-8℃保存期可达6个月。由于蛋白质浓度较低，结合物易失活，需加入蛋白保护剂。另外再加入抗生素（例如庆大霉素）和防腐剂（HRP结合物加硫柳泵，AP结合物可加叠氮钠），以防止细菌生长。
结合物的稀释液
用于稀释高浓度的结合物以配成工作液。为避免结合物在反应中直接吸附在固相载体上，在稀释缓冲液中常加入高浓度的无关蛋白质（例如1%牛血清白蛋白），通过竞争以抑制结合物的吸附。一般还加入具有抑制蛋白质吸附于塑料表面的非离子型表面活性剂，如吐温20，0.05%的浓度较为适宜。在间接测定抗体时，血清标本需稀释后进行测定，也可应用这种稀释液。
试剂盒组成
标本要求
1. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融
2. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤
1. 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。
2. 加样
分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
3. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
4. 配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用
5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
7. 温育：操作同3。
8. 洗涤：操作同5。
9. 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.
10. 终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
11. 测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。
操作程序总结：
计算
以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。
注意事项
1. 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
2. 浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
3. 各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
4. 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。
5. 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6. 底物请避光保存。
7. 严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.
8. 所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
9. 本试剂不同批号组分不得混用。
洗涤液
在板式ELISA中，常用的稀释液为含0.05%吐温20磷酸缓冲盐水。
酶反应终止液
常用的HRP反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的最终体积而异，在板式ELISA中一般采用2mol/L。
阳性对照品和阴性对照品
阳性对照品和阴性对照品是检验试验有效性的控制品，同时也作为判断结果的对照，因此对照品，特别是阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致。以人血清为标本的测定，对照品最好也为人血清，因为正常人血清在各种ELISA模式中可产生不同程度的本底。由于大量正常人血甭较难得到，国外试剂盒中的对照品多以复钙人血浆为原料，即在血浆中加入钙离子，使其中的纤维蛋白质凝固，除去凝块后所得的液体，其组成与血清相似。阴性对照品须先行检测，确定其中不含待测物质。例如HBsAg检测的阴性对照品中不可含HBsAg，最好抗HBs也是阴性。阳性对照品多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质，其中加入一定量的待检物质，此量最好在试剂说明书中标明。加入的量应与试剂的敏感度相称，在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较，可对标本中受检物质的量有一个粗略的估计。国外检测HBsAg的ELISA试剂盒检测敏感度约为0.5ng/ml，阳性对照品中含量约为10ng/ml。在对照品中一般加入抗生素和防腐剂，以利保存。
包被用抗体
包被固相载体的抗体应具有高亲和力和高特异性，可取材于抗血清或含单克隆抗体的腹水或培养液。如免疫用抗原中含有杂质（即便是极微量的），在抗血清中将出现杂抗体，必须除去（可用吸收法）后才能用于ELISA，以保证试验的特异性。抗血清不能直接用于包被，应先提取IgG，通常采用硫酸铵盐析和Sephadex凝胶过滤法。一般经硫酸铵盐析粗提的IgG已可用于包被，高度纯化的IgG性质不稳定。如需用高亲和力的抗体包被以提高试验的敏感性，则可采用亲和层析法以除去抗血清中含量较多的非特异性IgG。腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需要作吸收和亲和层析处理，一般可将腹水作适当稀释后直接包被，必要时也可用纯化的IgG。应用单抗包被时应注意，一种单抗仅针对一种抗原决定簇，在某些情况下，用多种单抗混合包被，可取得更好的效果。
包被的条件
包被用抗原或抗体的浓度，包被的温度和时间，包被液的pH等应根据试验的特点和材料的性质而选定。抗体和蛋白质抗原一般采用pH9.6的碳酸盐缓冲液作为稀释液，也有用pH7.2的磷酸盐缓冲液及pH7~8的Tris-HCL缓冲液作为稀释液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置过夜，37℃中保温2小时被认为具有同等的包被效果。包被的最适当浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为100ng/ml-20ug/ml。
包被的方式
将抗原或抗体固定在过程称为包被。换言之，包被即是抗原或抗体结合到固相载体表面的过程。蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用于。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。载体对不同蛋白质的吸附能力是不相同的，大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。 IgG对聚苯乙烯等固相具有较强的吸附力，其联结多发生在Fc段上，抗体结合点暴露于外，因此抗体的包被一般均采用直接吸附法。蛋白质抗原大多也可采用与抗体相似的方法包被。当抗原决定簇存在于或邻近于疏水区域时，抗原与固相载体的直接吸附可使抗原决定簇不能充分暴露，在这种情况下，直接包被效果不佳，可以采用间接的捕获包被法，即先将针对该抗原的特异抗体作预包被，其后通过抗原抗体反应使抗原固相化。此间接结合在固相上的抗原远离载体表面，其抗原决定簇也得以充分暴露。间接包被的抗原经固相抗体的亲和层析作用，包被在固相上的抗原纯度大大提高，因此含杂质较多的抗原也可采用捕获包被法，试验的特异性、敏感性均由此得以改善，重复性亦佳。间接包被的另一优点是抗原用量少，仅为直接包被的1/10乃至于/100。不易吸附在聚苯乙烯载体上的非蛋白质抗原可采用特殊的包被方式。例如，在检测抗DNA抗体时，需用DNA作为包被抗原，而普遍的固相载体一般不能直接与核酸结合。可将聚苯乙烯板先经紫外线照射，以增加其吸附性能。固相载体先用碱性蛋白质，如聚赖氨酸、鱼精蛋白等作预包被，也可提高核酸的结合力。也可用亲和素生物素系统作间接包被，即用亲和素先包被载体，然后加入生物素化的DNA，这种包被方法均匀、牢固，已扩大应用于各种抗原物质的定量测定。
脂类物质无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂中溶解后加入ELISA板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹干，待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。抗心磷脂抗体的ELISA试剂一般采用这种包被方式。
洗板方法：
1. 手工洗板方法：吸去或甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将推荐的洗涤缓冲液至少0.3ml注入孔内，浸泡1-2分钟，根据需要，重复此过程数次。
2. 自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。待检样本：体液、血清、血浆、细胞培养上清液、尿液、组织匀浆、心房水标本等
3. 酶联免疫吸附测定实验（ELISA）的操作流程，谢谢大家
Elisa 操作流程（以人IL-4 ELISA KIT为例）：
检测原理:
本实验采用双抗体夹心ELISA法。抗人IL-4单抗包被于酶标板上，标本和标准品中的IL-4会 与单抗结合，游离的成分被洗去。加入生物素化的抗人IL-4抗体和辣根过氧化物酶标记的亲 和素。生物素与亲和素特异性结合；抗人IL-4抗体与结合在单抗上的人IL-4结合而形成免疫 复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物，若反应孔中有IL-4，辣根过氧化物酶会使无色 的显色剂现蓝色，加终止液变黄。在450nm处测OD值，IL-4浓度与OD450值之间呈正比，可 通过绘制标准曲线求出标本中IL-4的浓度。
试剂盒组成：
1．抗体预包被酶标板（8×12 或 8×6）
2．冻干标准品（2 / 1 支；0.5ng/支）
3．标准品和标本稀释液（橙盖瓶）（1 瓶；20ml/12ml）
4．浓缩生物素化抗体（紫盖瓶）（1 支）
5．生物素化抗体稀释液（蓝盖瓶）（1 瓶；16ml/10ml）
6．浓缩酶结合物（棕盖瓶）（1 支）
7．酶结合物稀释液（紫盖瓶）（1 瓶；16ml/10ml）
8．浓缩洗涤液 20× （白盖瓶）（1 瓶；50ml/25ml）
9．显色底物（TMB）（棕盖瓶）（1 瓶；12ml/6ml）
10．反应终止液（红盖瓶）（1 瓶；12ml/6ml）
11．封板胶纸（6/3 张）
12．产品说明书（1 份）
标本收集:
1. 收集血液的试管应为一次性的无热原，无内毒素试管。
2. 血浆抗凝剂推荐使用EDTA。避免使用溶血，高血脂标本。
3. 标本应清澈透明，悬浮物应离心去除。
4. 标本收集后若不及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃，-70℃电冰箱内，避免反复冻融，3-6月内检测。
5. 如果您的样本中检测物浓度高于标准品最高值，请根据实际情况，做适当倍数稀释(建 议做预实验，以确定稀释倍数)。
注意事项:
1. 试剂盒使用前请保存在2-8℃。复溶后的标准品应分装后，将其放在-20～-70℃贮存。
2. 浓缩生物素化抗体，浓缩酶结合物体积小，运输中颠簸和可能的倒置，会使液体沾到管壁 或瓶盖。因此使用前请用手甩几下或1000转/分离心1分钟，以使附着管壁或瓶盖的液体沉积到管底。取用前，请用移液器小心吹打4-5次使溶液混匀。
3. 从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶,属于正常现象，微加热至40℃使结晶完全溶解后 再配制洗涤液。（加热温度不要超过50℃）使用时洗涤液应为室温。
4. 若需要分次使用标准品应按照每一次用量分装，将其放在-20～-70℃贮存。避免反复冻 融。
5. 不同批号的试剂盒组份不能混用（洗涤液和反应终止液除外）。
6. 充分轻微混匀对反应结果尤为重要，最好使用微量振荡器(使用最低频率)，如无微量振荡器，可在反应前手工轻轻敲击酶标板框混匀。
7. 在试验中标准品和样本检测时建议作双孔检测。
8. 试验中所用的试管和吸头均为一次性使用，严禁在不同的液体之间混用！否则将影响试 验结果。
9. 试验中请穿着试验服并带乳胶手套做好防护工作。特别是检测血液或者其他体液标本时， 请按国家生物试验室安全防护条列执行。
检测前准备工作:
1. 请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，以平衡至室温。
2. 将浓缩洗涤液用双蒸水稀释(1:20)。未用完的放回4℃。
3. 标准品: 加入标准品/标本稀释液0.5ml至冻干标准品中，静置15分钟，待其充分溶解后，轻轻混匀(浓度为1000 pg/ml)。然后根据需要进行稀释。(建议标准曲线使用以下浓度： 1000、500、250、125、62.5、31.25、15.6、0 pg/ml)。复溶标准品原液（1000 pg/ml）若未用完请分装后放入-20℃以下电冰箱内保存，保存两个月。已稀释的标准品请废弃。
4. 生物素化抗体工作液：按当次试验所需要得用量，使用前20分钟，以生物素化抗体稀释液稀释浓缩生物素化抗体(1:30)成工作浓度。当日使用。若实验次数过多导致生物素化 抗体量不足，可向我们公司单独购买生物素化抗体。（须提供抗体批号）
5. 酶结合物工作液：按当次试验所需要得用量，使用前20分钟，以酶结合物稀释液稀释浓 缩酶结合物(1:30) 成工作浓度。当日使用。若实验次数过多导致浓缩酶结合物量不足， 可向我们公司单独购买浓缩酶结合物。（须提供酶结合物批号）
洗涤方法:
1. 自动洗板机：要求注入的洗涤液为350ul，注入与吸出间隔15－30秒。洗板5次。
2. 手工洗板：甩尽孔内液体，在洁净的吸水纸上拍干，每孔加洗涤液350ul，静置30秒后甩尽液体，在厚迭吸水纸上拍干。洗板5次。
操作步骤:
1．从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条，未用的板条和干燥剂请放回铝箔袋内压 实自封条，密封口袋，放回4℃。
2．空白孔加标准品和标本稀释液，其余相应孔中加标本或不同浓度标准品(100ul/孔)，用封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱孵育90分钟。
3．提前20分钟准备生物素化抗体工作液。
4．洗板5次。
5．空白孔加生物素化抗体稀释液，其余孔加入生物素化抗体工作液(100ul/孔)。用新封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱孵育60分钟。
6．提前20分钟准备酶结合物工作液。避光室温(22-25 ) ℃ 放置。
7．洗板5次。
8．空白孔加酶结合物稀释液，其余孔加入酶结合物工作液(100ul/孔)。用新封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱，避光孵育30分钟。
9．打开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序。
10．洗板5次。
11．加入显色底物(TMB)100ul/孔，避光36℃孵箱，避光孵育15分钟。
12．加入终止液100ul/孔, 混匀后即刻测量OD450值(3分钟内)。在仪器保存读数结果并打印一份纸质结果。
13．实验完毕后将未用完的试剂按规定的保存温度放回电冰箱保存至有效期结束。
建议保存酶标板框，以备下次或者今后试验使用。
结果判断:
1. 每个标准品和标本的OD值应减去空白孔的OD值。
2. 手工绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。
3. 若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。
灵敏度、特异性和重复性:
● 灵敏度：最小可测人IL-4达7pg/ml。
● 特异性：不与IL－1,2,3,5,6,8,10,12,IFN,TNF及sTNF-RII等反应。
● 重复性：板内，板间变异系数均<10%。