目前常用制备弱毒疫苗方法

❶ 强毒株和弱毒株的制备方法

灭活疫苗，即人们在获得病毒以后，对其进行一定的处理，可以使病毒完全丧失活性，从而得到被杀死的病原微生物，进而制成灭活疫苗。通俗的说灭活疫苗就是一种被杀死的病毒，将其输入人体，既不会使人染病，又可以促使人体产生抗体，抵御病毒入侵。
减毒活疫苗是指保留一定的剩余毒力和免疫性制成疫苗，接种人体后，使机体产生一定的感染而获得免疫力。
弱毒(活)疫苗 分为自然毒株和人工致弱毒株两类。�(1)自然毒株： 在同一种病毒 的不同毒株之间, 存在着毒力和免疫原性等诸多方面的 差异。因此，寻找和筛选自然界中 毒力低而有较好免疫原性的病毒作为弱毒疫苗株，不仅在理论上是成立的，而且在实践中 也已证明这是一个有效的途径。目前广泛应用的预防鸡新城疫的新城疫病毒Ⅱ系弱毒疫苗 株和V�4株，都是自然弱毒株。预防犬瘟热和犬细小病毒性肠炎的某些弱毒 疫苗分别也是由 分离到的自然弱毒株制备的。 应用具有交叉抗原的同属异种病毒强毒株也可 以进行疫病的免疫预防, 这种强毒株对于被接种动物来说不具有致病性, 但由于具有交叉保 护性抗原, 因此具有良好的免疫性。众所周知，Jenner应用牛痘病毒预防人的天花，是早期 预防医学的杰出成就之一。 应用鸽痘病毒预防鸡痘，应用火鸡疱疹病毒预防鸡的马立克氏病以及应用牛的轮状病毒口服 免疫小猪预防猪轮状病毒感染等，都是这方面的成功例证。�(2)人工致弱株：人工培养弱 毒株的方法, 主要有以下数种。①连续通 过异种动物或异种动物细胞：这是培育弱毒(活)疫苗株的传统方法，原来不能在异种动物体 内或异种动物细胞上增殖的病毒，在长期多代的适应之后，逐渐具备了在新宿主体(或细胞) 内增殖的性能。这是一种纯粹的适应性变异呢?还是新宿主对变异病毒粒子的“选择性接受 ”?目前尚难作出定论。也可能这两种因素都起作用。为了较快育出能够适应新宿主的毒株 ，一个重要的原则就是必须采用大剂量的接种方法，也就是在每次传代接种时，都用尽可能 大量的病毒接种物。这与保持毒株稳定性状的传代方法恰恰相反，为了减少毒株的变异，传 代接种时应该采用最高稀释倍数也就是最小量的病毒接种物。�一旦获得已经适应新宿主 的 变异毒株，并且证明它具有一定的稳定性能，即可进行对原宿主的毒力和免疫力鉴定。�目 前广泛应用的猪瘟兔化弱毒(活)疫苗就是使猪瘟病毒连续通过家兔几百代而培育成的。将口 蹄疫病毒连续通过乳兔或乳鼠，也已获得弱毒疫苗株。牛瘟病毒在通过家兔、鸡胚等后，毒 力减弱而成为弱毒疫苗株。狂犬病病毒通过家兔育成的所谓“固定毒”，更是一个突出的例 子。�通过异种动物细胞也能达到致弱病毒毒力的作用，并且已经被实践所证明。例如使乙 型脑炎病毒通过牛肾细胞、猴肾细胞或仓鼠肾细胞，均已分别获得了弱毒疫苗株。牛瘟病毒 通 过Vero细胞，犬瘟热病毒通过鸡胚细胞(先在鸡胚内适应几代)，犬传染性肝炎病毒通过猪肾 细胞等，也都分别获得了弱毒疫苗株。�②在同种细胞上驯化： 某些病毒， 例如马传染性 贫 血病毒， 感染范围极窄， 除自然宿主动物及其细胞以外， 概不感染其它动物及细胞。 但 在敏 感细胞， 例如在马属动物体外培养的白细胞或其它细胞培养物上长期反复传代后， 也获得 了 弱毒疫苗株。 就是那些感染范围较宽的病毒， 例如脊髓灰质炎病毒和犬瘟热病毒， 分别 长 期通过猴肾细胞和犬肾细胞等敏感细胞培养传代后，毒力也减弱，并经蚀斑分离法等纯化手 段育成了 弱毒疫苗株。�由于同种细胞不象异种动物细胞那样具有“适应性选择”作用，因此应该尽 早采用病毒纯化技术，以便尽快选出变异株。同时注意掌握培养温度、营养液的成分和pH、 收毒时间以及接毒量等有关因素。�同种细胞驯化的另一个方法是应用现成的感染细胞 进行继代培养。例如伊泽等(1967年)以猪瘟强毒人工感染幼猪，随后采取其带毒的肾细 胞培养传代，由之获得了弱毒株。� ③条件致死性温敏 突变株：主要是呼吸道病毒，在32～34℃上部呼吸道时能够有效地复制，在37℃下部呼吸道 时生长受到限制。筛选突变株时，首先利用致突变原对野生病毒诱导，使其发生无意突变， 然 后通过它们的温敏表型进行鉴定。如流感病毒的温敏突变株的选育就是通过该途径获得的。 温敏突变株的缺点是不太稳定，容易回复其毒力。相反, 采用相似的手段培育筛选的冷适 应突变株则具有相对稳定的特性。

❷ 口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一种偶蹄动物传染病，目前常用接种弱毒疫苗的方法预防．疫苗的主要成分是该病

（1）由于该病毒的遗传物质是RNA，故要获得目的基因可以采用逆转录的方法，获得的基因文库称为cDNA文库；
（2）要想获得大量的目的基因，可以采用PCR技术，需要的酶是耐高温的DNA聚合酶（即TaqDNA聚合酶）；
（3）从图中可以看出标记基因为卡那霉素抗性基因，故培养基中要添加卡那霉素从而筛选出含重组DNA的受体细胞，进行植物组织培养时的培养基和器械都要进行灭菌处理．过程⑤为脱分化，不需要光；
（4）基因工程得到的受体细胞中，外源基因一般位于一对同源染色体中的一条上，故形成的配子中不一定含有目的基因．
故答案为：（1）逆转录部分基因（cDNA）
（2）PCR热稳定DNA聚合酶（Taq酶）
（3）卡那霉素灭菌避光
（4）C

❸ 口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一种偶蹄动物传染病，目前常用接种弱毒疫苗的方法预防，疫苗的主要成分是该病

（1）以RNA为模板合成DNA的过程，叫做逆转录．用限制性核酸内切酶（限制酶）将目的基因VP1基因片段切下．
（2）重组质粒的构建是利用农杆菌的Ti质粒，VP1基因可插入到Ti质粒的T-DNA中，利用其特性整合到受体细胞染色体的DNA上．
（3）⑥-⑦为植物组织培养过程，⑥的培养基中要加入各种必需营养物质和生长素和细胞分裂素等激素．抗性基因的作用是筛选出含有目的基因的受体细胞，因此在培养基中还需要添加卡那霉素筛选出含有重组质粒的叶片小段．
（4）验证转基因番茄叶片提取液的免疫效力，需设置对照组进行对比，注射未转基因的番茄叶片提取液的豚鼠作为空白对照组，注射弱毒疫苗的豚鼠作为实验对照组．免疫效力的测定以特异性抗体的数量为参照．
故答案为：
（1）逆转录 限制性核酸内切酶（限制酶）
（2）T-DNA 染色体
（3）生长素和细胞分裂素 卡那霉素
（4）特异性抗体 未转基因的番茄叶片提取液 弱毒疫苗

❹ 弱毒株系的概念

弱毒(活)疫苗 分为自然毒株和人工致弱毒株两类。(1)自然毒株： 在同一种病毒 的不同毒株之间, 存在着毒力和免疫原性等诸多方面的 差异。因此，寻找和筛选自然界中 毒力低而有较好免疫原性的病毒作为弱毒疫苗株，不仅在理论上是成立的，而且在实践中 也已证明这是一个有效的途径。目前广泛应用的预防鸡新城疫的新城疫病毒Ⅱ系弱毒疫苗 株和V4株，都是自然弱毒株。预防犬瘟热和犬细小病毒性肠炎的某些弱毒 疫苗分别也是由 分离到的自然弱毒株制备的。 应用具有交叉抗原的同属异种病毒强毒株也可 以进行疫病的免疫预防, 这种强毒株对于被接种动物来说不具有致病性, 但由于具有交叉保 护性抗原, 因此具有良好的免疫性。众所周知，Jenner应用牛痘病毒预防人的天花，是早期 预防医学的杰出成就之一。 应用鸽痘病毒预防鸡痘，应用火鸡疱疹病毒预防鸡的马立克氏病以及应用牛的轮状病毒口服 免疫小猪预防猪轮状病毒感染等，都是这方面的成功例证。(2)人工致弱株：人工培养弱 毒株的方法, 主要有以下数种。①连续通 过异种动物或异种动物细胞：这是培育弱毒(活)疫苗株的传统方法，原来不能在异种动物体 内或异种动物细胞上增殖的病毒，在长期多代的适应之后，逐渐具备了在新宿主体(或细胞) 内增殖的性能

❺ 口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一种偶蹄动物传染病，目前常用接种弱毒疫苗的方法预防．疫苗的主要成分是该病

（1）VPI蛋白在免疫反应中能引起机体产生特异性免疫应答，故称之为抗原．
（2）因为口蹄疫病毒的遗传物质为RNA，因此要获得VP1基因可用逆转录的方法合成DNA；限制酶能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，将VP1基因片段切下．
（3）植物组织培养中植物激素使用：物组织培养中关键性激素是生长素和细胞分裂素；同时使用生长素和细胞分裂素时，两者用量的比例影响植物细胞的发育方向；运载体中含有的标记基因是抗卡那霉素，所以加入卡那霉素可以筛选出重组质粒和普通质粒．
（4）注入疫苗后检测特异性抗体的水平，为了使相应的结论可信，应增设两个对照组用未转基因的番茄叶片提取液和弱毒疫苗．
故答案为：
（1）抗原
（2）逆转录限制性内切酶
（3）生长素和细胞分裂素卡那霉素
（4）特异性抗体未转基因的番茄叶片提取液弱毒疫苗

❻ 口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一种偶蹄目动物传染病，目前常用接种弱毒疫苗的方法预防．此疫苗的主要成分是

（1）VPI蛋白在免疫反应中称之为抗原，不同生物共用一套密码子，所以口蹄疫基因在植物体细胞中也能表达出相同产物．
（2）运载体中含有的标记基因是抗卡那霉素，所以加入卡那霉素可以筛选出重组质粒和普通质粒．
（3）pZHZ1（3.7kb，lkb=1000对碱基）上相应的E-F区域（0.2kb）剩余3.7-0.2=3.5Kb，经G、H切割后基因长度是1.6+3.1=1.2+3.5=4.7Kb，则VPI的长度是4.7-3.5-1.2Kb；酶G和酶H都能将重组质粒切割出两段的原因是在VPI基因中含有酶G和酶H的酶切位点各一个，同时在质粒上含有酶G和酶H的酶切位点各一个．
（4）注入疫苗后检测特异性抗体的水平，为了使相应的结论可信，应增设两个对照组用未转基因的番茄叶片提取液和弱毒疫苗．
故答案为：（1）抗原（疫苗）不同生物共用一套密码子
（2）重组质粒或普通质粒
（3）1.2在VPI基因中含有酶G和酶H的酶切位点各一个
（4）特异性抗体未转基因的番茄叶片提取液弱毒疫苗

❼ 疫苗的免疫接种方法有哪几种

免疫必须做到注射部位准确，消毒严格，药量准确，不能随意改变免疫剂量，个个免疫，不漏针。采用注射途径接种的疫苗，在瓶塞上固定一个消毒的针头专供吸取药液，吸液后不拔出，用酒精棉包裹，以便再次吸取。常用的免疫接种方法主要有以下几种：

（1）皮下注射

皮下注射是目前使用最多的一种方法，大多数疫苗都是经这一途径免疫。注射部位在猪的耳根或股内侧。皮下组织吸收比较缓慢而均匀，如猪丹毒弱毒菌苗、猪丹毒氢氧化铝甲醛菌苗、猪肺疫氢氧化铝甲醛菌苗都可皮下注射。油类疫苗不宜皮下注射。

方法：注射部位先剪毛（无毛或少毛区也可不剪），用碘酊或酒精棉球消毒，用左手食指和中指捏起皮肤，食指压住顶点，形成三角凹窝，右手持注射器，迅速将针头刺入凹窝中心皮肤内2厘米深，放开皮肤，慢慢注入药液，药量大时应分点注射，注射完毕，拔出针头后用棉球按住注射部位以消毒。

（2）肌肉注射

肌肉注射是将疫苗注射于肌肉内，注射部位在颈部两侧中1/3处，或臀部、股部肌肉较丰满部位。剪毛，酒精或碘酊消毒，把针头直刺入肌肉，注入药物。如猪瘟、猪丹毒、猪肺疫三联冻干弱毒苗。肌肉注射时如果药量偏大可分点注射，但注射时不可打“飞针”。注射时注意针头要足够长，以保证疫苗确实注入肌肉里。

（3）滴鼻接种

滴鼻接种是属于黏膜免疫的一种，黏膜是病原体侵入的最大门户，有95%的感染发生在黏膜或由黏膜侵入机体，黏膜免疫接种可刺激产生局部免疫，能对有害抗原或病原体产生高效体液免疫反应和细胞免疫反应。目前使用比较广泛的是猪伪狂犬病基因缺失疫苗的滴鼻接种。

（4）皮肤刺种

猪痘弱毒疫苗常用此法接种，选定无血管处，用刺种针或钢笔尖蘸取疫苗刺入。

（5）口服

即是将疫苗混于饲料或饮水里，或抹于母猪的乳头上经口服下，而达到接种目的。必须注意，用于拌疫苗的饲料要新鲜，不宜用酸败或发酵饲料拌。大小动物要分开喂，使其能均匀吃到含疫苗饲料。如猪肺疫弱毒菌苗用此方法免疫接种，饮水免疫先停水4小时左右，再饮水免疫接种，稀释疫苗的水要纯净，尤其不能用含有消毒药物的水稀释疫苗。

（6）气管内注射和肺内注射

这两种方法多用在猪气喘病的预防接种。但目前气喘病疫苗已经生产出可用于肌肉注射的疫苗了。

（7）穴位注射

在注射疫苗时多采用后海穴注射，能诱导较好免疫反应。目前，在养猪生产中应用这种方法免疫的疫苗有传染性胃肠炎疫苗、猪瘟疫苗和口蹄疫疫苗。其中猪瘟兔化弱毒疫苗，后海穴比常规肌肉免疫注射更具有坚强的保护力。采用穴位注射要有确切的注射位点，进针有方向，下针有深度，剂量准确。

（8）超前免疫

超前免疫是指在仔猪未吃初乳时注射疫苗，注苗后1～2小时才给吃初乳，目的是避开母源抗体的干扰和使疫苗毒尽早占领病毒复制的靶位，尽可能早刺激产生基础免疫，这种方法常用在猪瘟的免疫。

❽ 免疫接种方法有哪些在应用中如何确定

免疫接种方法根据其接种途径可分为：滴鼻、滴眼、气雾、饮水、刺种、皮下或肌肉注射等。采用哪种免疫接种方法，既要考虑疫（菌）苗的特性和免疫效果，又要考虑操作方便和经济效益。

（1）滴眼滴鼻免疫。这种接种方法劳动强度大，时间长，对操作人员的责任心要求强。虽然禽群应激反应较大，但免疫效果确实，尤其适合预防呼吸道疾病的活疫苗。适用于鸡新城疫Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ系疫苗，鸡传染性支气管炎疫苗和鸡传染性喉气管炎弱毒疫苗的接种。滴眼滴鼻的工具可用滴管或滴眼瓶。事先用1毫升水试一下，看能滴多少滴，按每羽1～2滴，根据疫苗包装用生理盐水稀释，不宜用冷开水，以免其中的杂质杀死部分病毒，影响效果。此方法多用于雏鸡，将稀释好的疫苗点眼或滴入鼻孔内，滴眼的效果稍好于滴鼻。两滴疫苗最好分别滴进眼和鼻孔内。其操作的关键是接种后稍等片刻，待疫苗液确已吸入眼或鼻内再放开鸡只。

（2）饮水免疫。它能减轻劳动强度和鸡群应激，适合建立消化道及呼吸道的局部免疫。但其影响因素较多，尤其对环境温度、疫苗剂量、水质、饮水量、饮水器卫生等注意不够时免疫效果将受到较大影响。可靠性差，主要是免疫水平不整齐。由于本方法要求使用活疫苗，所以在我国目前的条件下，不适宜过多地采用饮水免疫。饮水免疫是将疫苗溶于饮水中，让鸡群在1～2小时以内饮完。可用于新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊病、禽脑脊髓炎等弱毒疫苗都可以采取饮水免疫。为了使饮水免疫达到一定的效果，必须注意如下几点：①采用饮水免疫的疫苗必须是高效价的，用量加倍或再稍多一点。②为了使含有疫苗的饮水能在1～2小时以内饮完，先要停水2～5小时，依气温而定，温度高停水时间短，反之则长。每只鸡的饮水量大约是：5～7日龄4～5毫升，10～14日龄8毫升，20日龄12毫升，28日龄17毫升，40～50日龄28毫升，开产前70毫升。饮疫苗后也要停止饮水1小时。③为了减少疫苗损失，最好能在稀释疫苗的水中加入0.3%的脱脂奶粉或鲜牛奶。鲜牛奶应煮沸，静置冷却，滤除表层奶脂，再加入饮水中。④饮水免疫时，饮水器要充足，以保证所有的鸡能在短时间内饮到足够的免疫量。饮水器要清洁卫生，不要用金属饮水器。⑤采用饮水免疫时，二次免疫间隔时间不宜过长。

（3）气雾免疫。可以节省劳动力。若操作得当则效果甚好。很适合对呼吸道有亲嗜性的弱毒疫苗。如新城疫Ⅳ系苗、鸡传染性支气管炎疫苗。但本方法容易激发呼吸道感染，引起慢性呼吸道病的暴发。所以免疫前必须对气雾机的性能进行测试，严格控制雾滴大小。一般雏鸡用雾滴的直径为30～50微米，成年鸡为5～10微米。喷雾前后几天应在饲料或饮水中添加适量抗菌药。

（4）注射与刺种。这两种方法均能使抗原完整迅速地到达淋巴结等免疫器官，所以适用于大多数疫苗的免疫，如果能保证剂量准确，则效果很好。其不足之处是费工费时，对鸡群应激较大，操作时禁止使用未消毒的器具，尤其吸取疫苗的针头与注射针头要绝对分开。疫苗应随用随稀释。有些场在接种上千甚至几万只鸡前，一次将几十瓶或上百瓶疫苗稀释完，置于常温下不断使用，这样越后用的疫苗效价越低，尤其是在稀释液质量不好或环境温度偏高的情况下，效果更差。另外，要经常核对注射器的实际注射量，以及刺种器内是否蘸满疫苗也非常重要。

刺种适用于鸡新城疫Ⅰ系疫苗、鸡痘疫苗的接种。可用刺种针、蘸水笔或用大号缝衣针将针鼻磨去一半，蘸取稀释好的疫苗，刺种在鸡翅无血管处的皮下。每1000羽的疫苗可用25毫升生理盐水稀释，充分摇匀后进行刺种。

注射时用注射器将疫（菌）苗注射到肌肉或皮下。肌肉注射的部位可在肌肉丰满处，如胸部肌肉或腿部肌肉。对小鸡采用肌肉注射时，要特别注意，以免刺入太深，刺到肝脏或心脏，造成死亡。皮下注射的部位选择鸡的颈中部皮下，由上向下注射。它适用于各种油乳剂灭活苗的免疫。

❾ 弱毒疫苗的制作工艺

该苗制作的关键是弱毒株的获得。 目前常用的致弱方法有：①从自然界中筛选弱毒株；②通过异种动物或细胞传代致弱；③采用物理和化学方法致弱；④利用基因工程技术对病原进行重组。 1．病原可在免疫动物体内繁殖，用量小。
2．免疫原性好，免疫期长，成本低，使用方便。 1．目前弱毒疫苗的安全性较好，生产技术比较成熟。
2．但是某些弱毒株的毒力易返强，对一些极易感动物存在一定的危险性。
3．其免疫效果易受多种因素的影响，且运输和保存有一定的条件限制

❿ 口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一种偶蹄动物传染病，目前常用接种弱毒疫苗的方法预防．疫苗的主要成分是该病

（1）口蹄疫病毒的遗传物质为RNA，可以以RNA为模板逆转录获得VPI基因．
（2）用限制酶A、B切割出的末端完全不同，这样可以防止目的基因、运载体自身环化，也能防止目的基因和运载体反向连接，即可以保证目的基因和质粒的定向连接．
（3）已知质粒pZHZ1的长度为3.7kb，其中EF区域长度为0.2kb，所以切去EF段后的质粒长度为3.7-0.2=3.5kb．现用限制酶G切割重组质粒pZHZ2样品，结果被酶G切割成1.6kb和3.1kb两个片段，可知重组质粒pZHZ2的总长度为1.6+3.1=4.7kb，所以VPI基因长度为4.7-3.5=1.2kb．重组质粒中G的切割位点距E的切割位点0.8kb，单独用限制酶G切割后产生1.6kb和3.1kb两个片段，说明在重组质粒中除了图中标示出来的G酶识别位点外，还有一个G酶识别位点；H酶的酶切位点距F0.5kb，用H单独酶切后产生1.2kb和3.5kb两个片段，说明在重组质粒中含有一个H的酶切位点，根据题中信息提示“目的基因内部的酶G、酶H切割位点标注在图上”，可确定在EF之间分别含有G和H的一个识别位点．可断定G的识别位点，在距离E点右侧0.8kb处，H的识别位点在距F左侧0.7kb处，如下图所示：

（4）生长素和细胞分裂素卡那霉素
（5）口蹄疫病毒抗体