果胶酶常用固定化方法

‘壹’ 果胶的提取方法有哪些各有何优缺点果胶作为食品添加剂,有哪些功效

从植物体中提取果胶的过程，是将果胶与其紧密相连的纤维素、半纤维素等物质分离，将果胶转移到溶液中，然后经过沉淀将果胶析出。目前，果胶提取方法主要有：酸提取法、微波提取法、离子交换法和酶提取法。

3.1.1 酸提取法

酸提取法是传统的工业果胶生产方法，是目前果胶提取工艺中应用较多的一种方法。其原理是利用果胶在稀酸溶液中水解的性质，将果皮中的原果胶质水解为水溶性果胶，使果胶从果皮中转到水相中，形成果胶水溶液，再用醇将果胶析出。

3.1.2 微波提取法

微波是一种频率为300 MHz~300 GHz的电磁波，其对应的波长为l mm~lm,比可见光的波长长，属高频波段的电磁波。它具有电磁波的反射、透射、干涉、衍射、偏振以及伴随着电磁波的能量传输等波动特性，还具有高频特性、热特性及非热特性。由于果胶胶质与细胞壁内的其它成分紧密连接从而抑制释放浸提，用微波法提取果胶时，微波辐射与细胞壁中的物质相互作用，不仅可以实现快速加热，还会破坏细胞壁将不同化学组成的成分分开来，使其进入溶液当中，微波辐射还能抑制皮内果胶酶作用避免果胶被酶解。

3.1.3 离子交换法

离子交换法是利用溶液中各种带电粒子与离子交换剂之间结合力的差异进行物质分离的操作方法。由于果皮中含有钙、镁等离子及其它杂质，会影响果胶的纯度和质量，利用离子交换树脂可去除杂质提高果胶的质量。

3.1.4 酶提取法

酶法提取果胶是继酸提取法、微波提取法之后出现的一种果胶提取新方法。酶法提取果胶用酶根据果皮成分的构成进行选择，采用最多的有纤维素酶、半纤维素酶和糖苷酶，使用这些酶将与果胶紧密相连的其它组分酶解，从而将果胶单独分离出来。

3.1.5 果胶沉淀方法

果胶的沉淀法分为乙醇沉淀法和盐析沉淀法。这两种方法都是利用果胶在醇和盐溶液中生成沉淀的原理。盐析法通常采用明矾作为沉淀剂，由于明矾溶液中的 Al3+带有与果胶中的游离羧基相异的电荷，从而将果胶溶液酸胺化后与果胶羧基反应生成果胶酸盐[92].乙醇沉淀法是最常用的果胶析出方法，在果胶提取液中加入无水乙醇充分搅拌可生成沉淀。

盐沉淀法生产成本较低，但产品的灰分含量较高且色泽较深，品质较次。而乙醇沉淀法所生产的果胶灰分含量少、凝胶度高且色泽浅，品质好，虽然乙醇使用量较大，但是如果对废乙醇进行回收利用和循环使用，则可以降低生产成本。

本章通过设计四因素三水平正交试验，确定从柚子皮提取果胶的最佳工艺条件，并测定了从柚子皮中所提取的果胶的酯化度。

‘贰’ 酶、细胞、原生质体固定化

酶的一些不足之处：
（1）酶的稳定性较差
（2）酶的一次性使用
（3）产物的分离纯化较困难
◆改善方法之一就是固定化技术的应用:
(1)固定化酶是指固定在一定载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶.固定化酶既保持了酶的催化特性,又克服了游离酶的不足之处,具有增加稳定性,可反复或连续使用以及易于和反应产物分开等显着优点.
(2)固定化细胞是指固定在载体上并在一定的空间范围内进行生命活动的细胞.也称为固定化活细胞或固定化增值细胞.通常只能用于胞外酶等胞外产物的生产.
(3) 固定化原生质体技术,有利于胞内物质的分泌.
1. 酶固定化
◆采用各种方法,将酶与水不溶性的载体结合,制备固定化酶的过程称为酶的固定化.固定在载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶称为固定化酶.
◆固定在载体上的菌体或菌体碎片称为固定化菌体,它是固定化酶的一种形式.
1.1酶的固定化方法
固定化的方法：吸附法、包埋法、结合法、交联法和热处理法等.
(1)吸附法：
◆利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上,而使酶固定化的方法称为物理吸附法,简称吸附法.
◆物理吸附法常用的固体吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石等.
◆靠物理吸附作用,结合力较弱,酶与载体结合不牢固而容易脱落,所以使用受到一定的限制.
(2)包埋法
◆将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中,使酶固定化的方法称为包埋法.
◆包埋法使用的多孔载体主要有：琼脂、琼脂糖、海藻酸钠、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺、光交联树脂、聚酰胺、火棉胶等.
◆包埋法制备固定化酶或固定化菌体时,根据载体材料和方法的不同,可分为凝胶包埋法和半透膜包埋法两大类.
◇凝胶包埋法：凝胶包埋法是将酶或含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中,制成一定形状的固定化酶或固定化含酶菌体.大多数为球状或片状,也可按需要制成其他形状.
常用的凝胶有琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂等合成凝胶.
◇半透膜包埋法：半透膜包埋法是将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的小球内,制成固定化酶.
常用于制备固定化酶的半透膜有聚酰胺膜、火棉胶膜等.
(3)结合法
◆选择适宜的载体,使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法称为结合法.
◆根据酶与载体结合的化学键不同,结合法可分为离子键结合法和共价键结合法.
◇离子键结合法：通过离子键使酶与载体结合的固定化方法称为离子键结合法.
离子键结合法所使用的载体是某些不溶于水的离子交换剂.常用的有DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等.
◇共价键结合法：通过共价键将酶与载体结合的固定化方法称为共价键结合法.
共价键结合法所采用的载体主要有：纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳质、氨基酸共聚物、甲基丙稀醇共聚物等.
酶分子中可以形成共价键的基团主要有：氨基、羧基、巯基、羟基、酚基和咪唑基等.
◇要使载体与酶形成共价键,必须首先使载体活化,即借助于某种方法,在载体上引进一活泼基团.然后此活泼基团再与酶分子上的某一基团反应,形成共价键.
◇使载体活化的方法很多.主要的有重氮法、迭氮法、溴化氰法和烷化法等.
(4)交联法
◆借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用,制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法.交联法也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化.
◆常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等.其中应用最广泛的是戊二醛.
(5)热处理法
◆将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间,使酶固定在菌体内,而制备得到固定化菌体.◆热处理法只适用于那些热稳定性较好的酶的固定化,在加热处理时,要严格控制好加热温度和时间,以免引起酶的变性失活.
1.2固定化酶的特性
(1)稳定性:固定化酶的稳定性一般比游离酶的稳定性好.
(2)最适温度: 固定化酶的最适作用温度一般与游离酶差不多,活化能也变化不大.
(3)最适pH值: 酶经过固定化后,其作用的最适pH值往往会发生一些变化.
◆影响固定化酶最适pH值的因素主要有两个,一个是载体的带电性质,另一个是酶催化反应产物的性质.
(4)底物特异性: 固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不同,其变化与底物分子量的大小有一定关系.对于那些作用于低分子底物的酶,固定化前后的底物特异性没有明显变化.
◆固定化酶底物特异性的改变,是由于载体的空间位阻作用引起的.
1.3固定化酶的应用
固定化酶既保持了酶的催化特性,又克服了游离酶的不足之处,具有如下显着的优点：
（1）酶的稳定性增加,减少温度、pH值、有机溶剂和其他外界因素对酶的活力的影响,可以较长期地保持较高的酶活力.
（2）固定化酶可反复使用或连续使用较长时间,提高酶的利用价值,降低生产成本.
（3）固定化酶易于和反应产物分开,有利于产物的分离纯化,从而提高产品质量.
固定化酶已广泛地应用于食品、轻工、医药、化工、分析、环保、能源和科学研究等领域.

2.细胞固定化
◆通过各种方法将细胞与水不溶性的载体结合,制备固定化细胞的过程称为细胞固定化.(固定化活细胞或固定化增殖细胞)
◆微生物细胞、植物细胞和动物细胞都可以制成固定化细胞.
2.1细胞固定化的方法
◆主要可分为吸附法和包埋法两大类方法.
(1)吸附法
◆利用各种固体吸附剂,将细胞吸附在其表面而使细胞固定化的方法称为吸附法.
◆用于细胞固定化的吸附剂主要有：硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑料、金属丝网、微载体和中空纤维等.
(2) 包埋法
◆将细胞包埋在多孔载体内部而制成固定化细胞的方法称为包埋法.
◆包埋法可分为凝胶包埋法和半透膜包埋法.
◇以各种多孔凝胶为载体,将细胞包埋在凝胶的微孔内而使细胞固定化的方法称为凝胶包埋法.
○凝胶包埋法是应用最广泛的细胞固定化方法,适用于各种微生物、动物和植物细胞的固定化.
○凝胶包埋法所使用的载体主要有琼脂、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺凝胶和光交联树脂等.
2.2微生物细胞固定化
2.2.1固定化微生物细胞的特点：
①固定化微生物细胞保持了细胞的完整结构和天然状态,稳定性好.
②固定化微生物细胞保持了细胞内原有的酶系、辅酶体系和代谢调控体系,可以按照原来的代谢途径进行新陈代谢,并进行有效的代谢调节控制.
③发酵稳定性好,可以反复使用或者连续使用较长的一段时间.
④固定化微生物细胞密度提高,可以提高产率.
⑤提高工程菌的质粒稳定性,
2.2.2固定化微生物细胞的应用
◆主要用在两个方面：
◇是利用固定化微生物细胞发酵生产各种胞外产物.
◇二是利用固定化微生物细胞与各种电极结合制成微生物电极.
(1)利用固定化微生物生产各种产物
(2)固定化微生物细胞制造微生物传感器
2.3植物细胞固定化
2.3.1固定化植物细胞的特点：
（1）植物细胞经固定化后,由于有载体的保护作用,可减轻剪切力和其他外界因素对植物细胞的影响,提高植物细胞的存活率和稳定性.
（2）细胞经固定化后,被束缚在一定的空间范围内进行生命活动,不容易聚集成团.
（3）固定化植物细胞发酵可以简便地在不同地培养阶段更换不同的培养液,即首先在生长培养基中生长增殖,在达到一定的细胞密度后,改换成发酵培养基,以利于生产各种所需的次级代谢物.
（4）固定化植物细胞可反复使用或连续使用较长的一段时间,大大缩短生产周期,提高产率.
（5）固定化植物细胞易于与培养液分离,利于产品的分离纯化,提高产品质量.
2.3.2 植物细胞固定化的方法：
◆植物细胞固定化的方法主要有吸附法和包埋法两种.
◆吸附法是将植物细胞吸附在泡沫塑料的孔洞或裂缝内,或者将植物细胞吸附在中空纤维的外壁上.
◆包埋法是将植物细胞包埋在琼脂、角叉菜胶、海藻酸钙凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、明胶等多孔凝胶之中.包埋方法与微生物细胞包埋时基本相同.
2.3.3固定化植物细胞的应用：
◆固定化植物细胞的主要用途是制造人工种子,就有可能获得大量具有相同遗传特性的植株.对种质的保存具有重要意义.并可以节约种子的用量.
◆固定化植物细胞还可以用于生产各种色素、香精、药物、酶等次级代谢物.
2.4动物细胞固定化
2.4.2固定化动物细胞的特点：
（1）提高细胞存活率：动物细胞经固定化后,由于有载体的保护作用,可以减轻或免受剪切力的影响,同时动物细胞可附着在载体表面生长,从而可显着提高动物细胞的存活率.
（2）提高产率：动物细胞固定化后,可先在生长培养基中生长繁殖,使细胞在载体上形成最佳分布并达到一定的细胞密度.然后可简便地改换成发酵培养基,控制发酵条件,使细胞从生长期转变到生产期,以利于提高产率.
（3）固定化动物细胞可反复使用或连续使用较长的时间.例如,中国仓鼠卵巢细胞（CHO）生产人干扰素可以稳定地生产30天.
（4）固定化细胞易于与产物分开,利于产物分离纯化,提高产品质量.
2.4.2动物细胞固定化方法：
◆动物细胞固定化地方法有吸附法和包埋法两种.
(1)吸附法：
◆大多数动物细胞属于附着细胞,它们在培养过程中,必须趋向于附着在固体表面.故此吸附法特别适合于动物细胞的固定化.
◆转瓶是由玻璃或塑料制成,表面经过一定方法处理而带上电荷.
◆微载体是指颗粒细小的固定化载体,直径一般为100～200μm,相对密度接近1.0.是由带有表面电荷的葡聚糖、明胶、纤维素、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯或玻璃等材料制成.微载体已用于多种动物细胞的固定化；
◆中空纤维由聚丙烯、硅化聚碳酸酯等高分子聚合物制成.
(2)包埋法
◆包埋固定化法一般适用于悬浮细胞.
◆根据载体和方法的不同,有凝胶包埋法、半透膜包埋法两种.
①凝胶包埋法：利用各种多孔凝胶为载体将动物细胞固定化.细胞被固定在凝胶的微孔中生长繁殖和新陈代谢,由于有载体的保护,动物细胞有较好的稳定性,可显着提高其存活率.
用于动物细胞固定化的凝胶载体主要有琼脂糖凝胶、海藻酸钙凝胶和血纤维蛋白等.
②半透膜包埋法：利用高分子聚合物形成的半透膜将动物细胞包埋,形成微囊型固定化动物细胞.
2.4.3固定化动物细胞的应用：
动物细胞中大部分为贴壁细胞,需要贴附在载体的表面才能正常生长.所以固定化动物细胞广泛应用.特别是采用微载体对动物细胞进行吸附固定化.

3.原生质体固定化
◆固定化原生质体的制备主要包括原生质体的制备和原生质体固定化两个阶段.
3.1原生质体的制备
◆不同种类的细胞,由于各自细胞壁的组成、结构和性质不同,原生质体的制备方法也不一样.
◆原生质体的制备过程是首先将对数生长期的细胞收集起来,悬浮在含有渗透压稳定剂的高渗缓冲液中.然后加入适宜的细胞壁水解酶,在一定的条件下作用一段时间,使细胞壁破坏.分离除去细胞壁碎片、未作用的细胞以及细胞壁水解酶,而得到原生质体.
◆除去细胞壁所使用的酶应根据细胞壁的主要成分的不同而进行选择.
◇细菌的细胞壁主要成分是肽多糖,所以细菌原生质体制备时主要采用从蛋清中得到的溶菌酶；
◇酵母细胞壁主要由β-葡聚糖构成,故采用β-1,3-葡聚糖酶；
◇霉菌的细胞壁组分比较复杂,除含有几丁质外,还有其他多种组分,故要去除霉菌的细胞壁,则需有几丁质酶与其他有关酶共同作用.
◇植物细胞壁由纤维素、半纤维素和果胶组成,故制备植物原生质体时主要应用纤维素酶和果胶酶.
◆为防止制备得到的原生质体破裂,应加入适当的渗透压稳定剂.如：无机盐、糖类、糖醇等化合物.
◆应选择对数生长期的细胞制备原生质体,以获得较高的原生质体形成率.
◆所加进的细胞壁溶解酶的种类和浓度、酶作用温度,pH值以及作用时间等对原生质体的制备都有明显影响,必须经过试验确定其最佳条件.
3.2原生质体固定化
◆采用包埋法制成固定化原生质体.
◆原生质体固定化一般采用凝胶包埋法.常用的凝胶有：琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶和光交联树脂等.
3.3固定化原生质体的特点：
(1)固定化原生质体由于解除了细胞壁这一扩散屏障,可增加细胞膜的通透性,有利于氧气和营养物质的传递和吸收,也有利于胞内物质的分泌,可显着提高产率.
(2)固定化原生质体由于有载体的保护作用,具有较好的操作稳定性和保存稳定性,可反复使用和连续使用较长的时间,利于连续化生产.在冰箱保存较长时间后仍能保持其生产能力.
(3)固定化原生质体易于和发酵产物分开,有利于产物的分离纯化,提高产品质量.
(4)固定化原生质体发酵的培养基中需要添加渗透压稳定剂,以保持原生质体的稳定性.这些渗透压稳定剂在发酵结束后,可用层析或膜分离技术等方法与产物分离.
3.4固定化原生质体的应用
固定化原生质体一方面保持了细胞原有的新陈代谢特性,可以照常产生原来在细胞内产生的各种代谢产物,另一方面又去除了细胞壁这一扩散屏障,有利于胞内产物不断地分泌到胞外,这样就可以不经过细胞破碎和提取工艺而在发酵液中获得所需的发酵产物,为胞内物质的工业化生产开辟了新途径.
固定化原生质体可用于各种氨基酸、酶和生物碱等物质的生产以及甾体转化等.

‘叁’ 生物选修四酶的知识点

酶(enzyme)是由活细胞产生的、对其底物具有高度特异性和高度催化效能的蛋白质或RNA。酶的催化作用有赖于酶分子的一级结构及空间结构的完整。若酶分子变性或亚基解聚均可导致酶活性丧失。下面我给大家分享一些生物选修四酶的知识，希望能够帮助大家，欢迎阅读!

生物选修四酶的知识1

课题1 果胶酶在果汁生产中的作用由水果制作果汁要解决两个主要问题：一是果肉的出汁率低，耗时长;二是榨取的果汁浑浊、黏度高，容易发生沉淀。

1、植物细胞壁以及胞间层的主要组成成分有纤维素和_果胶_。并且两者不溶于水，在果汁加工中，既影响出汁率，又使果汁浑浊。

2、果胶是植物细胞壁以及胞间层的主要组成成分之一，它是由半乳糖醛酸聚合而成的一种高分子化合物，不溶于水。在果汁加工中，果胶不仅会影响出汁率，还会使果汁浑浊。果胶酶的作用是能够将果胶_分解成可溶性的_半乳醛酸，瓦解植物的细胞壁及胞间层，并且使果汁变得澄清。

3、果胶酶是一类酶总称，包括_果胶分解酶 、 多聚半乳糖醛酸酶 、果胶酯酶_等。

4、酶的活性是指 酶催化一定化学反应的 的能力。酶活性的高低可以用在一定条件下，酶所催化的某一化学反应的反应速度 来表示。在科学研究与工业生产中，酶反应速度用单位时间内、单位体积中反应物的减小量或产物的增加量来表示。

5、影响酶活性的因素包括：温度 、PH、酶的抑制剂等。

(二).实验设计

〔设计一〕探究温度对酶活性的影响 当酶处于最适温度或最适pH时，酶的活性最高;若温度过高、过酸或过碱，则导致酶变性失活。在一定范围内，果肉的出汁率和果汁的澄清度与果胶酶的活性成正比。 此实验的自变量是温度 _;根据单一变量原则，你应确保各实验组相同的变量有_PH 底物浓度底物量 实验器材 酶的用量 等等_。

〔设计二〕探究PH对酶活性的影响探究pH对果胶酶活性的影响，只须将温度梯度改成pH梯度，并选定一个适宜的温度进行水浴加热。反应液中的pH可以通过体积分数为0.1%的氢氧化钠或盐酸溶液进行调节。

〔设计三〕探究果胶酶的用量探究果胶酶的用量是建立在探究最适温度和pH对果胶酶活性影响的基础之上的。此时，研究的变量是果胶酶的用量，其他因素都应保持不变。实验时可以配制不同浓度的果胶酶溶液，也可以只配制一种浓度的果胶酶溶液，然后使用不同的体积即可。需要注意的是，反应液的pH必须相同，否则将影响实验结果的准旁栏思考题

1.为什么在混合苹果泥和果胶酶之前，要将果泥和果胶酶分装在不同的试管中恒温处理?提示：将果泥和果胶酶分装在不同的试管中恒温处理，可以保证底物和酶在混合时的温度是相同的，避免了果泥和果胶酶混合时影响混合物的温度，从而影响果胶酶活性的问题。

2.在探究温度或pH的影响时，是否需要设置对照?如果需要，又应该如何设置?为什么?提示：需要设置对照实验，不同的温度梯度之间或不同的pH梯度之间就可以作为对照，这种对照称为相互对照。

3.A同学将哪个因素作为变量，控制哪些因素不变?为什么要作这样的处理?B同学呢?提示：A同学将温度或pH作为变量，控制不变的量有苹果泥的用量、果胶酶的用量、反应的时间和过滤的时间等。只有在实验中保证一个自变量，实验结果才能说明问题。B同学对于变量的处理应该与A同学相同，只是观察因变量的角度不同

4.想一想，为什么能够通过测定滤出的苹果汁的体积大小来判断果胶酶活性的高低?提示：果胶酶将果胶分解为小分子物质，小分子物质可以通过滤纸，因此苹果汁的体积大小反应了果胶酶的催化分解果胶的能力。在不同的温度和pH下，果胶酶的活性越大，苹果汁的体积就越大。

5.当探究温度对果胶酶活性的影响时，哪个因素是变量，哪些因素应该保持不变?提示：温度是变量，应控制果泥量、果胶酶的浓度和用量、水浴时间和混合物的pH等所有其他条件不变。只有这样才能保证只有温度一个变量对果胶酶的活性产生影响。

生物选修四酶的知识2

探讨加酶洗衣粉的洗涤效果

1、酶绝大多数是蛋白质，少数为RNA;酶具有生物 催化 作用;酶具有高效 性、专一性特点，但易受温度、PH、表面活性剂等因素的影响。

(1)加酶洗衣粉是指含酶制剂 的洗衣粉，目前常用的酶制剂有蛋白酶 、 脂肪酶 、淀粉酶和纤维素酶四类。普通洗衣粉中含磷，含磷的污水排放可能导致 微生物和藻类大量繁殖，造成水体污染，加酶洗衣粉可以降低表面活性剂和三聚磷酸钠，使洗涤剂朝无磷的方向发展，减少对环境的污染。

(2)脂肪酶可以将脂肪分解成 甘油和脂肪酸，蛋白酶可以将蛋白质分解成 小分子肽和氨基酸 ，小分子肽可在 肽酶 作用下分解成氨基酸;淀粉酶可以将淀粉分解成 可溶性麦芽糖，纤维素酶可以将纤维素分解成 葡萄糖 ，以达到去污的目的，因此，蛋白类纤维织物(羊毛、蚕丝等)不能用 加(蛋白)酶洗衣粉 来洗涤。

(3)应用最广泛、效果最明显的是 碱性蛋白 酶和 碱性脂肪 酶。 碱性蛋白酶能将血渍 、 奶渍等含有大分子蛋白质水解成可溶性的氨基酸或 小分子的肽，使污迹容易从衣物上脱落。

(4)衣物的洗涤，不仅要考虑到洗涤效果，还要考虑衣物的承受能力 、 洗涤成本等因素。

(5)加酶洗衣粉可以降低表面活性剂和三聚磷酸钠的用量，使洗衣粉朝低磷无磷的方向发展，减少对环境的污染。

2、实验设计遵循原则：是单一变量原则、对照原则和等量原则，比如探究普通洗衣粉和加酶洗衣粉对衣物污渍的洗涤效果有何不同时，用控制使用不同种类洗衣粉为变量，其他条件完全一致;同时普通洗衣粉处理污渍物与加酶洗衣粉处理污渍物形成 对照 实验。

3.不同种类的酶洗衣粉对同一污渍的洗涤效果(1)实验原理：不同种类的加酶洗衣粉所加的酶不同，而酶具有 专一性 ，所以对不同污渍的洗涤效果不同。

4、比较普通洗衣粉和加酶洗衣粉去污原理的异同

生物选修四酶的知识3

酵母细胞的固定化课题背景

1、问题：酶对环境条件敏感，易失活;溶液中的酶很难回收，不能再次利用，提高了生产成本;反应后的酶会混合在产物中，如不除去，会影响产品质量。设想：将酶固定在不溶于水的载体上。优点：使酶既能与反应物接触，又能与产物分离，同时，固定在载体上的酶还可以反复利用。

2、问题：一种酶只能催化一种化学反应，而在生产实践中，很多产物的形成都是通过一系列的酶促反应才能得到的。设想：将合成酶的细胞直接固定。优点：成本更低，操作更容易。

一、基础知识

(一)固定化酶的应用实例1、高果糖浆是指果糖含量为42%左右的糖浆，能将葡萄糖转化为果糖的酶是葡萄糖异构酶。2、使用固定化酶技术，将这种酶固定在一种颗粒状的载体上，再将这些酶颗粒装到一个反应柱内，柱子底端装上分布着许多小孔的筛板。酶颗粒无法通过筛板的小孔，而反应溶液却可以自由出入。生产过程中，将葡萄糖溶液从反应柱的上端注入，使葡萄糖溶液流过反应柱，与固定化葡萄糖异构酶接触，转化成果糖，从反应柱的下端流出。反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本，提高了果糖的产量和质量。(二)固定化细胞技术1、固定化酶和固定化细胞是利用物理或化学 方法 将酶或细胞固定在一定空间内的技术，包括包埋法、化学结合法和物理吸附法。2、一般来说，酶更适合采用化学结合法和物理吸附法固定，而细胞多采用包埋法固定化。这是因为细胞体积比酶分子的体积大;体积大的细胞难以被吸附或结合，而个小的酶容易从包埋材料中漏出。3、包埋法法固定化细胞，即将微生物细胞均匀地包埋在不溶于水的不溶于水的载体中。常用的载体有明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等。

二、实验操作

(一)制备固定化酵母细胞1.酵母细胞的活化活化就是处于休眠状态的微生物重新恢复正常的生活状态。2.配制物质的量的浓度为0.05mol/L的CaCl2溶液3.配制海藻酸钠溶液加热溶化海藻酸钠时要注意小火间断加热，重复几次，并不断搅拌，直到海藻酸钠融化为止。如果加热太快，海藻酸钠会发生焦糊。4.海藻酸钠溶液与酵母菌细胞混合 将海藻酸钠溶液冷却至室温，加入已活化的海藻酸钠溶液，进行充分搅拌，使其混合均匀，在转移至注射器中。5.固定化酵母细胞以恒定的速度缓慢地将注射器中的溶液滴加到刚配制好的CaCl2溶液中，并浸泡30min(时间)左右。

(二)用固定化酵母细胞发酵1.将固定好的酵母细胞(凝胶珠)用蒸馏水冲洗2-3次。2.将10%葡萄糖溶液转移至锥形瓶中，加入固定好的酵母细胞，置于25℃下发酵24h(时间)。

三、结果分析与评价

(一)观察凝胶珠的颜色和形状如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色，说明海藻酸钠浓度浓度偏低，该种凝胶珠包埋的酵母细胞数目少，影响实验效果;如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明海藻酸钠浓度浓度偏高，制作失败，需要再作尝试。

(二)观察发酵的葡萄糖溶液利用固定的酵母细胞发酵产生酒精，可以看到产生了很多气泡，同时会闻到酒味。

四、课题延伸工业生产中，细胞的固定化技术是在严格无菌的条件下进行的。

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‘肆’ 果胶酶能够催化果胶分解，瓦解植物的细胞壁及胞间层，使榨取果汁更容易，也使得浑浊的果汁变得澄清．请回

（1）a、苹果泥和果胶酶分别恒温处理再混合，目的是保证底物和酶混合时的温度是相同的，不会发生温度的变化．
b、实验的不同温度梯度之间可形成相互对照，无需补充果汁和蒸馏水混合实验．
c、若探究果胶酶的最适用量，果胶酶的量是自变量，其他是无关变量，应加以控制，如 pH、温度、果泥量、果胶酶浓度等．
（2）果胶酶和纤维素酶的本质均为蛋白质，二者都是在核糖体上合成的，催化果胶酶水解的酶是果胶酶，构成纤维素酶的基本单位是氨基酸．
（3）若用海藻酸钠作载体制备固定化霉菌，由于海藻酸钠溶解速度较慢，需用小火间断加热，若加热太快会出现焦糊．固定化细胞技术一般采用包埋法固定化，原因是细胞个体大，不易从包埋材料中漏出．
故答案为：
（1）a．保证底物和酶在混合时的温度是相同的b．没有，实验的不同温度梯度之间可形成相互对照c．pH、果胶酶浓度、果泥量
（2）BD
（3）浓度适宜加热时用小火或间断加热细胞个体大，不易从包埋材料中漏出

‘伍’ 果胶的制作方法

制作工艺流程是：原料→预处理→抽提→脱色→浓缩→干燥→成品。
1．原料及其处理 鲜果皮或干燥保存的柚皮均可作为原料。鲜果皮应及时处理，以免原料中产生果胶酶类水解作用，使果胶产量或胶凝度下降。先将果皮搅碎至粒径2～3mm，置于蒸汽或沸水中处理5～8min，以钝化果胶酶活性。杀酶后的原料再在水中清泡30min，并加热到90℃5min，压去汁液，用清水漂洗数次，尽可能除去苦味、色素及可溶性杂质。榨出的汁液可供回收柚苷。干皮温水浸泡复水后，采取以上同样处理备用。
2．抽提 通常用酸法提取。将处理过的柚皮倒入夹层锅中，加4倍水，并用工业盐酸调ph至1.5～2.0，加热到95℃，在不断搅拌中保持恒温60min。趁热过滤得果胶萃取液。待冷却至50℃，加入1%～2%淀粉酶以分解其中的淀粉，酶作用终了时，再加热至80℃杀酶。然后加0.5%～2%活性炭，在80℃下搅拌20min，过滤得脱色滤液。
因柚皮中钙、镁等离子含量较高，这些离子对果胶有封闭作用，影响果胶转化为水溶性果胶，同时也因皮中杂质含量高，而影响胶凝度，故酸法提取率较低，质量较差。为解决以上问题，西南农业大学食品学院(1995)对酸法提取作了改进，即在酸法基础上，按干皮重量加入5%的732阳离子交换树脂或按浸提液重量加入0.3%～0.4%六偏磷酸钠，前者果胶得率可提高7.2%～8.56%，胶凝度提高30%以上，而后者得率提高25.35%～ 35.2%，其胶凝度可达180±3。
3．浓缩 采用真空浓缩法，在55～60c的条件下，将提取液的果胶含量提高到4%～6．5%后进行后续工序处理。近来作者和国内其他单位研究表明，超滤可用于果胶液浓缩，如用切割分子量为50 000u的管式聚丙烯腈膜超滤器，在温度45℃、ph3.0、压力0.2mpa条件下进行超滤浓缩，可将果胶浓度浓缩至4.21%，而其杂质含量和经常性生产费用分别仅为真空浓缩的1/5和1/2～1/3。
4．干燥 常用方法为沉淀干燥法，即用95%酒精或铝、铜等金属盐类使果胶沉淀。以酒精沉淀法制取的果胶质量最佳。其方法是：在果胶浓缩液中加入重量1.5%的工业盐酸，搅匀，再徐徐加入等量的95%酒精，边加边搅拌，使果胶沉淀析出。再用80%的酒精洗涤，除去醇溶性杂质。然后用95%酸性酒精洗涤2次，用螺旋压榨机榨干后，将果胶沉淀送入真空干燥机在60℃下干燥至含水量10%以下，把果胶研细，密封包装即成果胶粉成品。用金属盐类沉淀果胶，其杂质含量较高，现较少采用。
直到2013年国外果胶干燥大多采用喷雾干燥，即用压力式喷雾干燥，将浓缩液在进料温度150～160℃，出料温度220～230℃的条件下干燥，连续化操作中可不断得到粉末状产品。西南农业大学食品学院用超滤浓缩液进行喷雾干燥试验，结果表明该法是完全可行的，果胶质量符合国家标准。 制作低甲氧基果胶的方法主要有碱法、酸法和酶法3种。现介绍碱法和酶法两种。1．碱法 把果胶浓缩液放入不锈钢锅中，加氢氧化铵调ph至10.5，15℃下恒温保持3h。再加等体积的95%酒精和适量盐酸，使ph降至5左右。搅拌后静置1h，滤出沉淀果胶，榨干，再分别用50%和95%酒精各洗涤1次，压干后摊于烘盘上，在65℃真空干燥器中烘干，取去磨细、包装即得成品。产率大约为果胶量的90%。
2．酶法 即用果胶脂酶脱脂提取低甲氧基果胶。广东省果树研究所蔡长河等(1996)成功地研制出采用酶法从柚皮中提取低脂果胶的工业化生产技术。与传统碱法和酸法相比，其具有工艺易于控制、产品质量高、节省能耗和降低成本等优点，现对该法作一简单介绍，其工艺流程如下：
柚皮→粉碎→水洗→脱脂→提胶→压滤→沉析→压滤→除盐醇洗→压滤→干燥→粉碎→成品。
原料搅碎：将原料搅碎成3～5mm大小。
水洗：50℃清水浸泡30min，离心，再用清水漂洗2～3次，直至洗出液呈无色为止。
脱脂：加入适量碳酸钠以激活果皮内源pe酶，进行脱脂。工艺条件以温度50℃，时间1h，ph7.0，碳酸钠为7g/kg新鲜皮(25g/kg干皮)的组合为最佳。
提胶：加盐酸(调ph1.7～2.0)在95℃下提胶。
沉析：加入适量cacl2沉析果胶。
除盐醇洗：将盐酸、草酸按1：3的比例混合，在醇溶液中除盐，并经多次醇洗，
干燥和粉碎：在60℃下真空烘干，烘干后的果胶用粉碎机粉碎成果胶粉。该法果胶得率鲜柚皮为3.5%～4%，干柚皮为12%～15%，胶凝度100±5，脂化度小于50%，达到了美国fcc质量标准。

‘陆’ 生物选修1知识点 详细

徐州二中2011届生物知识点汇总（选修一模块）

考点一、酶的应用：酵在洗涤等方面的应用；制备和应用固相酶
一、酶在洗涤等方面的应用
1．加酶洗衣粉是指含有酶制剂的洗衣粉,目前常用的酶制剂有四类：蛋白酶、脂肪酶 、淀粉酶、纤维素酶 。其中应用最广泛、效果最明显的是碱性蛋白酶 和碱性脂肪酶 。碱性蛋白酶能将血渍、奶渍等含有的大分子蛋白质水解成可溶性的氨基酸或小分子的肽，使污迹从衣物上脱落。脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶也能分别将大分子的脂肪、淀粉、纤维素水解为小分子物质，使洗衣粉具有更强的去污能力。
酶制剂的特点：能够耐酸、耐碱、忍受表面活性剂和较高的温度，并且通过特殊的化学物质将酶层层包裹，与洗衣粉其他成分隔离。
2、影响酶活性的因素有温度 、酸碱度 和表面活性剂 。 酶不能直接添加到洗衣粉中，因为洗衣粉中的表面活性物质会降低酶的活性。将基因工程生产出的酶用特殊水溶性物质包裹起来，与洗衣粉的其它成分隔离开来。
3、加酶洗衣粉能减少对环境的污染，因为加酶洗衣粉可以降低表面活性剂和三聚磷酸钠的用量，使洗涤剂朝低磷、无磷的方向发展。（普通洗衣粉的化学成分有：表面活性剂、水软化剂、碱剂、漂白粉等成分，有的洗衣粉中还含有增白剂、香精和色素，以及填充剂等。）
  普通洗衣粉 加酶洗衣粉
相同点 表面活性剂可以产生泡沫，可以将油脂分子分散开，水软化剂可以分散污垢
不同点 酶可以将大分子有机物分解为小分子有机物，小分子有机物易容于水，从而与纤维分开
4、可在洗涤后比较污物的残留状况，如：已消失、颜色变浅、面积缩小等来判断洗涤效果。
二、制备和应用固相酶
1、固定化酶是指在一定的空间范围内起催化作用，并能反复和连续使用的酶。
原理：将酶固定在不溶于水的载体上，使酶既易催化反应，又易于回收，可以重复使用。
2、使用固定化酶技术，将这种酶固定在一种颗粒状载体上，再将这些酶颗粒装到一个反应柱内，柱子底端装上分布着许多小孔的筛板。酶颗粒无法通过筛板的小孔，而反应溶液却可以自由出入。生产过程中，将葡萄糖溶液从反应柱的上端注入，使葡萄糖溶液流过反应柱，与固定化葡萄糖异构酶接触，转化成果糖，从反应柱的下端流出。反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本，提高了果糖的产量和质量。
3．固定化酶和固定化细胞是利用物理或化学的方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术，包括包埋法、化学结合法和物理吸附法。一般来说，酶更适合采用化学结合和物理吸附法固定，而细胞多采用包埋法固定化。这是因为细胞个大，而酶分子很小；个大的难以被吸附或结合，而个小的酶容易从包埋材料中漏出。
4．包埋法法固定化细胞即将微生物细胞包埋在不溶于水的载体中。常用的载体材料有明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等。
固定化细胞是在固定化酶的基础上发展起来的，它的优点如下：(1)省去了酶的分离手续.为多酶系统,无须辅因子再生；(2)细胞生长快,而且多,反应快；(3)可以连续发酵,节约了成本,而且在蒸馏和提取前不用分离去细胞,能一边徘出发酵液,一边进行培养,排除了产物抑制和消耗；(4)保持酶在细胞内的原始状况,增加了酶的稳定,特别是对污染因子的抵抗力增加.
缺点：(1)必须保持菌体的完整,防止菌体自溶,否则,将影响产品纯度；(2)必须防止细胞内蛋白酶对所需酶的分解,同时,需抑制胞内其他酶的活性止副产物的形成；(3)细胞膜,壁会阻碍底物渗透和扩散。
类型 优点 不足
直接使用酶 催化效率高，低耗能、低污染等。 对环境条件非常敏感，容易失活；溶液中的酶很难回收，不能被再次利用，提高了生产成本；反应后酶会混在产物中，可能影响产品质量。
固定化酶 既能与反应物接触，又能与产物分离，固定在载体上的酶还可以被反复利用。 一种酶只能催化一种化学反应，而在生产实践中，很多产物的形成都通过一系列的酶促反应才能得到的。
固定化细胞 成本低，操作更容易。 固定后的酶或细胞与反应物不容易接近，可能导致反应效果下降等。
应用：1、某一实验小组的同学，欲通过制备固定化酵母细胞进行葡萄糖溶液发酵实验，实验材料及用具齐全。（1）酵母细胞的固定采用的方法是包埋法。
（2）请完善该实验小组的同学在制备固定化酵母细胞过程的步骤
①配制氯化钙溶液时应用蒸馏水。 ②海藻酸钠溶解应用小火间断加热，边搅拌边加热。③海藻酸钠溶液必须冷却至室温才能加入酵母细胞。④注射器中的海藻酸钠和酵母细胞的混合物应滴入氯化钙溶液中形成凝胶珠。
（3）该实验小组用如图所示的装置来进行葡萄糖发酵
①为使该实验中所用到的固定化酵母细胞可以反复运用，实验过程中，一定要在无菌条件下进行。
②加入反应液后的操作是关闭活塞1和活塞2。
③装置的长导管起到什么作用？释放CO2，减小反应柱内压力；防止空气进入反应柱。
（4）实验过程中，可能会观察到的现象：有气泡产生、有酒味散发
实验过程中，装置内可能会发生的反应式为：（有氧呼吸、无氧呼吸产生酒精和二氧化碳）
应用：2、麦芽汁可以渗入到由海藻酸钠和啤酒酵母制成的凝胶珠中，啤酒酵母可以利用自身细胞内的一系列酶将可发酵性糖转化成乙醇。下面是利用固定化酵母细胞发酵生产啤酒的实验过程：
步骤1：酵母细胞的活化。称取lg干酵母置于50mL烧杯中，加l0mL蒸馏水，搅拌，静置1h。
步骤2：配制物质的量浓度为0．05mol／L的氯化钙(CaCl2)溶液。
步骤3：配制海藻酸钠溶液。称取0.7g海藻酸钠置于50mI烧杯中，加l0mL蒸馏水，烧杯放在酒精灯上用小火或间断加热。
步骤4：在冷却至常温的海藻酸钠溶液中加入活化的酵母细胞，充分混合后转入注射器
步骤5：固定化酵母细胞。以恒定的速度缓慢地将注射器中的溶液滴加到配制好的氯化钙(CaCl2)溶液中形成凝胶珠，让凝胶珠在氯化钙(CaCl2)溶液中浸泡30分钟。
步骤6：固定化酵母细胞(凝胶珠)用蒸馏水冲洗2～3次。
步骤7：将适量的凝胶珠放人500mL锥形瓶中，加300mL已消毒的麦芽汁，封口于25℃下发酵。
仔细阅读上述过程，回答下列问题：
(1)步骤6用蒸馏水冲洗2～3次的目的是：洗去杂质(氯化钙)和杂菌，防止污染。
(2)发酵产物酒精可用重铬酸钾进行检验，但需在酸性性条件下才呈现灰绿色。
(3)如何检验凝胶珠的质量是否合格？（方法一是用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液体流出，就表明凝胶珠的制作成功。方法二是在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠是成功的。）
考点二、生物技术在食品加工中的应用：发酵食品加工的基本方法
一、发酵： 广义：是通过微生物的培养来大量生产各种代谢产物的过程。包括有氧发酵（如醋酸发酵、谷氨酸发酵）和无氧发酵（如酒精发酵）。 狭义：是指微生物的无氧呼吸（包括酒精发酵、乳酸发酵等）。 所以：发酵≠无氧呼吸。
应用： 酿酒、发馒头、面包制作、酒精制造、生产药用酵母片、生产维生素、生产抗菌素等。
二、果酒制作的原理：菌种：酵母菌，单细胞真核生物，异养兼性厌氧型，适宜条件下出芽生殖1、酵母菌的兼性厌氧生活方式：在有氧条件下，有氧呼吸，大量繁殖（无性的出芽生殖）。在无氧条件下，酒精发酵。 繁殖的最适温度：20℃； 酒精发酵的最适温度：18~25℃。
在缺氧、20℃左右（一般将温度控制在18～25℃，最适为20℃）、呈酸性的发酵液中，酵母菌可繁殖并进行酒精发酵。而绝大多数其它微生物都因无法适应这一环境而受到抑制。2、温度对发酵的影响：酵母菌只能在一定温度下生活。温度低于10℃，酵母菌发育很缓慢。随着温度的升高，繁殖速度加快，20℃时为最佳繁殖温度，此时酵母菌生殖速度快、生活力强。超过35℃，酵母菌生长受到抑制，繁殖速度迅速下降，到40℃酵母菌停止出芽，开始出现死亡。如果想要获得高酒精浓度的发酵液、减少究竟的损耗，必须控制好发酵温度。
3、防止发酵液被污染的措施：榨汁机要洗净并晾干、发酵瓶要洗净并用70%的酒精消毒、装入葡萄汁后要密封
4、葡萄酒呈红色的原因：在发酵的过程中，随着酒精度的提高，红葡萄皮的色素也进入发酵液，使葡萄酒呈红色。
三、果醋制作的原理：菌种：醋酸菌，原核生物，异养需氧型，二分裂生殖1、酒变醋的原理：当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸；当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸。C2H5OH＋O2→CH3COOH＋H2O （发酵条件：温度适宜、适时通气、控制糖源供应）2、控制发酵条件的作用：①醋酸菌对氧气的含量特别敏感，当进行深层发酵时，即使只是短时间中断通入氧气，也会引起醋酸菌死亡。②醋酸菌最适生长温度为30～35℃，控制好发酵温度，使发酵时间缩短，又减少杂菌污染的机会。3、醋酸菌的来源：菌种可以到当地生产食醋的工厂或菌种保藏中心购买。也可以从食醋中分离醋酸菌。 果酒果醋的制作流程：挑选葡萄→冲洗→榨汁→酒精发酵→果酒（→醋酸发酵→果醋）四、腐乳制作的原理：菌种：毛霉，真核生物，异养需氧，孢子生殖
1、多种微生物参与了豆腐的发酵，如青霉、酵母、曲霉、毛霉等，其中起主要作用的是毛霉。毛霉是一种丝状真菌。毛霉等微生物产生的蛋白酶能将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸；脂肪酶可将脂肪水解为甘油和脂肪酸。2、腐乳制作的实验流程：让豆腐上长出毛霉→加盐腌制→加卤汤装瓶→密封腌制（1）毛霉的生长：将豆腐块平放在笼屉内，将笼屉中的控制在15～18℃，并保持一定的温度。约48小时后，毛霉开始生长，3天后菌丝生长旺盛，5天后豆腐块表面布满菌丝。豆腐块上生长的毛霉来自空气中的毛霉孢子，而现代的腐乳生产是在严格无菌的条件下，将优良毛霉菌种直接接种在豆腐上，这样可以避免其他菌种的污染，保证产品的质量。（2）加盐腌制：将长满毛霉的豆腐块分层整齐地摆放在瓶中，同时逐层加盐，随着层数的加高而增加盐量，接近瓶口表面的盐要铺厚一些。加盐腌制的时间约为8天左右。加盐可以析出豆腐中的水分，使豆腐块变硬，在后期的制作过程中不会过早酥烂。同时，盐能抑制微生物的生长，避免豆腐块腐败变质。（3）配制卤汤：卤汤直接关系到腐乳的色、香、味。卤汤是由酒及各种香辛料配制而成的。卤汤中酒的含量一般控制在12%左右。加酒可以抑制微生物的生长，同时能使腐乳具有独特的香味。香辛料可以调制腐乳的风味，也具有防腐杀菌的作用。3、实验注意事项（1）控制好材料的用量：①用盐腌制时，注意控制盐的用量，盐的浓度过低，不足以抑制微生物的生长，可能导致豆腐腐败变质；盐的浓度过高会影响腐乳的口味。②卤汤中酒的含量应控制在12%左右，酒精含量越高，对蛋白酶的抑制作用也越大，使腐乳成熟期延长；酒精含量过低，不足以抑制微生物的生长，蛋白酶的活性高，加快蛋白质的水解，杂菌繁殖快，豆腐易腐败，难以成块。③所用豆腐含水量在70%左右，含水量过高不易成形。
（2）防止杂菌污染：①用来腌制腐乳的玻璃瓶，洗刷干净后要用沸水消毒。②装瓶时，操作要迅速小心。整齐地摆放好豆腐、加入卤汤后，要用胶条将瓶口密封。封瓶时，最好将瓶口通过酒精灯的火焰，防止瓶口被污染。③越接近瓶口，杂菌污染的可能性越大，因此要随着豆腐层数的加高加盐量要增加，接近瓶品表面的盐要铺的厚一些。
考点三、生物技术在其他方面的应用：蛋白质的提取和分离
一、蛋白质的提取和分离的基本原理和方法
1、实验原理：蛋白质的物化理性质：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别，由此提取和分离各种蛋白质。2、凝胶色谱法（分配色谱法）：（1）原理：分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。（2）凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。（3）分离过程： 混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子(洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。)（4）作用： 分离蛋白质，测定生物大分子分子量，蛋白质的脱盐等。3．缓冲溶液：（1）原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H2CO3－NaHCO3，HC－NaC，NaH2PO4/Na2HPO4等），调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。（2）作用：抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。4．凝胶电泳法：（1）原理：不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。（2）分离方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。（3）分离过程：在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。
二、蛋白质的提取和分离的实验步骤：
1、样品处理 ①红细胞的洗涤：洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，采集的血样要及时采用低速短时间离心分离红细胞，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水，缓慢搅拌10min，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。②血红蛋白的释放 ：在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。（注：加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要相同。加入甲苯的目的是溶解细胞膜，有利于血红蛋白的释放和分离。）2、粗分离 ①分离血红蛋白溶液：将搅拌好的混合溶液离心后，试管中的溶液分为4层。第一层为无色透明的甲苯层，第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层，第3层是红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去之溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。②透析：取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量的浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中，透析12h。透析可以去除样品中分子量较小的杂质，或用于更换样品的缓冲液。3、纯化：4、纯度鉴定：SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
三、注意事项1、电泳技术：电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而达到对样品进行分离、鉴定或提纯的目的。2、红细胞的洗涤：如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。3．如何检测凝胶色谱柱的装填是否成功：由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。4．为什么凝胶的装填要紧密、均匀？如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流动次序，影响分离的效果。5．沸水浴处理加入洗脱液的湿凝胶的目的：不但节约时间，还能除去凝胶中可能带有的微生物和排除凝胶内的空气。6．G-75：“G”代表凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围，75表示凝胶得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5g。7．装填完后，立即用洗脱液洗脱的目的：使凝胶装填紧密8．加入柠檬酸钠有何目的？为什么要低速、短时离心？为什么要缓慢搅拌？防止血液凝固；防止白细胞沉淀；防止红细胞破裂释放出血红蛋白。9．与其他真核细胞相比，红细胞的特点及这一特点对进行蛋白质的分离的意义：哺乳动物及人的成熟的红细胞是双面凹圆饼状，没有细胞核和细胞器。其含有的血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。10．如何检测血红蛋白的分离是否成功：如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关

‘柒’ [生物-生物技术实践]工业生产果汁时，常常利用果胶酶破除果肉细胞壁以提高出果汁率，为研究温度对果胶酶

（1）细胞壁的成分主要是纤维素和果胶，根据酶的专一性，果胶酶能使细胞壁中的果胶分解．
（2）根据实验结果即表中数据分析得出：当温度为40℃时果汁量最多，此时果胶酶的活性最大．
（3）实验步骤①中将果胶酶与苹果泥分装于不同试管，在30℃水浴中恒温处理10min，这是为了避免果汁和果胶酶混合时影响混合物温度，从而影响果胶酶活性，并且实验的单一变量就是温度．
（4）实验变量为温度，因变量为果汁体积，故以横坐标表示温度，纵坐标表示果汁体积，实验操作和记录是比较切实可行的．在原材料有限的情况下，能正确表示相同时间内果胶酶的用量对果汁产量影响的曲线是丙．
（5）这了使实验结果更准确，对各组实验pH的要求是将PH值调到该酶活性最大时的PH，并保证所有实验组PH相同．
（6）果胶酶和苹果泥一旦混合就会发生反应，从而影响实验结果．
（7）如果进行多批次的生产，提高果胶酶的利用率，可采用固定化酶方法．
故答案为：
（1）果胶
（2）40℃
（3）使得酶与果泥处于同一温度条件下（确保混合前后温度不改变）
（4）果汁体积 丙．
（5）将PH值调到该酶活性最大时的PH，并保证所有实验组PH相同．
（6）实验结果不准确，果胶酶和苹果泥一旦混合就会发生反应．
（7）固定化酶

‘捌’ 如图是苹果醋的制作简图，据图回答有关问题：（1）在果汁加工中，果胶不仅影响水果的______率，还使果汁

（1）在果汁加工中，果胶不仅影响水果的出汁率，还使果汁浑浊；根据酶的专一性原理，制备纯净果汁时常加入来自霉菌发酵生产的果胶酶．为便于工业化使用，常采用固定化酶技术；固定方法有包埋法、化学结合法和物理吸附法，而固定化酶常用化学结合法（或物理吸附法）．
（2）①表示利用鲜苹果汁发酵产生苹果就，该过程中使用到的微生物是酵母菌；果酒发酵装置中往往放置一装有水的弯曲玻璃管，目的是防止氧气进入，防止杂菌污染，同时还能排出发酵过程中产生的CO₂，减小瓶中压力．酵母菌生存的适宜温度是18～25℃，因此果酒发酵时温度一般控制在18～25℃范围内．
（3）②表示利用苹果酒发酵形成苹果醋，该过程使用到的微生物是醋酸菌．醋酸菌生存的适宜温度是30～35℃，且为嗜氧菌，因此过程③的进行需要将温度控制在30～35℃，时间控制在7～8天左右，并注意适时通过充气口充气．
故答案为：
（1）出汁 霉菌 固定化酶 化学结合法（或物理吸附法）
（2）酵母菌 杂菌 排出发酵过程中产生的CO₂，减小瓶中压力 18～25
（3）醋酸菌 7～8 充气

‘玖’ 高中生物选修一知识点小总结

懒惰象生锈一样，比操劳更能消耗身体;经常用的钥匙，总是亮闪闪的。下面给大家分享一些关于高中生物选修一知识点小 总结 ，希望对大家有所帮助。

高中生物选修一知识点总结：酶的研究与应用

1、果胶酶作用：分解果胶，瓦解植物的细胞壁及胞间层，提高水果的出汁率，并使果汁变得澄清。

2、果胶酶并不特指某一种酶，包括多聚半乳糖醛酸酶、果胶分解酶和果胶酯酶等。

3、酶的活性可用单位时间内、单位体积中反应物的减少量或产物的增加量来表示。

4、目前常用的酶制剂有四类：蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶，其中应用最广泛、效果最明显的是碱性蛋白酶和碱性脂肪酶。

5、加酶洗衣粉的作用原理：碱性蛋白酶能将血渍、奶渍等含有的大分子蛋白质水解成可溶性的氨基酸或小分子的肽，使污迹容易从衣物上脱落。同样道理，脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶也能将大分子的脂肪、淀粉和纤维素水解为小分子物质。

6、固定化技术包括：包埋法、化学结合法和物理吸附法。一般来说，酶更适合采用化学结合法和物理吸附法固定化，而细胞多采用包埋法固定化。因为细胞个大，而酶分子很小;个大的细胞难以被吸附或结合，而个小的酶容易从包埋材料中漏出。

7、固定化酵母细胞时，酵母细胞的活化用蒸馏水;配制海藻酸钠溶液时，加热要用小火，或者间断加热;要将海藻酸钠溶液冷却至室温，再加入活化的酵母细胞。CaCl2溶液有利于凝胶珠形成稳定的结构。

高中生物选修一知识点总结：DNA和蛋白质技术

1、提取生物大分子的基本思路是选用一定的物理或化学 方法 分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。

2、DNA溶解性：①DNA在不同浓度的NaCL溶液中溶解度不同。在0.14moL/L的NaCL溶液中，溶解度最小。②DNA不溶于酒精。

3、DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性：因为酶有专一性，蛋白酶能水解蛋白质，但对DNA没有影响。DNA比较能耐高温。洗涤剂能够瓦解细胞膜，但对DNA无影响。

4、在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。

5、提取DNA的材料一般用鸡血而不用猪血，因为哺乳动物(猪)成熟的红细胞无细胞核，无DNA。

6、破碎鸡血细胞时，可以加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。

7、为了纯化提取的DNA，需要将滤液进一步处理。在滤液中加入NaCL，使其浓度为2mol/L，过滤除去不溶的杂质，再加入蒸馏水，使NaCL浓度为0.14mol/L，析出DNA，过滤除去溶液中的杂质。

8、向溶解了DNA的NaCL溶液中加入体积分数为95%的冷却的酒精溶液，目的是提取含杂质更少的DNA。

9、PCR原理：DNA体外复制

10、PCR的条件：①一定的缓冲溶液;②DNA模板;③分别与两条模板链相结合的两种引物;④四种脱氧核苷酸;⑤耐热的DNA聚合酶;⑥控制温度的仪器设备。

11、为什么要引物?因为DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链。DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。

12、PCR三步骤：变性、复性和延伸。在PCR循环之前，常要进行一次预变性，以便增加大分子模板DNA彻底变性的概率。

13、PCR的结果：特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。

14、DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰。

15、蛋白质分离的方法：凝胶色谱法和电泳。

16、凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。相对分子质量较小的蛋白质，移动速度慢，后洗脱出来;相对分子质量较大的蛋白质，移动速度快，先洗脱出来。

17、电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现各种分子的分离。

高中生物选修一知识点总结：植物有效成分的提取。

1、植物芳香油的提取方法：蒸馏、压榨和萃取。

2、水蒸汽蒸馏法是利用水蒸汽将挥发性较强的植物芳香油携带出来，形成油水混合物，冷却后又重新分出油层和水层。如玫瑰油、薄荷油等(也可用萃取法)。

3、柑橘、柠檬芳香油的制备常使用压榨法，因为水中蒸馏会导致原料焦糊和有效成分水解。

4、胡萝卜素的提取一般用萃取法。萃取法是将粉碎、干燥的植物原料用有机溶剂浸泡，使芳香油溶解在有机溶剂中，然后蒸发出有机溶剂，获取纯净的植物芳香油。

5、石油醚具有较高的沸点，能充分溶解胡萝卜素，并且不与水混溶，所以适宜用作胡萝卜素的萃取剂。

6、玫瑰精油的化学性质稳定，难溶于水，易溶于有机溶剂，能随水蒸汽一同蒸馏。故适用于蒸馏法。

7、玫瑰精油的油水混合物中加入NaCL目的是增加水层密度，使油水分层。分离油层后加无水Na2SO4，目的是除去水，再过滤去除Na2SO4。

8、橘皮压榨前用石灰水浸泡，目的是破坏细胞结构、分解果胶、防止橘皮压榨时滑脱，提高出油率。

9、胡萝卜素是橘黄色结晶，化学性质比较稳定，不溶于水，微溶于乙醇，易溶于石油醚等有机溶剂，所以适于用萃取法。

10、萃取时采用水浴加热，以防有机溶剂燃烧、爆炸。瓶口安装回流冷凝装置，以防止加热时有机溶剂挥发。

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‘拾’ 酶在果蔬加工中的应用。

酶在果蔬汁加工中的应用近年来，采用果胶酶和其他的酶(如纤维素酶等)处理蔬菜、水果，大大提高了蔬菜、水果的出汁率，简化了工艺步骤，并且可制得透明澄清的果蔬汁，再经过种种调配就可以制成品种繁多的饮料食品，如胡萝卜汁、苹果汁、番茄汁、洋葱汁饮料等。经酶处理的果汁比较稳定，可防止混浊，还可以保护其原有色泽和风味从而延长贮藏期。果蔬汁加工的工艺流程果蔬去皮―→果蔬压榨―→澄清、过滤―→提取―→贮藏（果蔬汁的稳定性、色泽和风味）果蔬去皮―→果蔬压榨―→澄清、过滤―→提取―→贮藏果蔬去皮软化桔子，剥除桔皮利用加压或真空浸渍果蔬，使果胶酶渗入细胞间隙或细胞壁中而起作用。此法已用于完整桔子的软化,桔皮容易剥除。 果蔬压榨、提高果蔬出汁率1）在提高果蔬出汁率方面应用最广泛的酶是果胶酶，其次是纤维素酶。果浆榨汁前添加一定量果胶酶可以有效地分解果肉组织中的果胶物质，使果汁粘度降低，容易榨汁、过滤，从而提高出汁率。纤维素酶可以使果蔬中大分子纤维素降解成分子量较小的纤维二糖和葡萄糖分子，破坏植物细胞壁，使细胞内溶物充分释放，提高出汁率，并提高可溶性固形物含量。目前已成功地利用纤维素酶将柑橘皮渣酶解制取含果饮料，其中粗纤维有５０％转化为可溶性糖，另外5０％降解为短链低聚糖，构成含果饮料的膳食纤维，具有一定的保健医疗价值。在生产中，两种酶适当配比使用，则更有效提高产率。2）粥化酶又称软化酶，是由黑曲霉经过固态发酵而获得的复合酶，它以果胶酶、纤维素酶、木聚糖酶为主，并含有蛋白酶、淀粉酶等。在果蔬加工中，粥化酶可以溃碎果实，破碎植物细胞，使果蔬原料产生粥样软化，从而提高果蔬汁的出汁率、澄清度以及降低果汁粘度。如在苹果汁生产中，采用粥化酶，将使生产过程更简捷，添加的成本大大降低。在苹果破碎酶解时，加入粥化酶Ⅰ，在果汁脱胶时加入粥化酶Ⅱ，添加酶的成本仅有国外酶制剂的15％～20％。加入粥化酶Ⅰ目的时提高果蔬的出汁率，可以使果蔬的果胶物质，纤维素，蛋白质等被降解，使得细胞汁液释放率增加15％～25％。澄清果蔬汁果浆经榨汁、筛滤后，果汁中仍存在一些非常细小却能导致果蔬汁产生混浊的聚合物和固体颗粒。如果胶物质、淀粉、其他多糖类物质等，它们是引起果蔬汁混浊和褐变的主要原因。如果在新鲜果蔬汁（或经杀菌后的果蔬汁）中加入果胶酶、纤维素酶、α－淀粉酶、木瓜蛋白酶（可视混浊成分选择一种或几种），可将上述物质大部分降解为半乳糖醛酸、葡萄糖、氨基酸和其他产物，使果蔬汁澄清，同时可明显提高澄清汁的营养成分和稳定性。1）果胶酶在果蔬汁澄清中的作用果胶酶作用于果蔬汁时,除降低粘度外,还可产生絮凝作用,使果蔬汁澄清。澄清机理的实质包括果胶的酶促水解和非酶的静电絮凝两部分。新加工的果蔬汁一般是稳定的胶体系统,其主要稳定因素是果胶,果胶的粘性对胶体起保护作用,也能阻止果蔬汁蛋白与带相反电荷的多酚物质或悬浮颗粒发生反应而沉降。当果蔬汁中的果胶酶作用部分水解,使体系粘度下降,胶体失去了稳定性,使原来被包裹在内部的带正电荷的蛋白质颗粒暴露出来,与其它带负电荷的粒子相撞,就导致絮凝的发生。许多商品果胶酶制剂可用于苹果汁的澄清。研究结果表明,当加入内切－聚半乳糖醛酸酶和果胶酯酶混合制剂,使果胶中30%的酯键和5%的糖苷键被水解时,苹果汁就能达到充分澄清。实验证明,在苹果汁中添加0.07%的果胶酶制剂,在45℃下反应2h,过滤后可得到透光率达95%左右。吸光度为0.15的透明果汁。2）混合酶在荔枝汁澄清中的应用混合酶用于澄清荔枝汁的最优工艺条件是纤维素酶量600U/100g，果胶酶量1000U/100g，a-淀粉酶量250U/100g，木瓜蛋白酶量10000U/100g，酶解温度60℃，酶解时间4h，pH4.0，且pH 为主要影响因素。与原汁相比，采用最佳工艺对荔枝汁进行酶解澄清后，可溶性固形物、总糖、还原糖、总酸与氨基酸等营养成分的百分含量均比酶解前高，分别增加3.33% 、20.64% 、25.27%、270.79%和24.63%。澄清汁的澄清度与稳定性远高于原汁，混合酶解后的澄清汁在 0~24h 内透光率逐步提高，在 24~168h才呈现缓慢下降趋势，最终透光率仍保持80%；原汁透光率基本保持在50% 左右。原汁与澄清汁的果胶定性试验表明，原汁中的沉淀物多，澄清汁则无明显沉淀。酶法促进果蔬汁香气果蔬汁香气是影响其质量高低的主要因素，极易在加工过程中损失。近年来研究表明，在果蔬汁中添加酶制剂，可使其风味前体物水解产生香味物质。风味前体物通常是一些与糖形成糖苷，以键合态形式存在的风味物质。研究表明，单萜类化合物是嗅觉最为敏感的芳香物质。果蔬中大多数单萜物质均以吡喃、呋喃糖以键合态形式存在，并且在果蔬成熟后仍有大量这种键合态的萜类未被水解。通过添加β－葡萄糖苷酶可释放果蔬汁中的萜烯醇，增加香气。有实验证明，α－Ｌ－吡喃李糖苷酶或α－Ｌ－呋喃阿拉伯糖苷酶可释放水果中的沉香醇和香叶醇，使果汁增香。先前的研究得知，外加酶是从水果中提取出来的，非常不经济，而现在已可从曲霉、酵母中分离出风味酶。Shoseyov等用黑曲霉中分离出的 �0�8-葡萄糖苷酶水解西番莲果蔬汁，释放出大量沉香醇、苯甲醛和苯乙醇。当果汁中葡萄糖浓度高时会抑制�0�8-葡萄糖苷酶活性，Riou 等从米曲霉中分离出一种可耐受高葡萄糖值的�0�8-葡萄糖苷酶，该酶可将香叶醇、橙花醇、沉香醇从鲜葡萄汁中相应的单萜 - �0�8-葡萄糖苷中游离出来。Gueguen等用 DuoliteA-580醛固定化�0�8- 葡萄糖酶，其物化特性与游离酶相近，用 GC-MS检测通过该固定化酶的杏汁，发现a-r- 萜品烯、a-萜品醇、2-苯基乙醇和a-蒎烯均显着增加，其余几种果蔬汁经过该固定化后风味成分也有所增加。另有实验表明，从酵母中分离出的�0�8-葡萄糖苷酶也具有促进果蔬汁风味的能力。Dried将酵母中分离出的�0�8-葡萄糖苷酶水解芒果、西番汁，并与酸水解相比较，两水解法随着水解进行还会游离出不良的萜类物质，不利于果汁加工人们发现，�0�8- 葡萄糖苷酶在水解风味前体物的同时也可降解花色素苷-�0�8-葡萄糖苷，不利于红色果蔬汁加工。酶法除去果蔬汁中的异味柑桔类果汁在提炼之后不久就会变苦，这主要是由于柠檬苦素和柚皮苷所致。酶法脱苦主要是利用不同的酶分别作用于柠檬苦素和柚皮苷，使之生成不含苦味的物质。工业生产中常用固定化柚皮苷酶减少柑桔类果汁中的柚皮苷含量以去除苦味物质，该方法已取得良好的效果。柚皮苷酶可从商品柑桔果胶制剂、曲霉（Aspergillus）等获得。柚皮苷酶有２种酶活性－鼠李糖苷酶和葡萄糖苷酶，水解柚皮苷成为鼠李糖和没有苦味的糖苷配基柚配质，因而起脱苦作用。Tsen等在１９８９年使用甲壳素固定柚皮苷酶，并研究了固定化的动力学因子。Manio’n等使用空心玻璃床作为载体，分别使用DEAS Sephadex和单宁氨基乙基纤维作为载体生产固定化柚皮苷酶。