核酸提取常用的方法

‘壹’ DNA实验室常用的DNA提取方法有哪些

提取DNA主要有SDS和CTAB法，其实提取效果的好坏主要看提取的对象是什么样的材料，在提取之前一定要好好分析材料的特性，然后在设计实验步骤。
一）CTAB法
CTAB是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7
mol/L
NaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3
mol/L
NaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白质、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇。
（二）SDS法
利用高浓度的SDS，在较高温度（55—65℃）条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的做法使蛋白质及多糖杂质沉淀（最常用的是加入5M的KAc于冰上保温，在低温条件下KAc与蛋白质及多糖结合成不溶物），离心除去沉淀后，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。
以下是在提取热带水果DNA时设计的两种不同方法步骤，对比起来CTAB法好，在禾本科植物效果差不多！
1、
CTAB法
1）
在所需量的CTAB抽提液中加入2－巯基乙醇，使终浓度达2％（v/v）。将此溶液预热至65℃。
对于每克新鲜的叶组织大约需要4ml的2－ME/CTAB抽提液。
2）
用液氮（－196℃）或干冰（－78℃）冷却粉碎器/匀浆器，将0.5
g植物组织粉碎成细粉，然后将组织转移到2.0
ml离心管。
3）
加入800
µl预热的2－Me/CTAB，混合使之充分湿润，于65℃温育20
min，不时颠倒混匀。
4）
待冷至室温后，加入800
µl氯仿/异戊醇（24：1），颠倒混匀至溶液呈乳浊状----但不要振荡。25℃，10000
rpm离心10
min。
5）
上清（~700
µl）转移至另一干净的离心管中，加入5
µl
RNaseA贮液，37℃温育30
min。
6）
加入700
µl氯仿/异戊醇，颠倒混匀，25℃，10000
rpm离心10
min。
7）
上清（~600
µl）转移至另一干净的1.5
ml离心管中，加入600
µl异丙醇，颠倒混匀，室温或-20℃放置20
min。
8）
25℃，12000
rpm，离心10
min，收集沉淀。
9）
去上清，加1
ml70%乙醇洗涤沉淀两次。（25℃，12000
rpm，离心10
min）
10）凉干DNA，溶于50
µl
ddH2O，4℃保存备用。
2、
SDS法
①
将0.3
g植物材料于液氮速冻，然后在研钵中将其磨碎，将粉末转至2
ml离心管中。
②
加入1.2
ml预热至65℃的提取缓冲液（其中加入3
μl
β—巯基乙醇，增加DNA的稳定性），置65℃水浴中放置30分钟，不时颠倒混匀。。
③
加入0.45
ml
5M的醋酸钾，混匀，冰浴20分钟，在10000
rpm离心20
min。需要的话，Miracloth纱布过滤除去沉淀，上清液转入另一离心管中。
④
加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），轻轻颠倒混匀，12000
rpm离心15
min。
⑤
转移上清液到另一新离心管中，加5
μl
RNaseA贮液，37℃温育30
min。
⑥
加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），轻轻颠倒混匀，12000
rpm离心15
min。
⑦
转移上清液到另一新离心管中，加入0.7V异丙醇，轻轻颠倒混匀，-20℃放置30分钟沉淀核酸。
⑧
25℃，12000
rpm，离心10
min，收集沉淀。
⑨
弃上清，70％乙醇洗两次。
⑩
凉干DNA，溶于50
µl
ddH2O，4℃保存备用。

‘贰’ 核酸检验方法

核酸检测具体流程如下：
1. 核酸提取
使用硅胶柱离心、磁性硅胶颗粒分离方法以及自动化仪器等商品化试剂或设备并按说明书操作。提取RNA时应注意防止RNA降解。DNA应置于-20℃保存，RNA和需长期保存的DNA应置于-80℃保存。
2. 逆转录合成cDNA
逆转录cDNA合成反应需使用逆转录引物、dNTPs、逆转录酶、RNA酶抑制剂、DTT、缓冲液和适量无RNA/DNA酶的超纯水以及RNA模板。在扩增仪或水浴箱中，在规定的温度和时间下进行逆转录反应。建议使用商品化RT-PCR一步法试剂进行第一轮扩增反应。逆转录cDNA合成反应需使用逆转录引物、dNTPs、逆转录酶、RNA酶抑制剂、DTT、缓冲液和适量无RNA/DNA酶的超纯水以及RNA模板。在扩增仪或水浴箱中，在规定的温度和时间下进行逆转录反应。使用商品化RT-PCR一步法试剂进行第一轮扩增反应。
3. PCR扩增反应（使用二次扩增的套式PCR扩增方法）
PCR反应需使用引物、dNTPs、DNA聚合酶（如Taq酶等）、缓冲液、和适量无RNA/DNA酶超纯水、以及模板（DNA或cDNA）。在扩增仪中，按照设定的程序进行扩增。使用二次扩增的套式PCR扩增方法。
4. 扩增产物定性分析
扩增产物常用分析方法是琼脂糖凝胶电泳法，与分子量标准比较，判断扩增片段是否在预期的分子量范围内。其它扩增产物分析方法还有限制性内切酶酶切分析、特异性探针杂交分析以及DNA序列分析等。自动化核酸扩增仪使用酶联比色分析或荧光探针杂交等原理测定。
5.结果判定和完成报告单
（1）实验成立的条件：每一次检测需同时做两个阳性对照、两个阴性对照，只有阳性对照扩增出预期的片段、阴性对照没有扩增出任何片段、双份平行样品结果一致的情况下实验才成立，可以作出核酸阳性或阴性反应结果的判定。
（2）HIV核酸检测阳性：发现核酸阳性反应，应该重复采集样品进行复测，复测结果呈核酸阳性反应则判定为核酸阳性，复测结果为核酸阴性反应则判为不确定结果，需进一步随访检测。
（3）HIV核酸检测阴性：只可报告本次实验结果阴性。
（4）应在完成检测后5个工作日内发出检测报告。

‘叁’ 核酸的分离方法有什么

核酸（nucleic acid）是遗传信息的携带者,是基因表达的物质基础.无论是进行核酸结构还是功能研究,首先需要对核酸进行分离和纯化.核酸样品质量将直接关系到实验的成败.核酸分离、纯化原则：1.保持核酸分子一级结构的完整性.因为遗传信息全部储存在一级结构之中,核酸的—级结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式.2.分离核酸原则:1）温度不要过高；2）控制pH值范围(pH值5-9); 3）保持一定离子强度; 4）减少物理因素对核酸的机械剪切力.
在核酸分离提取中最重要的是要防止核酸的生物降解,细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键,破坏核酸一级结构.所用器械和一些试剂需高温灭菌,提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂.
常用的DNA酶抑制剂有1.金属离子螯合剂：如EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二钠)、8-羟基喹啉.2.阴离于型表面活性剂如SDS,该试剂除对核酸酶有抑制作用外,还能使蛋白质变性,并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物,该复合物在高盐溶液中沉淀.
常用的RNA酶（RNAase)抑制剂有：1.皂土（bentonite ）作用机制：皂土带负电荷,能吸附RNase,使其失活.2. DEPC(二乙基焦碳酸盐) (C2H5OCOOCOOC2H5)粘性液体,很强的核酸酶抑制剂.作用机制：与蛋白质中His结合使蛋白变性.

‘肆’ 认识核酸提取的知识笔记2020-05-07

一．核酸抽提原理：

核酸抽提包含样品的裂解和纯化两大步骤。其是：裂解样品中的核酸游离在体系；纯化游离的核酸，使之与体系中的其它成分分离（如蛋白质、盐及其它杂质彻底分离）。

常用的裂解液：包括去污剂 (如 SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20 等) 和盐 (如 Tris、EDTA、NaCl 等)。

去污剂的作用，是通过使蛋白质变性、破坏膜结构、解开与核酸相连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系中。

盐的作用，除了提供一个合适的裂解环境 (如 Tris)，还包括抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破坏 (如 EDTA)、维持核酸结构的稳定 (如NaCl) 等。

裂解体系中还可能加入蛋白酶，利用蛋白酶将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白质的分开，同时，也便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。也有直接使用高浓度的蛋白质变性剂 (如 GIT、GuHCl 等) 裂解的，该方法已经成为了 RNA 抽提的主流，却不是基因组 DNA 抽提的主流。

二．最常用的纯化方法

（一） PC 抽提（Phenol-chloroform extraction：酚氯仿抽提）+醇沉淀：利用PC对裂解体系进行反复抽提以去除蛋白质，实现核酸与蛋白质的分离，再用醇将核酸沉淀下来，实现核酸与盐的分离。

（二）介质纯化：利用某些固项介质，在某些特定的条件下，选择性地吸附核酸，而不吸附蛋白质及盐的特点，实现核酸与蛋白质及盐的分离。

（三）高盐沉淀去除蛋白质是第一种纯化方法的一个变体，省略了PC操作的麻烦，也有不纯化的抽提方法，但是用途多局限于简单的 PCR。

三．裂解方法的评价

（一）含蛋白酶的裂解方法是抽提基因组 DNA 的首选。包括裂解游离的膜蛋白与基因组 DNA 相连接的游离蛋白质。

（二）不使用蛋白酶的去污剂裂解方法，在细胞基因组 DNA 抽提方面仍然有优势。尤其是当得率和纯度要求不是最高，而经济性及操作简单很重要时，控制好裂解液/样品的比例是该方法成功的关键。该方法结合高盐沉淀，可以实现最简单的操作，但纯度及得率的稳定性可能会比用 PC 抽提的差一些。

（三）高浓度蛋白质变性剂 (如 GIT、GuHCl 等) 的裂解方法是抽提 RNA 的首选。

（四）含 CTAB 的裂解液，几乎成为富含多糖的样品，如细菌、植物的基因组 DNA 抽提的首选裂解方法。

（五）SDS 碱裂解法是质粒抽提的首选裂解方法，具有快速、得率高、几乎无基因组 DNA 污染的特点。

（六）PCR 模板的简易裂解方法，也是使用面很广的一类方法。该方法的特点是无须纯化，样品被裂解后即可直接取裂解液用于 PCR，非常快速。

四．纯化方法的评价

（一）PC 抽提/醇沉淀方法：稳定、可靠、经济、方便。PC 抽提可以彻底去除蛋白质，醇沉淀可以去除盐，对于一般的干净的样品 (杂质为蛋白质)，该方法完全可以获得高质量的核酸。

（二）高盐沉淀蛋白质/醇沉淀方法：同样也是一个非常不错的方法。与 PC 抽提方法相比，除了纯度的稳定性可能要低一点外，该方法几乎克服了 PC 抽提的所有缺点。更快、更轻松去除蛋白质所伴随的好处是，可以用于大规模抽提，不足是纯度 (蛋白质残留) 不够稳定。

（三）介质纯化方法：是一个越来越受到重视的方法。其最大特点是非常适合大规模核酸抽提，并且因为受人为操作因素影响小，纯度的稳定性很高 (虽然纯度不一定比PC 纯化方法更高)。其致命弱点是样品过量。介质可以分为两大类，一类是柱式的，即介质被预先装填在下面是通的柱子里；另外一类则是颗粒状 (如Glassmilk、磁性小珠等)。

五．醇的沉淀

醇的沉淀，目的是使核酸从裂解体系中沉淀下来，从而实现核酸与其它杂质（主要是盐）的分离。实际操作中，许多杂质也会与核酸一起被醇沉淀下来，尤其是当其它杂质的浓度也比较高的时候。醇的沉淀并不是非常特异性的，任何有机大分子及一些盐，当浓度达到一定水平后，都可能同步被沉淀下来。最有参考价值的是 TRIzol 提供的一个沉淀方案：一半异丙醇加一半高盐溶液替代纯粹的异丙醇，可以大大降低多糖残留。

PEG、LiCl、CTAB 都可以用于核酸沉淀。虽然它们远没有醇沉淀的高使用频率，但却各有特点。LiCl 可以沉淀 RNA 以去除DNA，CTAB 可以从含多糖的裂解体系中将核酸沉淀下来。PEG是沉淀病毒颗粒的方便手段。

六．洗涤

洗涤首先一定要将沉淀悬浮起来；第二就是要有一定的时间，尤其是当核酸沉淀比较大时 (使核酸沉淀最终蓬松)；第三是少量多次；第四则是去上清要彻底。

七．核酸质量的检测问题

目前用于正式实验前检测核酸质量的方法，一是电泳，二是紫外分光光度仪。

（一）电泳检测的主要是核酸的完整性和大小，只要核酸不是太小或者太大 (超出电泳分离范围)，电泳还可以用于估计核酸的浓度，但其准确度与经验有关；另外，电泳也可能提供某些杂质污染的信息。

（二）紫外分光光度仪检测的是纯度和核酸含量，该仪器的灵敏度非常高，A230 : A260 : A280 = 1 : 2 (DNA 为 1.8) : 1 为理论上的数据，实际测定时会有一些差别；但如果差别太大，就有问题了。如： A260/A230 > 2 就是纯的，如果 A260/A280

> 2.3 就是核酸降解，A260/A230比2大许多，一定是有杂质残留的。

八．核酸的溶解和保存

纯化后的核酸，最后多使用水或者低浓度缓冲液溶解；其中 RNA以水为主，DNA 则多以弱碱性的 Tris 或者 TE 溶解。经典的 DNA 溶解方法多提倡使用 TE 溶解，认为 EDTA 可以减少DNA 被可能残留下来的 DNase 降解的风险；如果操作过程控制得当，DNase 的残留几乎是可以忽略的，完全可以直接使用 Tris 或者水 (pH 接近 7) 溶解DNA。

实验室常用保存方法: -20℃保存的 DNA， -70℃保存的RNA。

‘伍’ 核酸的提取方法有几种

DNA的提取方法有7种：酚抽提法、甲酰胺解聚法、玻璃棒缠绕法、异丙醇沉淀法、表面活性剂快速制备法、加热法快速制备、碱变性快速制备。核酸是一类生物聚合物，是所有已知生命形式必不可少的组成物质。核酸是脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）的总称。
脱氧核糖核酸（英文DeoxyriboNucleicAcid，缩写为DNA）是生物细胞内含有的四种生物大分子之一核酸的一种。DNA携带有合成RNA和蛋白质所必需的遗传信息，是生物体发育和正常运作必不可少的生物大分子。DNA由脱氧核苷酸组成的大分子聚合物。脱氧核苷酸由碱基、脱氧核糖和磷酸构成。其中碱基有4种：腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）。

‘陆’ 核酸提取或纯化技术主要有哪几类

核酸提取或纯化技术主要有三类：

1、传统方法（操作复杂，耗时长）

2、离心柱法（试剂盒）

3、磁珠法（可单独采购磁珠或买成品试剂盒）

其中，磁珠法可实现自动化操作，是目前比较主流的方法。

核酸提取应用在疾病控制中心、临床疾病诊断、输血安全、法医学鉴定、环境微生物检测、食品安全检测、畜牧业和分子生物学研究等多种领域。

(6)核酸提取常用的方法扩展阅读：

核酸提取的注意事项：

1、仪器的安装环境：正常的大气压(海拔高度应该低于3000m)、温度20-35℃、典型使用温度25℃、相对湿度10%-80%、畅通流入的空气为35℃或以下。

2、避免将仪器放置在靠近热源的地方，如电暖炉；同时为防止电子元件的短路，应避免水或者其他液体溅入其中。

3、进风口和排风口均位于仪器背面，同时避免灰尘或纤维在进风口聚集，保持风道的畅通。

4、核酸提取仪离其他竖直面至少10cm。

5、仪器接地：为了避免触电事故，仪器的输入电源线必须接地。

6、远离带电电路：操作人员不得擅自拆解仪器，更换元件或进行机内调节必须有持证的专业维修人员完成，不要在接通电源的情况下更换元件。

‘柒’ 核酸含量的测定方法及原理都有哪些

核酸检测的主要原理其实是反转录和聚合酶链式扩增反应。也叫做RT-PCR。目前对新型冠状病毒进行的核酸检测也主要采用此种方式。简单来说就是采取患者鼻咽拭子、痰和其他下呼吸道分泌物、血液、粪便，检测人员通过。核酸提取试剂盒提取患者标本里边儿的核酸，然后把提取到的核酸放进检测试剂中进行复制扩增。然后再根据检测结果进行判断如果是阴性代表没有感染，如果是阳性代表有感染。目前对新型冠状病毒核酸检测会存在假阴性的可能，所以可以选择多次测量。如果连续两次核酸检测为阴性，同时没有临床症状可以排除感染，并且对已经感染了新型冠状病毒肺炎的患者，如果连续两次检测核酸为阴性，注意间隔时间必须大于一天，同时临床症状缓解，影像学好转也可以解除隔离。

‘捌’ 核酸提取中除去蛋白质的方法主要有哪几种

可以用氯仿抽提之后离心，离心后分三层，下层有机层中有一些脂溶性的杂质，中间层白色絮状沉淀是蛋白，上清液中即含有核酸。也有很多试剂盒，是可以把核酸挂在柱子上，把蛋白质等杂质离心掉，这个方法即快捷又方便。

凝胶过滤，这是很容易去除小分子杂质物质的方法。

如果蛋白样本和核酸的分子大小差别比较大，可以考虑用超滤的方法。

超滤是以压力为推动力的膜分离技术之一，以大分子与小分子分离为目的 。

加入核酸酶消化三个小时。

比如加一定量的DNAase 和RNAse酶消化。

(8)核酸提取常用的方法扩展阅读：

核酸模板在核酸聚合酶、引物、四种单脱氧核苷酸存在条件下复制或转录时，如果在四管反应系统中分别按比例引入四种双脱氧核苷酸，只要双脱氧核苷酸掺入链端，该链就停止延长，链端掺入单脱氧核苷酸的片段可继续延长。

如此每管反应体系中便合成以共同引物为5’端，以双脱氧核苷酸为3’端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后，分四个泳道进行电泳。以分离长短不一的核酸片段（长度相邻者仅差一个核苷酸），根据片段3’端的双脱氧核苷酸，便可依次阅读合成片段的核苷酸排列顺序。

‘玖’ 提取基因组DNA的方法有哪些各有何优缺点

1、苯酚氯仿抽提法

优点是采用了实验室常见的试剂和药品，做起来成本比较低廉。

缺点是由于使用了苯酚、氯仿等试剂，毒性较大，长时间操作对人员健康有较大影响，而且核酸的回收率较低，损失量较大，由于操作体系大，不同实验人员操作重复性差，不利于保护RNA，很难进行微量化的操作。

2、离心柱法

离心柱法DNA提取它的优点是比传统的酚氯法提取的纯度高，有利于RNA保护，而且能进行微量操作，以其低廉的价格和相对便捷的操作，渐逐取代了传统DNA提取方法，被高校科研所等市场普遍接受。

离心柱法DNA提取的缺点是需要较多的样本，耗材多，对于珍稀样本无能为力，特别是在法医、考古等领域显得力不从心。

同时离心柱法DNA提取需要反复离心，不便于高通量、自动化操作，与现代生物学实验的高通量、自动化要求格格不入，特别是在基因诊断、疾病检测、转基因检测等领域，离心柱法DNA提取需要大量的操作人员及仪器设备。

当面对突发疫情时，更是需要有高通量的DNA提取设备与方法才能更有效准确的监测疫情、控制疫情。

3、磁珠法

磁珠法是纳米科技与生物技术的完美结合，具有其他DNA提取方法无法比拟的优势，主要体现在：

（1）能够实现自动化、高通量操作，配合96孔的核酸自动提取仪，在以往做一个样品的提取时间内可同时实现对96个样品的处理，效率直接提高96倍，满足了当前生物学高通量操作的要求，使得在大规模疫情爆发时能够进行快速筛查原因，这个优点是其他方法难以赶超的。

（2）操作简单、用时短，整个提取流程只有裂解、结合、洗涤、洗脱四步短时间内即可完成。

（3）安全无毒，不使用传统方法中的苯、氯仿等有毒试剂，对实验操作人员的伤害少，保护了实验人员的身体健康。

（4）磁珠与核酸的特异性结合使得提取的核酸纯度高、浓度大。

（5）灵敏度高，适合法医样本等痕量DNA提取。

(9)核酸提取常用的方法扩展阅读：

磁珠法的原理是在磁珠表面修饰有对核酸有吸附作用的特定活性官能基团，通过不同的裂解液结合液洗涤液在特定的条件下能够与目的物质进行特异性结合，同时利用磁珠自身的磁性，在外磁场的作用下可以方便地实现定向移动与富集，从而达到核酸与杂质分离的目的，进而实现对目标物质的分离纯化，获得纯化核酸。

‘拾’ DNA的提取如何进行以及最常见的方法

提取DNA主要有SDS和CTAB法，其实提取效果的好坏主要看提取的对象是什么样的材料，在提取之前一定要好好分析材料的特性，然后在设计实验步骤。
一）CTAB法
CTAB是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7
mol/L
NaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3
mol/L
NaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白质、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇。
（二）SDS法
利用高浓度的SDS，在较高温度（55—65℃）条件下裂解细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的做法使蛋白质及多糖杂质沉淀（最常用的是加入5M的KAc于冰上保温，在低温条件下KAc与蛋白质及多糖结合成不溶物），离心除去沉淀后，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。
以下是在提取热带水果DNA时设计的两种不同方法步骤，对比起来CTAB法好，在禾本科植物效果差不多！
1、
CTAB法
1）
在所需量的CTAB抽提液中加入2－巯基乙醇，使终浓度达2％（v/v）。将此溶液预热至65℃。
对于每克新鲜的叶组织大约需要4ml的2－ME/CTAB抽提液。
2）
用液氮（－196℃）或干冰（－78℃）冷却粉碎器/匀浆器，将0.5
g植物组织粉碎成细粉，然后将组织转移到2.0
ml离心管。
3）
加入800
µl预热的2－Me/CTAB，混合使之充分湿润，于65℃温育20
min，不时颠倒混匀。
4）
待冷至室温后，加入800
µl氯仿/异戊醇（24：1），颠倒混匀至溶液呈乳浊状----但不要振荡。25℃，10000
rpm离心10
min。
5）
上清（~700
µl）转移至另一干净的离心管中，加入5
µl
RNaseA贮液，37℃温育30
min。
6）
加入700
µl氯仿/异戊醇，颠倒混匀，25℃，10000
rpm离心10
min。
7）
上清（~600
µl）转移至另一干净的1.5
ml离心管中，加入600
µl异丙醇，颠倒混匀，室温或-20℃放置20
min。
8）
25℃，12000
rpm，离心10
min，收集沉淀。
9）
去上清，加1
ml70%乙醇洗涤沉淀两次。（25℃，12000
rpm，离心10
min）
10）凉干DNA，溶于50
µl
ddH2O，4℃保存备用。
2、
SDS法
①
将0.3
g植物材料于液氮速冻，然后在研钵中将其磨碎，将粉末转至2
ml离心管中。
②
加入1.2
ml预热至65℃的提取缓冲液（其中加入3
μl
β—巯基乙醇，增加DNA的稳定性），置65℃水浴中放置30分钟，不时颠倒混匀。。
③
加入0.45
ml
5M的醋酸钾，混匀，冰浴20分钟，在10000
rpm离心20
min。需要的话，Miracloth纱布过滤除去沉淀，上清液转入另一离心管中。
④
加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），轻轻颠倒混匀，12000
rpm离心15
min。
⑤
转移上清液到另一新离心管中，加5
μl
RNaseA贮液，37℃温育30
min。
⑥
加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），轻轻颠倒混匀，12000
rpm离心15
min。
⑦
转移上清液到另一新离心管中，加入0.7V异丙醇，轻轻颠倒混匀，-20℃放置30分钟沉淀核酸。
⑧
25℃，12000
rpm，离心10
min，收集沉淀。
⑨
弃上清，70％乙醇洗两次。
⑩
凉干DNA，溶于50
µl
ddH2O，4℃保存备用。