分离该酶常用的方法

1. 酶的分离和纯化方法是什么

酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。

首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶制剂。

酶分离纯化的最终目的是获得单一纯净的酶，因此，容许在不破坏“目的酶”的限度内，使用各种手段;酶与底物和抑制剂的结合常使其理化性质和稳定性发生改变，这种特性已被用于酶的分离纯化。

由于酶及其来源的多样性及与之共存的高分子物质的复杂性，目前还很难找到一种通用的方法以适用于一切酶的纯化。为了使一种酶达到高度纯化，往往需要多种方法协同作用，通过酶活性的跟踪检测确定最佳流程。

(1)分离该酶常用的方法扩展阅读：

酶的本性是蛋白质，凡可用于蛋白质分离纯化的方法都同样适用于酶，但酶易失活，故分离纯化需在低温(4℃)、温和pH(4<pH>10)等条件下进行。

与蛋白质类似，酶易在溶液表面或界面处形成薄膜而变性，因此操作中应尽量减少泡沫形成，此外重金属易使酶失效，有机溶剂能使酶变性，微生物污染以及蛋白水解酶的存在能使酶分解破坏。

在进行菌种鉴定时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物。得到纯培养的过程称是分离纯化。

2. 如何从发酵液中分离一个蛋白酶如何测定其表达量和酶活

首先，去除菌体和残余的发酵液，一般高速离心就可以，5000r/min离心1min.取上清。此部要根据蛋白质的特点来做。若果蛋白酶是在细胞内那么要先破碎细胞，如果该酶的分子量过大，那么要减小离心转速。
其次，蛋白酶溶液中根据酶的性质，处理纯化或提取。常用方法是有机溶剂提取法，阴、阳离子交换柱层析发，液相色谱法等。这要根据蛋白质的性质，是否带电荷带什么电荷等。

关于酶活，应该每一步都要测定酶活，可用该酶分解蛋白质的特点，看一定的酶量在单位时间里分解蛋白的量，如果有特殊吸收峰的话可用紫外分光光度计测吸光度。

表达量，一般定量表达，常用方法是基因水平Realtime-PCR，蛋白水平，westen-blot法。也可参考其他相关文献的方法。

3. 提取酶的方法有哪些

酶本身的结构明白了提取的方法也就确定了！大多数酶属于蛋白质，所以提取酶多用的是蛋白质的提取方法！如果想要不变性的可用半透膜分离或沉淀，还有电泳，但是一般用半透膜，沉淀提取物有杂质！要变性的可用酸碱提取法，碱性蛋白质用弱酸性提取液，酸性蛋白用弱碱性提取液提取！

4. 怎样分离纯化酶

这是一门很深的学问，除了需要高科技还需要科研专用设备，只是简介，希望对你有帮助，不要上当受骗：

酶的分离纯化方法简介
生物细胞产生的酶有两类：一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用的酶，称为细胞外酶。这类酶大都是水解酶，如酶法生产葡萄糖所用的两种淀粉酶，就是由枯草杆菌和根酶发酵过程中分泌的。这类酶一般含量较高，容易得到；另一类酶在细胞内产生后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内酶，如柠檬酸、肌苷酸、味精的发酵生产所进行的一系列化学反应，就是在多种酶催化下在细胞内进行的，在类酶在细胞内往往与细胞结构结合，有一定的分布区域，催化的反应具有一定的顺序性，使许多反应能有条不紊地进行。
酶的来源多为生物细胞。生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的，但每一种酶的含量却很低，如胰脏中期消化作用的水解酶种类很多，但各种酶的含量却差别很大。
因此，在提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。从微生物中来生产酶制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量，用廉价原料可以大量生产。
由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。
酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。在提纯的过程中通过测定酶的催化活性可以比较容易跟踪酶在分离提纯过程中的去向。酶的催化活性又可以作为选择分离纯化方法和操作条件的指标，在整个酶的分离纯化过程中的每一步骤，始终要测定酶的总活力和比活力，这样才能知道经过某一步骤回收到多少酶，纯度提高了多少，从而决定着一步骤的取舍。

酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶制剂。下面就酶的分离纯化的常用方法作一综合介绍：
一、预处理及固液分离技术
1.细胞破碎（cell disruption）
高压均质器法：此法可用于破碎酵母菌、大肠菌、假单胞菌、杆菌甚至黑曲霉菌。将细胞悬浮液在高压下通入一个孔径可调的排放孔中，菌体从高压环境转到低压环境，细胞就容易破碎。菌悬液一次通过均质器的细胞破碎率在12%-67%。细胞破碎率与细胞的种类有关。要达到90%以上的细胞破碎率，起码要将菌悬液通过均质器两次。最好是提高操作压力，减少操作次数。但有人报道，当操作压力达到175Mpa时，破碎率可达100%。当压力超过70Mpa时，细胞破碎率上升较为缓慢。高压均质器的阀门是影响细胞破碎率的重要因素。丝状菌会堵塞均质器的阀门，尤其高浓度菌体时更是如此。在丰富培养基上比在合成培养基上生长的大肠菌更难破碎。
容菌酶处理法：蛋清中含有丰富的溶菌酶，价格便宜，常用来裂解细胞。具体做法是：溶壁微球菌(micrococcus lysodeikticus)43kg，置于0.5%的氯化钠溶液中，使细胞浓度为5%（干重），在35℃用0.68kg（干重）的蛋清处理20min，得到的细胞碎片用相同体积的乙醇处理，用离心机将细胞碎片和胞内蛋白质除去，再将乙醇浓度提高到75%（体积分数），可以得到纯度为5%的过氧化氢酶1500g。
2.离心
离心分离过程可分为离心过滤、离心沉淀、离心分离3种类型，所使用的设备有过滤式离心机、沉降式离心机和离心机。过滤式离心机的转鼓壁上开有小孔，壁上有过滤介质，一般可用于处理悬浮固体颗粒较大、固体含量较高的场合。沉降式离心机用于分离固体浓度较低的固液分离，如发酵液中的菌体，用盐析法或有机溶剂处理过的蛋白质等。分离机用于分离两种互不相溶的、密度有微小差别的乳浊液或含微量固体微粒的乳浊液。
在生物领域采用的离心机系统，除了应具备离心机的一般要求外，还应满足生物生产的技术要求，这包括灭菌、冷却、密封，以保证产品不受污染并不污染环境。现代哦离心机装置包括以下三个步骤，并进行程序控制：离心、离心系统的灭菌及就地清洗。如阿法-拉伐公司离心机产品的装置，具有双重轴向密封，密封由装在转筒主轴上下的碳化硅动环和固定环组成，密封由水连续冷却和润滑，可防止产品被污染，也可防止生产过程中排出的废物对环境的污染。该离心机又如一个密闭的压力容器，可在121℃温度下进行蒸汽灭菌，该离心设备设有环绕离心机转筒的冷却夹套，对悬浮液和浓缩的固体都能进行充分的冷却，并能有效地控制温度，这对于生物制品是非常重要的。如BTPX205型离心机可用于细胞收集、培养液的净化和细胞碎片的分离，可用于疫苗、酶制剂等的提取。该机的其他辅助系统及控制系统也较为完善，如设有压力指示器、力量计、温度传感器和液面传感器。
3.膜分离技术
在蛋白质纯化过程中主要用到的膜分离技术多为超滤。在静压作用下降溶液通过孔径非常小的滤膜，使溶液中分子量较小的溶质透过薄膜，而大分子被截留于膜表面。大多数超滤膜是由一层非常薄的功能膜与较厚的支撑膜结合在一起而组成的。功能膜决定了膜的孔径，而支撑膜提供机械强度以抵抗静压力。超滤浓缩的优点是：操作条件温和，无相变化，对生物活性物质没有破坏。
超滤系统主要由料液贮罐、泵、超滤器、透过液收集罐组成，料液经泵打入超滤器，水及低分子量物质排出超滤器外，被浓缩的料液在料液贮罐、泵、及超滤器中循环。当料液浓缩至一定的倍数后即可作为进一步处理的浓缩料液。
超滤应用于蛋白质类物质的浓缩和脱盐过程中时应注意以下问题：第一，在超滤循环过程中，由于泵和叶轮与料液的摩擦放热作用，料液的温度会逐渐升高，会造成蛋白质分子的损失。因此，料液贮罐应加冷却系统，并安装自动测温及控制系统。第二，某些酶的辅助因子散失为问题：一些酶含有辅助因子，其分子量小，超滤时易从透过液中排除掉，因而在超滤前或超滤后要添加一定浓度的的辅助因子。
还可将超滤与亲和层析相结合以提高分离纯度。其工作原理是：当溶液中欲被分离的蛋白质不受阻碍地通过超滤膜的孔隙时，如果在膜的一侧结合着亲和配基，该蛋白质就会与配基结合因而结聚在膜的这一侧。不与配基结合的其他物质就将穿过孔而被带走。再用适宜的洗脱剂将该蛋白质洗脱下来，洗脱液用于进一步的分离纯化。
4.泡沫分离
原理：将气体通入含多种组分的溶液中，由于这些组分的表面活性由差异，因此在溶液的表面，某些组分将形成泡沫，泡沫的稳定性取决于操作条件及溶液的生物学特性。泡沫中含有更多的表面活性成分，故泡沫的组分种类及其含量与溶液中的不相同。这样，溶液中的组分舅得以分离。
蛋白质较易吸附与气液界面，这有利于其结构的稳定。泡沫分离过程是：蛋白质从主体溶液中扩散到气液界面，该过程可能是可逆的也可能是不可逆的；分子发生重排，一般认为在空气-水界面会形成两种类型的膜，一种是稀膜，另一种是浓膜，可能会发生由多个分子聚集在一起的现象。在气液界面形成的蛋白质膜可以是单层的也可以是多层的。膜的类型取决于主体溶液及气液界面上蛋白质的特性、结构和浓度。
泡沫分离的目的，一方面提高酶蛋白的富集率（泡沫中蛋白质的浓度/最初溶液中蛋白质浓度），另一方面提高酶蛋白的提取率（泡沫中蛋白质的提取率/最初的蛋白质质量），或使多组分混合物中某一组分的分配系数最大。

二、抽提
沉淀
1. 盐析
常用的盐析剂是硫酸铵，其溶解度大、价格便宜。硫酸铵沉淀蛋白质的能力很强，其饱和溶液能使大多数的蛋白质沉淀下来。对酶没有破坏作用。
pH的控制：应从酶的溶解度与稳定性两个方面考虑，在酶等电点时其溶解度最小易沉淀，但有些酶再等电点时稳定性较差，因此要选择最佳pH值.一般要求在酶最稳定的pH值的前提下再考虑最适宜酶沉淀的pH值。在操作中一旦确定最佳pH值后，在添加硫酸铵之前甲酸或碱调节好酶液的pH值，要尽量避免溶液pH值的波动以免破坏酶的稳定性。在添加硫酸铵时要注意搅拌，并注意硫酸铵的加入速度，一般是由少到多，缓慢加入，硫酸铵尽可能磨成细粉。
温度的控制：有些酶在较高温度下稳定性能较好，可在常温下进行盐析操作，而对于大多数酶，尽可能在低温下操作。
酶液的净置：加完硫酸铵后，酶液要静置一段时间，使酶蛋白完全沉淀下来，酶静置后，就不要再加以搅拌。
2．有机溶剂沉淀
有机溶剂选择：可用于酶蛋白沉淀的有机溶剂包括醇类物质等，如甲醇、乙醇、异丙醇。乙醇的亲水性能较好，可防止蛋白质的变性，酶蛋白在其中的溶解度也较低。
有机溶剂沉淀操作：有机溶剂一般都使蛋白质变性，当温度较高时变性蛋白质分子就会变成永久失活。因此用有机溶剂处理时最好在0℃以下进行。用有机溶剂沉淀得到的酶蛋白不要放置过久，要尽快加水溶解。
3.聚合物絮凝剂沉淀
聚合物絮凝剂，如葡聚糖和聚乙二醇，与酶分子争夺水分子，具有脱水作用使酶沉淀。聚乙二醇作为一种沉淀剂的优点是在水溶液中，其浓度可达到50%，浓度为6%-12%的蛋白质大都可以沉淀下来。这种试剂不需要低温操作，而且对蛋白质的稳定还有一定的保护作用。聚乙二醇不会被吸附，故在离子交换吸附前不必去除。
4．用金属离子和络合物沉淀
酶和其他蛋白质都会形成金属盐，其溶解度较低。用金属离子沉淀的缺点是酶与金属离子相互作用后，可逆变化较差，尤其是用巯基衍生物，它结合的]金属离子会催化酶变性而失活。
5．用特殊试剂沉淀法
用链霉素可选择性去除核酸，从而使胞内酶沉淀出来。链霉素盐（浓度为0.5-1.0mg/mg蛋白质）对于选择性沉淀核酸的效果比锰离子还要好，酶不易失活。
6．亲和沉淀
将亲和反应的高度选择性、低处理量特性与沉淀操作的大处理量、地选择性有机结合形成了亲和沉淀技术。将配基与可溶性载体偶联后形成载体-配基复合物，该复合物与生物分子结合后在一定条件下可以沉淀出来。
配基-载体复合物可以选择性地与蛋白质结合，溶液中的pH值、离子强度及蛋白质浓度等条件对亲和结合的影响力并不大，只有竞争性的配基会降低产物与原配基的亲和结合力，甚至使亲和结合发生逆转。
引导产生沉淀的方法有：离子交联；加入带相反电荷的聚合物；加入带相反电荷的疏水基团；改变pH值，诱导产生疏水沉淀；温度诱导产生沉淀。
亲和结合：将亲和配基加入到含有目的物蛋白质的溶液中，调节好有关沉淀的条件，使之有利于亲和结合。
洗涤：为经过处理的粗制液中发生亲和沉淀可能会发生非特异性结合，尤其是使用带电的聚合物，离子交换的效应将使其他蛋白质共同沉淀，因此在分离目的物之前要洗涤沉淀物。其做法是：加入适当的清洗剂重新溶解沉淀，再沉淀；或在专一性洗脱之前，彻底清洗沉淀。在上述过程中要始终保持目的蛋白质与配基处于亲和结合状态。
配基-载体复合物与目的蛋白质的分离：分离结束之后，要确保回收目的蛋白质和配基-载体复合物，目的蛋白质要达到一定的纯度，回收率要高。

5. 酶的分离纯化一般经过哪些步骤应注意哪些问题

酶是一种特殊的蛋白质，在分离纯化过程中需要注意温度以及PH值等的控制，注意在纯化过程中所使用的缓冲溶液的离子强度的控制（常用PBS缓冲溶液），在实际纯化过程中，一般要在低温冰箱中进行，缓冲溶液中注意加入EDTA二钠盐（1-5mM）螯和重金属离子一般避免酶失活。常用分离步骤包括分子筛层析、离子交换、疏水层析等步骤。

6. 酶解分离原生质体有哪些常用的方法

分离常用方法：分离原生质体时，首先要使酶制剂大量吸附到细胞壁上去。

因此，一般先将材料分离成单细胞，然后分解细胞壁。采用将酶液减压渗入组织，或将组织切成薄片等方法，都可增加酶液与纤维素分子接触的机会。用酶法分离原生质体可以采用以下两种不同的方法路线。两步法或顺序法：首先用离析酶或果胶酶处理组织使胞间层降解，把细胞分开再用纤维素酶处理这些游离的细胞，使原生质体释放出来。

一步法或同时法：即把一定量的纤维素酶、果胶酶和半纤维素酶组成混合酶溶液，将材料置于其中处理，一次即可得到分离的原生质体。因为一步法方便省力，因此很常用。

7. 提取酶的方法有哪些

酶是蛋白质，可以根据其特点选择适当的蛋白质提取纯化方法！

选择材料及预处理

以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向，研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。蛋白质的制备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面。一是得用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于来同区域而达到分离目的，如电泳，超速离心，超滤等。在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、碱、高温，剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。蛋白质的制备一般分为以下四个阶段：选择材料和预处理，细胞的破碎及细胞器的分离，提取和纯化，浓细、干燥和保存。

微生物、植物和动物都可做为制备蛋白质的原材料，所选用的材料主要依据实验目的来确定。对于微生物，应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量，以微生物为材料时有两种情况：（1）得用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等；（2）利用菌体含有的生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等。植物材料必须经过去壳，脱脂并注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。对动物组织，必须选择有效成份含量丰富的脏器组织为原材料，先进行绞碎、脱脂等处理。另外，对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存，对于易分解的生物大分子应选用新鲜材料制备。

蛋白质的分离纯化

一，蛋白质（包括酶）的提取

大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。

（一）水溶液提取法

稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。
下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。
1、pH值
蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。
2、盐浓度
稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐，一般以0.15摩尔。升浓度为宜。缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。

（二）有机溶剂提取法

一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必须在低温下操作。丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内（度为10%，40度为6.6%）不会引起酶的变性失活。另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。

二、蛋白质的分离纯化

蛋白质的分离纯化方法很多，主要有：

（一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法

1、蛋白质的盐析
中性盐对蛋白质的溶解度有显着影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。
影响盐析的因素有：（1）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外，一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25度）比0度时溶解度低，更容易盐析。（2）pH值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。（3）蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来（共沉现象）。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在2.5-3.0%。
蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。 其中应用最多的硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大（25度时饱和溶液为4.1M，即767克/升；0度时饱和溶解度为3.9M，即676克/升），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间，当用其他pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。
蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入秀析袋内（常用的是玻璃纸），用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。

2、等电点沉淀法
蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结合用。

3、低温有机溶剂沉淀法
用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行。

（二）根据蛋白质分子大小的差别的分离方法

1、透析与超滤
透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。
超滤法是利用高压力或离心力，强使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的泸膜截留不同分子量的蛋白质。

2、凝胶过滤法
也称分子排阻层析或分子筛层析，这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶（Sephadex ged）和琼脂糖凝胶（agarose gel）。

（三）根据蛋白质带电性质进行分离

蛋白质在不同pH环境中带电性质和电荷数量不同，可将其分开。

1、电泳法
各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。值得重视的是等电聚焦电泳，这是利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的pH位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白质。

2、离子交换层析法
离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素；CM-纤维素）和阴离子交换剂（二乙氨基乙基纤维素；DEAE?FONT FACE="宋体" LANG="ZH-CN">纤维素），当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。（详见层析技术章）

（四）根据配体特异性的分离方法－亲和色谱法

亲和层析法（aflinity chromatography）是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体(Ligand）的分子能特异而非共价地结合。其基本原理：蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质，因此蛋白质的分离（Separation），提纯（Purification）
和鉴定（Characterization）是生物化学中的重要的一部分，至今还没的单独或一套现成的方法能移把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来，因此往往采取几种方法联合使用。

细胞的破碎

1、高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。

2、玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。

3、超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。对超声波敏感和核酸应慎用。

4、反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

5、化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好。

无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酥活力，但不是全部，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。

浓缩、干燥及保存

一、样品的浓缩

生物大分子在制备过程中由于过柱纯化而样品变得很稀，为了保存和鉴定的目的，往往需要进行浓缩。常用的浓缩方法的：
1、减压加温蒸发浓缩
通过降低液面压力使液体沸点降低，减压的真空度愈高，液体沸点降得愈低，蒸发愈快，此法适用于一些不耐热的生物大分子的浓缩。
2、空气流动蒸发浓缩 空气的流动可使液体加速蒸发,铺成薄层的溶液，表面不断通过空气流；或将生物大分子溶液装入透析袋内置于冷室，用电扇对准吹风，使透过膜外的溶剂不沁蒸发，而达到浓缩目的，此法浓缩速度慢，不适于大量溶液的浓缩。
3、冰冻法 生物大分子在低温结成冰，盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相中，操作时先将待浓缩的溶液冷却使之变成固体，然后缓慢地融解，利用溶剂与溶质融点介点的差别而达到除去大部分溶剂的目的。如蛋白质和酶的盐溶液用此法浓缩时，不含蛋白质和酶的纯冰结晶浮于液面，蛋白质和酶则集中于下层溶液中，移去上层冰块，可得蛋白质和酶的浓缩液。
4、吸收法 通过吸收剂直接收除去溶液中溶液分子使之浓缩。所用的吸收剂必需与溶液不起化学反应，对生物大分子不吸附，易与溶液分开。常用的吸收剂有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝胶等，使用聚乙二醇吸收剂时，先将生物大分子溶液装入半透膜的袋里，外加聚乙二醇复盖置于4度下，袋内溶剂渗出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水饱和后要更换新的直至达到所需要的体积。
5、超滤法 超滤法是使用一种特别的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法，不液体在一定压力下（氮气压或真空泵压）通过膜时，溶剂和小分子透过，大分子受阻保留，这是近年来发展起来的新方法，最适于生物大分子尤其是蛋白质和酶的浓缩或脱盐，并具有成本低，操作方便，条件温和，能较好地保持生物大分子的活性，回收率高等优点。应用超滤法关键在于膜的选择，不同类型和规格的膜，水的流速，分子量截止值（即大体上能被膜保留分子最小分子量值）等参数均不同，必须根据工作需要来选用。另外，超滤装置形式，溶质成份及性质、溶液浓度等都对超滤效果的一定影响。Diaflo 超滤膜的分子量截留值：

膜名称
分子量截留值
孔的大的平均直径

XM－300
300，000
140

XM－200
100，000
55

XM－50
50，000
30

PM－30
30，000
22

UM－20
20，000
18

PM－10
10，000
15

UM－2
1，000
12

UM05
500
10

用上面的超滤膜制成空心的纤维管，将很多根这样的管拢成一束，管的两端与低离子强度的缓冲液相连，使缓冲液不断地在管中流动。然后将纤维管浸入待透析的蛋白质溶液中。当缓冲液流过纤维管时，则小分子很易透过膜而扩散，大分子则不能。这就是纤维过滤秀析法，由于透析面积增大，因而使透析时间缩短10倍。

二、干燥

生物大分子制备得到产品，为防止变质，易于保存，常需要干燥处理，最常用的方法是冷冻干燥和真空干燥。真空干燥适用于不耐高温，易于氧化物质的干燥和保存，整个装置包括干燥器、冷凝器及真空干燥原理外，同时增加了温度因素。在相同压力下，水蒸汽压随温度下降而下降，故在低温低压下，冰很易升华为气体。操作时一般先将待干燥的液体冷冻到冰点以下使之变成固体，然后在低温低压下将溶剂变成气体而除去。此法干后的产品具有疏松、溶解度好、保持天然结构等优点，适用于各类生物大分子的干燥保存。

三、贮存

生物大分子的稳定性与保存方法的很大关系。干燥的制品一般比较稳定，在低温情况下其活性可在数日甚至数年无明显变化，贮藏要求简单，只要将干燥的样品置于干燥器内（内装有干燥剂）密封，保持0－4度冰箱即可，液态贮藏时应注意以下几点。
1、样品不能太稀，必须浓缩到一定浓度才能封装贮藏，样品太稀易使生物大分子变性。
2、一般需加入防腐剂和稳定剂，常用的防腐剂有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。蛋白质和酶常用的稳定剂有硫酸铵糊、蔗糖、甘油等，如酶也可加入底物和辅酶以提高其稳定性。此外，钙、锌、硼酸等溶液对某些酶也有一定保护作用。核酸大分子一般保存在氯化钠或柠檬酸钠的标准缓冲液中。
3、贮藏温度要求低，大多数在0度左右冰箱保存，有的则要求更低，应视不同物质而定。

8. 试述酶的分离纯化和纯度鉴定的实验方法及其原理。

分离蛋白质混合物的各种方法主要是根据蛋白质在溶液中的以下性质：1）分子大小；2）溶解度；3）电荷；4）吸附性质；5）对其它分子的生物学亲和力等进行分离. 常见的分离提纯蛋白质的方法有：1、盐析与有机溶剂沉淀：在蛋白质溶液中加入大量中性盐,以破坏蛋白质的胶体性质,使蛋白质从溶液中沉淀析出,称为盐析.常用的中性盐有：硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等.盐析时,溶液的pH在蛋白质的等电点处效果最好.凡能与水以任意比例混合的有机溶剂,如乙醇、甲醇、丙酮等,均可引起蛋白质沉淀.2、电泳法：蛋白质分子在高于或低于其pI的溶液中带净的负或正电荷,因此在电场中可以移动.电泳迁移率的大小主要取决于蛋白质分子所带电荷量以及分子大小.3、透析法：利用透析袋膜的超滤性质,可将大分子物质与小分子物质分离开.4、层析法：利用混合物中各组分理化性质的差异,在相互接触的两相（固定相与流动相）之间的分布不同而进行分离.主要有离子交换层析,凝胶层析,吸附层析及亲和层析等,其中凝胶层析可用于测定蛋白质的分子量.5、分子筛：又称凝胶过滤法,蛋白质溶液加于柱之顶部,任其往下渗漏,小分子蛋白质进入孔内,因而在柱中滞留时间较长,大分子蛋白质不能进入孔内而径直流出,因此不同大小的蛋白质得以分离.6、超速离心：利用物质密度的不同,经超速离心后,分布于不同的液层而分离.超速离心也可用来测定蛋白质的分子量,蛋白质的分子量与其沉降系数S成正比.

9. 如何将酶从细胞中分离

植物细胞有坚韧的细胞壁，需要强烈的方法去破碎，少量样品可用研钵加石英砂研磨，或用玻璃匀浆器。大量样品则需用电动匀浆器。为减低研磨或匀浆过程中发热，所用器皿和溶液需要预冷，提取液的用量一般为组织的1梍5倍，用量大些有利于提高得率，但工作量大，一般宁可用量小些，将残渣再提取一次。提取匀浆时加入酚类结合剂PVPP，金属螯合剂 Na2─EDTA，以及─SH化合物以保护蛋白质，或加入非离子型去垢剂如Triton X─100，以增加蛋白质的可溶度，常用于与膜脂结合的酶。总之，可以通过试验以确定提取蛋白质的最佳条件。

10. 酶进行提纯的方法是什么

酶，从动植物细胞和微生物中提取之后，往往不能直接应用，这是因为生物在合成酶的同时也合成其他大分子物质。而这些大分子物质会严重干扰酶的作用，因此必须把酶从中分离出来。如果酶不纯，那么极有可能在应用中形成几个生化反应同时进行，结果得到的产物也就不是单一的。当然，酶并不是越纯越好。不同的生物化学反应，对酶的纯度要求也不一样。因此，要把酶制成不同的酶制剂，以便适应各种需求。

要对酶进行分离和提纯，有多种方法。当酶从生物细胞以及微生物中产生之后，可能留在细胞内，也可能分泌到细胞外面。如果是胞外酶，这就方便多了，只要收集微生物和细胞的培养液进行分离和提纯就可以了。如果酶在细胞内(称胞内酶)，则必须研碎细胞，才能把酶提取出来。不论是胞外酶还是胞内酶，都可能会含有一些其他大分子物质，如核酸、蛋白质和淀粉之类的东西。

对付核酸，只要在酶溶液中加入核酸酶，就可以去掉核酸。对于淀粉也比较好办。最难对付的是蛋白质，因为酶也是蛋白质，能破坏蛋白质的方法也可以破坏酶，所以提纯是件比较困难的事。但随着现代科学技术的不断进步，经过研究，已找到沉淀法、分子过滤法等。采用以上提纯方法，就可以得到不同纯度的酶，这为酶的广泛应用打开了方便之门。