体外抑菌试验常用方法有哪两类

A. 抑菌试验的介绍

用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长效力的试验称为抑菌试验。通过抑菌实验，可以测定一个药物的最低抑菌浓度，用以评价该药物的抑菌性能，这是抗菌药物的最基本的药效学数据。主要方法有进行定性测定的扩散法（如抑菌斑试验）和进行定量测定的稀释法（如最低抑菌浓度实验）。

B. 药物体外抗菌试验(k-b法)的培养其为

敏试验的结果受到诸多因素的影响，如培养基、试纸片以及菌液的浓度等。
1、培养基
细菌敏试验所用的培养基种类较多，多数情况下，采用WHO组织统一要求的M-H培养基，这种培养基中含有的低胸腺嘧啶是与磺胺类物竞争的物质，因此进行的敏试验效果较好。此外，还有适量的Ca2+、Mg2+，在培养基中起到触媒的作用。但是，有些细菌对培养基中的成分有特殊的要求，特殊的菌要用特殊的培养基才能进行敏试验。例如，流感嗜血杆菌的敏试验培养基用HTM琼脂；淋球菌的敏试验培养基用加5％羊血的巧克力M-H琼脂；肺炎链球菌的敏实验用M-H琼脂加5％的脱纤维羊血培养基。培养基中还有适量的Ca2+、Mg2+，在培养基中起到溶酶的作用，其含量的变化，可影响氨基糖苷类和四环素对铜绿假单胞菌的试验结果，含量过高，抑菌圈会变小，含量过低，抑菌圈会大得不可接受。
细菌敏试验的培养基厚度大约为4mm，若培养基厚度大于4mm，会使细菌出现耐；若小于4mm，本应耐的易出现敏感。所以，试验时一定不要把敏纸片放在中央部位，而应均匀地排布在平皿周围的培养基上。制作敏试验的培养基用水，主要是Ca2+、Mg2+等矿物质离子，也在很大程度上影响着敏试验的结果。
2、试纸片
试纸片材质的好坏，对物稳定性和活性有很大影响。加工敏试纸片的试纸一般是使用加厚型的滤纸，杂质少，对物保存无太大影响。然而，临床中很多用的是普通纸，被水浸润后会呈碱性，并且含有大量无机离子，因此使用普通纸加工的试纸片物有较大的影响。敏纸片的PH值一般要求为中性，这样才适合的活度。敏纸片的厚度要求大约1mm，这样才有利于细菌的生长和物的扩散速度。敏纸片的直径在6.00～6.35mm之间，纸片的厚度和直径大小都会影响敏试验的结果。
含纸片的片间差和质量好坏是做敏试验的关键。一些敏纸片买来时就有抑菌环偏大或偏小的问题，纸片之间又存在很大的片间差。因此，纸片在用前必须检验其片间差和准确度，只有都达到标准要求后才能使用。同时要注意纸片的保存，因为有的纸片，如青霉素类，在保存中因为受潮湿环境的影响容易降低其物的活性。因此，纸片应放低温下(-10℃)保存，同时要避免潮湿，以保持抗菌物的活性。盛纸片小瓶自低温处取出应在室温平衡至少10min后再打开，避免冷凝水影响效。
3、细菌
由于各种菌对物的敏感性不同，产生的抑菌环大小不同，如果菌种不纯，试验中所产生的抑菌环大小与该菌种在纯培养状态下产生的抑菌环大小存在较大的差异，影响判断结果的准确性。因此需要对各种致病菌提纯后，分别进行不同的敏试验。敏试验时，需要将提纯后的菌种配制成一定浓度的菌液。WHO组织制定的标准是要求菌液浓度在1．5亿/ml左右。若菌液浓度过高，该菌会对所有物产生耐；反之，菌液浓度过低，该菌会对所有物均敏感。最精确的方法是使用分光光度计测定新鲜培养物菌悬液的吸光度，来确定菌液浓度。国家细菌耐性监测网的三级甲等，其微生物实验室大多数用此法来确定敏试验的菌液浓度。
敏试验中要将菌液均匀地涂在培养基上，使细菌均匀分布，这样才能使试验结果不会出现较大的偏差。涂菌后15min才能贴敏纸片。由于涂菌后，细菌要有一段时间的适应过程，但是时间不能过长，否则会使细菌产生耐。贴敏纸片时，每取一种敏纸片必须烧一下镊子口，避免敏纸片之间相互混淆，以提高敏的准确性。物杀灭细菌存在一定的量比，敏试验培养基上细菌层越厚抑菌圈就越小，反之抑菌圈就越大。根据一种物抑菌圈的有无或者大小，只能判断出该对细菌有没有效果，但其敏感性的高低需要通过科学严谨的实验来确定。物的敏感程度需要根据敏试验的结果，并结合以上因素做综合分析，才能得出科学的结论，而片面地根据敏圈的大小来决定敏感与否，结果不够准确。
综上所述，造成敏试验的结果可能与实际效果不符，对敏试验要具体情况进行相应的分析，再根据物的代谢过程和原理综合论证，敏试验的指导意义还是很大的。而且上述因素并不是在我们临床做敏试验过程中都能遇到，对此，我们需要认真执行标准化的试验方法，认真执行CLSI质控要求，做好室内质控与室间质评，以提高试验的准确性。严格控制敏试验用培养基和敏纸片，做到保证质量。

C. 何谓抑菌试验主要包括哪些实验方法

抑菌试验用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长的效力。
实验方法主要有进行定性测定的纸片扩散法、定量测定的稀释法和E试验法。

D. 何谓抑菌试验主要包括哪些实验方法

抑菌试验用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长的效力。实验方法主要有进行定性测定的纸片扩散法、定量测定的稀释法和E试验法。

E. 何谓抑菌试验主要包括哪些实验方法

用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长效力的试验称为抑菌试验。通过抑菌实验，可以测定一个药物的最低抑菌浓度，用以评价该药物的抑菌性能，这是抗菌药物的最基本的药效学数据。主要方法有进行定性测定的扩散法（如抑菌斑试验）和进行定量测定的稀释法（如最低抑菌浓度实验）。

F. 抑菌试验的常用方法

A、抗菌药物贮存液制备
1.1.1.抗菌药物贮存液制备 抗菌药物贮存液浓度不应低于1000μg/ml(如1280μg/ml)或10倍于最高测定浓度。溶解度低的抗菌药物可稍低于上述浓度。抗菌药物直接购自厂商或相关机构。所需抗菌药物溶液量或粉剂量可公式进行计算。例如：需配制100 ml浓度为1280μg/ml的抗生素贮存液，所用抗生素为粉剂，其药物的有效力为750μg/mg。用分析天平精确称取抗生素粉剂的量为182.6 mg。根据公式计算所需稀释剂用量为：（182.6 mg×750μg/ml）/1280μg/ml=107.0ml，然后将182.6 mg抗生素粉剂溶解于107.0ml稀释剂中。制备抗菌药物贮存液所用的溶剂和稀释剂见表5。配制好的抗菌药物贮存液应贮存于-60℃以下环境，保存期不超过6个月。
B、药敏试验用抗菌药物浓度范围
1.1.2.药敏试验用抗菌药物浓度范围 根据NCCLS抗菌药物敏感性试验操作标准，药物浓度范围应包含耐药、中介和敏感分界点值，特殊情况例外。
C、培养基
1.1.3. 培养基 NCCLS推荐使用Mueller-Hinton（MH）肉汤，pH7.2~7.4。需氧菌及兼性厌氧菌在此培养基中生长良好。在测试葡萄球菌对苯唑西林的敏感性时，应在肉汤中加入2%（W/V）氯化钠，按制造厂家的要求配制需要量的MH肉汤。嗜血杆菌属菌使用HTM肉汤，肺炎链球菌和其它链球菌使用含2%~5%溶解马血的MH肉汤。
D、接种物的制备
1.1.4.接种物的制备 有2种方法配制接种物，一是细菌生长方法，用接种环挑取形态相似待检菌落3-5个，接种于4-5ml的水解酪蛋白（MH）肉汤中，35℃孵育2-6h。增菌后的对数生长期菌液用生理盐水或MH肉汤校正浓度至0.5麦氏比浊标准，约含1~2×108CFU/ml。二是直接菌落悬液配制法，对某些苛养菌，如流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌和链球菌及甲氧西林耐药的葡萄球菌等菌株，推荐直接取培养18~24h的菌落调配成0.5麦氏比浊标准的菌悬液。用MH肉汤将上述菌悬液进行1∶100稀释后备用。注意应在15分钟内接种完配制好的接种物，并取一份接种物在非选择性琼脂平板上传代培养，以检查接种物纯度。
注：在临床微生物学检验中，麦氏比浊法常用于细菌鉴定、药敏实验前配置菌液时大致判断菌液浓度的一种方法，通常认为，如将配菌液浓度配成0.5麦氏比浊管时，相当于1.5×108细菌数/ml，由于方法本身就是一种估计的方法，所以尽管不同细菌大小差异很大，除了真菌孢子，细菌的差别不大，结果不会有影响。但是，标准比浊管的浓度，是药敏实验结果的影响因素之一。
E、附：0.5麦氏比浊管配制方法
0.048M BaCL2 (1.17% W/V BaCL2 . 2H2O) 0.5ml
0.36N H2SO4 (1%, V/V) 99.5ml
将二液混合，置螺口试管中，放室温暗处保存。用前混匀。
有效期为6个月。
F、稀释抗菌药物的制备及菌液接种
1.1.5.稀释抗菌药物的制备及菌液接种 取无菌试管（13×100mm）13支，排成一排，除第1管加入1.6mlMH肉汤外，其余每管加入MH肉汤1ml，在第1管加入抗菌药物原液（如1280μg/ml） 0.4ml混匀，然后吸取1ml至第2管，混匀后再吸取1ml至第3管，如此连续倍比稀释至第11管，并从第11管中吸取1ml弃去，第12管为不含药物的生长对照。此时各管药物浓度依次为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml。然后在每管内加入上述制备好的接种物各1ml，使每管最终菌液浓度约为5×105CFU/ml。第1管至第11管药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、05、0.25、0.125μg/ml。
G、孵育
1.1.6.孵育 将接种好的稀释管塞好塞子，置35℃普通空气孵箱中孵育16~20h；嗜血杆菌和链球菌在普通空气孵箱中孵育20~24h；对可能的耐甲氧西林葡萄球菌和耐万古霉素肠球菌应持续孵育满24h。
H、结果判断与解释
1.1.7.结果判断与解释 在读取和报告所测试菌株的MIC前，应检查生长对照管的细菌生长情况是否良好，同时还应检查接种物的传代培养情况以确定其是否污染，质控菌株的MIC值是否处于质控范围。以肉眼观察，药物最低浓度管无细菌生长者，即为受试菌的MIC。甲氧苄胺嘧啶或磺胺药物的肉汤稀释法终点判断，与阳性生长对照管比较抑制80%细菌生长管药物浓度为受试菌MIC。
根据NCCLS推荐的分界点值标准，判断耐药（resistant, R）、敏感(susceptible, S)或中介（intermediate, I）。S表示被测菌株所引起的感染可以用该抗菌药物的常用剂量治疗有效，禁忌症除外。R指该菌不能被抗菌药物的常用剂量在组织液内或血液中所达到的浓度所抑制，或属于具有特定耐药机理（如β-内酰胺酶），所以临床治疗效果不佳。I是指MIC接近药物的血液或组织液浓度，疗效低于敏感菌。还表示被测菌株可以通过提高剂量（如β-内酰胺类药物）被抑制，或在药物生理性浓集的部位（如尿液）被抑制。另外，中介还作为“缓冲域”，以防止由微小的技术因素失控，所导致较大的错误解释。 A、抗菌药物和培养基制备
1.2.1.抗菌药物和培养基制备 同常量肉汤稀释法。
B、MIC板制备
1.2.2.MIC板制备 无菌操作，将倍比稀释后不同浓度的抗菌药物溶液分别加到灭菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第11孔加药液，每孔10μl，第12孔不加药作为生长对照，冰冻干燥后密封，-20℃以下保存备用。
C、接种物制备
1.2.3.接种物制备 将用生长法或直接菌悬液法制备的浓度相当于0.5麦氏比浊标准的菌悬液，经MH肉汤1∶1000稀释后，向每孔中加100μl，密封后置35℃普通空气孵箱中，孵育16~20h判断结果。当试验嗜血杆菌属，链球菌属时，孵育时间为20~24h，试验葡萄球菌和肠球菌对苯唑西林和万古霉素的药敏试验时孵育时间必须满24h。此时，第1孔至第11孔药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/ml。
D、结果判断
1.2.4.结果判断 以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。当阳性对照孔（即不含抗生素）内细菌明显生长试验才有意义。当在微量肉汤稀释法出现单一的跳孔时，应记录抑制细菌生长的最高药物浓度。如出现多处跳孔，则不应报告结果，需重复试验。通常对革兰阴性杆菌而言，微量肉汤稀释法测得的MIC与常量肉汤稀释法测得的结果相同或低一个稀释度（1孔或2倍）。 A、介绍
琼脂稀释法是将不同剂量的抗菌药物，加入融化并冷至50℃左右的定量MH琼脂中，制成含不同递减浓度抗菌药物的平板，接种受试菌，孵育后观察细菌生长情况，以抑制细菌生长的琼脂平板所含最低药物浓度为MIC。本法优点是可在一个平板上同时作多株菌MIC测定，结果可靠，易发现污染菌；缺点是制备含药琼脂平板费时费力。
B、培养基制备
2.1.培养基制备 使用MH琼脂，按商品说明书进行配制，pH7.2~7.4。淋病奈瑟菌使用GC琼脂基础加1%添加剂；其它链球菌使用含5%（V/V）绵羊血的MH琼脂（当试验磺胺药时，使用溶解的马血）。
C、含药琼脂平板制备
2.2.含药琼脂平板制备 根据实验设计，将已倍比稀释的不同浓度的抗菌药物分别加入已加热溶解，并在45~50℃水浴中平衡的MH琼脂中，充分混匀倾倒灭菌平皿，琼脂厚度3~4mm。通常按1∶9比例配制药物琼脂平板，根据需要来选择药物浓度范围。配制好的含药琼脂平板应装入密封塑料袋中，置2~8℃冰箱可贮存5天。
D、接种物制备与接种
2.3.接种物制备与接种 制备浓度相当于0.5麦氏标准比浊管的菌悬液，再1∶10稀释，以多点接种器吸取制备好菌液（约1~2μl）接种于琼脂平板表面，每点菌数约为104CFU，形成直径为5~8mm的菌斑。接种好后置35℃孵育16~20h（甲氧西林耐药葡萄球菌、万古霉素耐药肠球菌孵育时间应满24h），观察结果。奈瑟菌属、链球菌属细菌置5%二氧化碳、幽门螺杆菌置微需氧环境中孵育。
E、结果判断
2.4.结果判断 将平板置于暗色、无反光物体表面上判断试验终点，以抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。在含甲氧苄胺嘧啶或磺胺琼脂平板上可见轻微细菌生长，与生长对照比较抑制80%以上细菌生长的最低药物浓度作为终点浓度。
如果出现有2个以上菌落生长于含药浓度高于终点水平的琼脂平板上，或低浓度药物琼脂平板上不长而高浓度药物琼脂平板上生长现象，则应检查培养物纯度或重复试验。 纸片扩散法(K-B法)又称琼脂扩散法
K-B法药敏试验时接种物配制有两种方法。
第一种是肉汤增菌法（对数生长法），是用接环挑取3-5个细菌菌落入肉汤增菌管中进行增菌4-6小时，然后用生理盐水或肉汤对增菌管中的培养物进行稀释校正使其浓度达到0.5麦氏比浊标准（因为经过增菌培养其培养物浓度一般都高于此标准）。
第二种方法是直接菌落法：从孵育18-24小时的非选择性培养基上，挑取3-5菌落，直接用肉汤或盐制成悬液作为接种，然后将浊度调整至0.5麦氏比浊标准。此法是检测苛养菌（如嗜血杆菌、淋病奈瑟菌和链球菌）和潜在的对甲氧西林耐药的葡萄球菌的推荐方法。
将菌制成菌悬液用无菌棉签蘸取菌液在管壁上挤去多余菌液 ,涂布整个M2H平板表面 ,反复 3 次 ,每次将平板旋转60 度 ,保证涂布均匀 ,35 ℃培养后菌落呈半融合状态 ,否则影响药敏结果。
K-B 法指定用 M-H琼脂平板 ,应用直径90cm平皿 ,在水平的无菌台上倾倒 ,准确量取高压灭菌后的M2H琼脂液25ml ,使之琼脂板厚度为 4mm。否则厚度过高 ,使含药物纸片的药物半球形扩散的体积加大 ,导致假耐药;反之导致假敏感。
要求纸片直径 6.00～6.35mm每片吸水量约012 μl ,纸片的药物含量必须与 K 2B 法规定的
一致 ,用前必须做质量鉴定 ,质量合格方可使用。纸片的保存尤为重要 ,一般要求保存在有干燥剂的容器内低温保存 ,纸片取出后须放室温10min后方可打开 ,否则空气中的水份冷凝在纸片上易潮解 ,使药物失效影响药敏试验结果。 E试验是指浓度梯度琼脂扩散试验，其原理基本同扩散法，即浓度呈连续梯度的抗菌药物从塑料试条中向琼脂中扩散，在试条周围抑菌浓度范围内受试菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。E试验综合了稀释法和扩散法的原理和特点，同时还弥补了二者的一些不足，可以像稀释法一样直接定量测出抗菌药物对受试菌的MIC。
A、培养基、菌液制备和接种
3.1.培养基、菌液制备和接种 同纸片扩散法。
B、贴E试验条
3.2.贴E试验条 同纸片扩散法，E试验条的刻度面朝上，不得贴反，一旦接触琼脂后不得再移动。直径150mm的平皿内可放置6根E试验试条，90mm者一般只能放置1根。
C、孵育时间和温度
3.3.孵育时间和温度 同纸片扩散法。
D、结果阅读
3.4.结果阅读 孵育后围绕试条可形成一个椭圆形的抑菌圈，在抑菌圈和试条的横切相交处试条上的读数刻度即是测定抗菌药物对受试菌的MIC。阅读时应注意的问题见供应商的产品说明书。

G. 何谓抑菌试验主要包括哪些实验方法

抑菌试验即用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长的效力的试验。
实验方法主要有进行定性测定的纸片扩散法、定量测定的稀释法和E试验法。

H. 何谓抑菌试验主要包括哪些实验方法

一、控制变量法

控制变量法是初中物理实验中常用的探索问题和分析解决问题的科学方法之一。所谓控制变量法是指为了研究物理量同影响它的多个因素中的一个因素的关系，可将除了这个因素以外的其它因素人为地控制起来，使其保持不变，再比较、研究该物理量与该因素之间的关系，得出结论，然后再综合起来得出规律的方法。

这种方法在整个初中物理实验中的应用比较普遍。例如在人教版实验教科书《物理》（八年级上册）第一章第一节关于探究声是怎样传播的实验中，就开始渗透控制变量的思想。因为固体、液体和气体都是传声的介质，我们逐一研究它们分别可以传声时，就必须控制其它两个因素。如果在进行该实验时就给学生恰当地点拨，提出：“把两张课桌紧紧地挨在一起，一个同学轻敲桌面，另一个同学把耳朵贴在另一张桌子上，听到的敲击声为什么就能认为是桌子传来而不是空气传来的？”引导学生去分析比较，就能使学生体验到控制变量的思想。在接着的探究影响音调、响度等因素的实验中，把控制变量的思想对学生给予简要的介绍，就会使学生逐步领悟到控制变量法的实质要领，为以后的探究实验作好方法上的准备。

在初中物理中，探究影响导体电阻大小的因素、电流跟电压电阻的关系、影响电热功率大小的因素、影响电磁铁磁性强弱的因素、影响滑动摩擦力大小的因素、决定压力作用效果的因素等等实验，运用了控制变量法。

二、等效替代法

等效替代法是指在研究某一个物理现象和规律中，因实验本身的特殊限制或因实验器材等限制，不可以或很难直接揭示物理本质，而采取与之相似或有共同特征的等效现象来替代的方法。这种方法若运用恰当，不仅能顺利得出结论，而且容易被学生接受和理解。

三、转换法

有的物理量不便于直接测量，有的物理现象不便于直接观察，通过转换为容易测量到与之相等或与之相关联的物理现象，从而获得结论的方法。譬如，在研究电热的功率与电阻关系的实验中，电流通过阻值不等的两根电阻丝产生的热量无法直接观测和比较，而我们通过转换为让煤油吸热，观察煤油温度变化情况，从而推导出那个电阻放热多。教学时不妨设计一问：为什么研究电热的功率与电阻大小的关系时，还用到似乎与实验无关的煤油呢？引发学生的思考和讨论，在小结出该实验中煤油的作用的基础上，进而再问：该实验能否不用煤油而改用其它方式来观察电阻通电后的发热情况？这样促使学生思维得以发散，转换的思维方法得到训练，设计实验的能力也随着提高了。

四、类比法

类比法是一种推理方法。为了把要表达的物理问题说清楚明白，往往用具体的、有形的、人们所熟知的事物来类比要说明的那些抽象的、无形的、陌生的事物，通过借助于一个比较熟悉的对象的某些特征，去理解和掌握另一个有相似性的对象的某些特征。如：在研究电压的作用时，借助于看得见而学生比较熟悉的“水压形成水流”的实验作类比，来揭示电压是形成电流的原因。又比如在研究通电螺线管的磁场的实验中，为准确记忆通电螺线管的北极与电流方向的关系，以紧握的右拳头类比为螺线管，四指为线圈并指向电流的方向，则大拇指所指的一端为北极。这样形象直观很容易被学生理解记忆牢固。
五、图象法

图象是一个数学概念，用来表示一个量随另一个量的变化关系，很直观。由于物理学中经常要研究一个物理量随另一个物理量的变化情况，因此图象在物理中有着广泛的应用。在实验中，运用图象来处理实验数据，探究内在的物理规律，具有独特之处。如：在探究固体熔化时温度的变化规律和水的沸腾情况的实验中，就是运用图象法来处理数据的。它形象直观地表示了物质温度的变化情况，学生在亲历实验自主得出数据的基础上，通过描点、连线绘出图象就能准确地把握住晶体和非晶体的熔化特点、液体的沸腾特点了。

六、理想化方法

理想化方法是指在物理教学中通过想象建立模型和进行实验的一种科学方法。可分为理想化模型和理想化实验。

理想化模型就是指把复杂的问题简单化，把研究对象的一些次要因素舍去，抓住主要因素，对实际问题进行理想化处理去再现原形的本质的东西，构成理想化的物理模型。这是一种重要的物理研究方法。例如探究杠杆平衡条件的实验，杠杆就是一种理想化的模型。杠杆在使用时，由于受到力的作用，都会引起或多或少的形变，然而在研究中把此时的形变忽略不计，这里我们就把杠杆经过理想化的处理，认为它无形变，视为一个硬棒，从而使学生在研究时不被细枝末节的因素影响，顺利地得出杠杆平衡原理。