⑴ 如何让药液浓缩
(1) 常压蒸发:指在一个大气压下进行的蒸发,适用于药液中有效成分耐热,而溶剂不易燃,无毒,无经济价值的情况。
(2) 减压蒸发:指在密闭的容器内,抽去液面上的空气和蒸汽,使溶液沸点降低,从而以比常压下较快地浓缩药液的方法。适用于含热敏性物质药液的浓缩,同时可以回收有机溶 剂。
(3) 薄膜蒸发:指使药液在蒸发时形成薄膜增加气化表面的方法,具有速度快、药液受热时间短、成分不易被破坏等特点,可以在常压或减压下进行,也可回收溶剂重复使用。
浓缩常用装置
实验室用:蒸发皿及水浴锅、常压蒸馏装置、减压蒸馏装置、小型薄膜蒸发仪
影响浓缩的因素
(1) Zkm越大,即加热蒸汽的饱和温度与 溶液沸点之差越大,蒸发应当越快。这一点可
以通过提高加热蒸汽的压力(其饱和温度随之增高)来实现,也可以通过减压降低溶液沸点 来实现。但在实际生产中,这些措施都不能无 极限地使用,因为加热蒸汽温度过高不仅导致 热敏性成分被破坏,也不经济,维持系统低压也不经济,同时可使溶液粘度增加,不利于传 热,影响蒸发。 .
(2) 传热系数:是指热量传递过程的速度,与热量传递的阻力相对而言。一般气体的传热 系数最低,静止的液体传热系数比不断流动的 液体低,粘度大的液体传热系数也低,因此常 采用搅拌及定期除垢的方式加大传热系数,也采用使沸腾液体快速流过加热面(即薄膜蒸 发)的方式来提高传热系数。
(3) 液体的静压:指沸腾液体形成的气泡 从液体内部逸出所要克服的液体的压力
⑵ 常有的蛋白浓缩方法有哪些
蛋白浓缩方法基本有: 丙酮沉淀法;免疫沉淀法;三氯醋酸沉淀法;硫酸铵沉淀法;(低温)有机溶剂沉淀法;聚乙二醇沉淀法;超滤法;透析法;离子交换层析和冷冻干燥法…… 1.丙酮沉淀法;三氯醋酸沉淀法 试验要求的仪器简单,但是常常导致蛋白质变性。 2.免疫沉淀法:得有特异性抗体! 3.硫酸铵沉淀法:利用高浓度盐将蛋白质析出(盐析),选择硫酸按是因为:盐析有效性,pH范围广,溶解度高,溶液散热少,经济! 4.(低温)有机溶剂沉淀法:强调低温(0-4度以下)是因为10度时蛋白会在有机溶剂中变性,可用乙醇,丙酮……注意:Mg2+离子,pH值 5.聚乙二醇沉淀法:使用PEG时旨在个别情况下才会是蛋白质稍有变性!他溶解是散热低,形成沉淀的平衡时间短,通常达到30%时蛋白质就会达到最大量的沉淀! 6.超滤法:主要针对小体积蛋白质溶液(几ml)此法更不易引起变性!不过得有浓缩器,不是哪个实验室都有的! 7.透析法:主要用于更换蛋白质的缓冲液!的有透析袋!不需要特殊的仪器! 8.离子交换层析:可用阴离子交换树脂进行浓缩! 9.冷冻干燥法:在冷冻状态下让扬品种的液体升华 参考网址on http://www.bio1000.com/experiment/biochemical/351804.html
⑶ 浓缩的化学概念
①使溶液中溶剂蒸发溶液浓度增大的过程。广泛应用于化学、食品、生物制药等工业中。
②指物体中使部分含量减少,另一部分含量增加的过程。如浓缩铀等。
③泛指用一定方法减少事物中不需要的部分,从而使需要部分的相对含量增加:浓缩铀|文学要求浓缩,集中,概括,凝练。
④矿粒借助自身的重力从矿浆中沉淀出来的脱水过程。浓密脱水在浓密机中进行。它是一个圆形池子,矿浆从中心给入,矿粒沉降在池子底部,通过耙子作用汇集于中央并从底部排出,澄清水从池子周围溢出。浓密作业的给矿浓度约为20%~30%,底流浓度可达50%~70%。浓密机分周边传动式浓缩机和中心传动式浓缩机。
⑤重力浓缩:利用重力作用的自然沉降分离方式,不需要外加能量,是一种最节能的污泥浓缩方法。重力浓缩只是一种沉降分离工艺,它是通过在沉淀中形成高浓度污泥层达到浓缩污泥的目的,是时下污泥浓缩方法的主体。单独的重力浓缩是在独立的重力浓缩池中完成,工艺简单有效,但停留时间较长时可能产生臭味,而且并非适用于所有的污泥;如果应用于生物除磷剩余污泥浓缩时,会出现磷的大量释放,其上清液需要采用化学法进行除磷处理。重力浓缩法适用于初沉污泥、化学污泥和生物膜污泥。 浓缩方法从原理上讲分为平衡浓缩和非平衡浓缩2种。
平衡浓缩
是利用两相在分配上的某种差异而获得溶质和溶剂分离的方法。蒸发浓缩和冷冻浓缩属于这种方法,其中,蒸发浓缩利用溶剂和溶质挥发度的差异,获得一个有利的气液平衡条件,达到分离目的;冷冻浓缩利用稀溶液与固态冰在凝固点下的平衡关系,即利用有利的液固平衡条件。以上2种浓缩方法都是通过热量的传递来完成的。不论蒸发浓缩还是冷冻浓缩,两相都是直接接触的,故称为平衡浓缩。
非平衡浓缩
是利用固体半透膜来分离溶质与溶剂的过程,两相被膜隔开,分离不靠两相的直接接触,故称为非平衡浓缩,利用半透膜不但可以分离溶质和溶剂,还可以分离各种不同大小的溶质,膜浓缩过程是通过压力差或电位差来完成的。 一、沉淀法
在抽提液中加入适量的中性盐或有机溶剂,使有效成分变为沉淀。经离心除去不溶物,获得的上清液通过透析或凝胶过滤脱盐,即可供纯化使用。
二、吸附法
将干葡聚糖凝胶G25(或吸水棒)加入抽提液中,两者比例为1:5。由于凝胶吸水之故,抽提液的体积可缩小三倍左右,回收蛋白质量约80%.若凝胶(或吸水棒)对有效成分吸附力强或吸水后有效成分的性质有影响时,此法不宜采用。
三、超过滤法
把抽提液装入超过滤装置,在空气或氮气(5.05×105Pa)压力下,使小分子物质(包括水分)通过半透膜(如硝酸纤维素膜),大分子物质留在膜内。
四、透析法
把装抽提液的透析袋埋在吸水力强的聚乙二醇(polyetheylene glycol PEG 分子质量大于20kDa)或甘油中,10ml抽提液可在1h内浓缩到几乎无水的程度。
五、减压蒸馏法
将抽提液装入减压蒸馏器的圆底烧瓶中,在减压真空状态下进行蒸馏。当真空度较高时溶液的沸点可控制在30℃以下。这种方法一般适用于常温下稳定性好的物质。
六、冰冻干燥法
冰冻的抽提液在真空状态下,可以由固体直接变为气体。用此原理进行浓缩,有效成分几乎不会破坏。冻干机主要由低温干燥箱、真空泵和冷冻机构成。在冻干小体积样品时,可以将其置玻璃真空干燥器中进行。具体作法是,把分装至小瓶中的样品冰冻后放入装有五氧化二磷或硅胶吸水剂的真空干燥器中,连续抽真空使其达到浓缩、干燥状态。
上述的浓缩方法(除第五种外),一般都在低温进行。这些方法不仅适用于抽提液的浓缩处理,而且也适用于纯品溶液缩小体积。 食品在浓缩过程中发生的变化对食品品质有较大的影响,因此,在选择浓缩方法时应该充分考虑食品品质的稳定性。浓缩对食品品质的影响主要表现在四个方面:食品成分的变化、黏稠性的增加、容易出现结晶、风味的形成与挥发。
食品物料多由蛋白质、脂肪、糖类、维生素以及其他成分组成,这些物质在食品加热浓缩过程中,由于高温或长时间受热时会受到破坏或发生变性、氧化等作用。如含糖分高的食品在蒸发浓缩过程中温度过高会加速蔗糖的转化,特别是有酸存在的食品中,转化更为严重;在长时间的高温条件下还容易产生焦糖反应,使产品颜色加深。在较长时间的高温条件下蛋白质会发生热变性,食品中的盐、矿物质浓度过高也会使蛋白质部分变性。高温或长时间加热也会加速食品中脂肪的氧化分解,产生不良风味,甚至是有毒有害物质,还会使一些热敏性维生素被破坏。因此,在浓缩食品时应充分考虑加热温度和时间的影响,尽量采用低温短时浓缩,如真空浓缩、膜浓缩、冷冻浓缩等。
随着食品浓度的增加,食品黏稠度会显着增加,流动性下降,尤其是一些含较多蛋白质等胶体成分的食品。黏稠度增加会给食品的输送、加热、干燥等带来不便。 当浓缩食品中某些成分浓度超过饱和浓度时,会形成结晶。如果冻、果酱类食品中糖浓度超过其溶解极限时糖就会结晶出来,形成砂质的糖果冻和果酱;浓缩乳制品中乳糖也易结晶,使产品出现砂质感。
食品在加热浓缩过程中,会产生烧煮味、焦香味等一些风味物质,这对于大多数食品来说,是不希望这种反应产生的。采用低温真空浓缩虽可减少这些物质的产生,但会增加食品中的芳香性风味成分的挥发,影响浓缩食品的风味品质。因此,在相对完善的蒸发浓缩工艺中,通常采取香味回收措施。即从二次蒸汽冷凝中回收风味成分,再添加到浓缩制品中。采用冷冻浓缩和膜浓缩可避免新风味成分的产生和减少食品自身风味成分的损失。因此,常采用低温真空浓缩 。
⑷ 样品的提取和净化是怎样的
1.提取
农药残留样品提取的原则是根据农药理化性质按相似相溶原理进行。
一般而言,极性较小的农药可以用石油醚、正己烷、环己烷等非极性溶剂或与极性溶剂混合的溶剂提取。极性较强的农药可以用极性溶剂或含水极性溶剂,如丙酮、甲醇等。含水较多的植物样品可以用与水能相混溶的极性溶剂,如丙酮、乙腈等。干样或低含水量的样品可以加少量水润湿,再用适当溶剂提取。含水量高的试样可以先加无水硫酸钠,使水溶性较强的农药释放,再用有机溶剂提取。依极性由强到弱顺序排列的常用溶剂:乙酸、水、乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷、二氯甲烷、正己烷、石油醚。
提取的方法一般有组织捣碎法(大部分动植物样品采用捣碎法提取)、振荡浸取法(样品+提取溶剂置振荡器上振荡提取)、消化法(用于动物组织样品)、索氏提取法(提取效率高,但提取时间较长)、超声波提取法、超临界提取法(无需有机溶剂,选择性强,无需净化)。
样品的浓缩一般有吹扫法、减压蒸馏法,但要注意不能把溶剂蒸干。
2.净化
当用溶剂提取样品中残留农药时,会带入若干干扰杂质,如色素、脂肪、蜡质等。所以,要进行样品净化。一般的净化方法有:
(1)液—液分配法。利用待测农药与干扰杂质在两种互不相溶的溶剂中溶解度(分配系数)的差异达到分离净化的目的。采用极性溶剂与非极性溶剂配成溶剂对进行液—液分配。如甲醇—二氯甲烷、甲醇—正己烷(石油醚)、甲醇—三氯甲烷等。
(2)吸附柱层析法。在层析柱中用淋洗剂淋洗,达到分离净化的目的。常用的吸附剂有硅镁型吸附剂(如氟罗里硅土,Florisil)、氧化铝、硅胶、活性炭和硅藻土等。
(3)磺化法。利用浓硫酸与样品提取液中的脂肪、蜡质、色素等杂质中所含烯链的磺化作用,生成强极性物质,从而与非极性农药分离。
(4)凝结剂沉淀法。使用凝结剂将杂质沉淀的净化方法。
3.固相萃取(SPE)
固相萃取的基本原理与开放式柱色谱相同。常用的吸附柱填料有氟罗里硅土、氧化铝和硅胶。由于共萃物的极性,因此一般用不同极性的淋洗液淋洗。氟罗里硅土对亲脂性化合物有特别的吸附作用,因此氟罗里硅土特别适于油性样品的净化,用低极性溶剂洗脱氟罗里硅土柱,非极性农药残留的回收率很高,因此氟罗里硅土是常用的填料。氧化铝可以代替氟罗里硅土,特别是分析某些脂肪含量高的样品,氧化铝可分解某些有机磷酸酯,极性共萃物一般不能从中性和酸性氧化铝中洗脱出来,因此可以在某些分析中代替氟罗里硅土。
4.超临界流体萃取(SFE)
超临界流体萃取是近几年出现的一种特殊分离技术。SFE主要使用超临界状态的CO2作萃取剂,兼有气体的渗透能力和液体的分配作用。流出液中的CO2在常压下挥发,待测物用溶剂溶解后进行分析。SFE可以通过调节淋洗液的极性来提高萃取的选择性,以萃取不同物化性质的残留农药。SFE是近几年才发展起来的,很多实验参数和条件还有待进一步优化和明确。萃取液的压力、温度已能很好的控制,但其他一些问题,如细胞组织的萃取、萃取液通过细胞时的速度、滞留时间、样品物质的干扰等还需要进一步的研究。
5.基质固相分散(MSPD)
MSPD是1989年由美国Louisiana州立大学的Barker教授首次提出并给予理论解释的一种崭新的SPE技术。其基本操作是将试样直接与适量反相填料(C18和C14)研磨、混匀制成半固态装柱淋洗。MSPD浓缩了传统的样品前处理中所需的样品匀化、组织细胞裂解、提取、净化等过程,避免了样品均化、转溶、乳化、浓缩等造成的待测物损失。经MSPD柱后的淋洗液可直接通过Florisil柱进一步净化,植物样品中的极性有机物如叶绿素、甘油三酯等被Florisil吸附。最后的流出液可直接进色谱分析。MSPD自1989年提出之后,已在农药残留分析中得到广泛应用,显示了MSPD良好的通用性和发展潜力。MSPD是简单高效的提取净化方法,适用各种分子结构和极性农药残留的提取净化。MSPD首先提高了分析速度,使现场监测成为可能,其次减少了试剂的用量。另外,MSPD更适于自动化分析。
⑸ 常用的溶剂提取法有哪几种各有什么特点
浸渍法:浸渍法是将原料用适当的溶剂在常温或温热条件下浸泡出有效成分的一种方法。具体做法是: 取适量粉碎后的原料,置于加盖容器中,加入适量的溶剂并密盖,间断式搅拌或震摇,浸渍至规定时间使有效成分浸出。取上清夜,过滤,压榨残渣,合并滤液和压榨液, 过滤浓缩至适宜浓度, 可进一步制备流浸膏, 浸膏,片剂,冲剂等。 按提取温度和浸渍的次数可分为冷浸溃法,热浸溃法,重浸溃法。
渗漉法:渗漉法是将原料粗粉湿润膨胀后装入渗波器内,顶部用纱布覆盖,压紧,浸提溶剂连续地从渗涟器的上部加入, 溶剂渗过原料层往下流动过程中将与有效成分浸出的一种办法。 不断加入新溶剂, 可以连续收集浸提液, 由于原料不断与新溶剂或含有低浓度提取物的溶剂接触, 始终保持一定的浓度差, 浸提效果要比浸溃法高,提取比较完全,但溶剂用量大。渗滚法可分为单渗漉法,重渗漉法,加压渗漉法,逆渗漉法。
煎煮法:煎煮法是指用水作溶剂,将被提物加热煮沸一定时间,以提取其所含成分的一种常用方法, 又称煮提法或煎浸法。 该法是将原料适当的切碎或粉碎成粗粉放入适当容器中,加水浸过原料面,充分浸泡后,加热煎煮2一3 次,每次l h左右。直火加热,要不断搅拌以免焦糊。分离并收集各次煎出液,经离心分离或沉滤过后,浓缩至所需浓度。该法使用于有效成分能溶于水, 对湿,热均稳定且不易挥发的原料。
回流提取法: 回流提取法是用乙醇等易挥发的有机溶剂提取原料成分,将浸出液加热蒸馏,其中挥发性溶剂馏出后又被冷却,重复流回浸出容器中浸提原料, 这样周而复始,直至有效成分回流提取完全的方法。 回流法提取液在蒸发锅中受热时间较长,故不使用于受热易破坏的原料成分的浸出。
连续提取法:为了弥补回流提取法中需要溶剂量大,操作较繁的不足,可采用连续提取法。当提取的有效成分在所选溶剂中不宜溶解时, 若采用回流提取需提十几次, 既费时又过多耗费溶剂,在此情况下,可用连续回流提取法,用较少的溶剂一次提取便可提取完全。
⑹ 蒸馏法、过滤法、沉淀法的适用范围和所起作用
1.蒸馏法一般用于体系溶剂较多,且较易除去时(大部分为稀溶液)。有时溶剂沸点较高,但是也用此法,这时用减压蒸馏。用于回收溶剂,或者得到浓缩的溶液
2.过滤法一般用于有较多固体颗粒,过滤除去杂质、或者得到固体产品
3.沉淀法用于除去杂质离子,如除去加入硝酸银氯离子,加入氯化钡除去硫酸根离子等。也用于离子的检验。
⑺ 浓缩就是精华什么意思
就是指事物最精华的部分都集中在一个地方了,其他部分就显得很突出成为不好的部分了。精华也有精神元气的含义。语出汉 刘向《九叹·惜贤》:“扬精华以炫燿兮,芳郁渥而纯美。”
(7)有机溶剂常用的浓缩方法是扩展阅读:
1、指事物之最精粹、最优秀的部分。
汉 刘向《九叹·惜贤》:“扬精华以炫燿兮,芳郁渥而纯美。”
北齐 颜之推《颜氏家训·文章》:“自古执笔为文者,何可胜言。然至于宏丽精华,不过数十篇耳。”
明 赵振元《为袁氏祭袁石寓(袁可立子)宪副》:“以故《九丘》、《八索》,淹为精华。”
清 李渔《闲情偶寄·词曲上·词采》:“无论其他,即汤若士 《还魂》一剧,世以配飨元人,宜也。问其精华所在,则以《惊梦》、《寻梦》二折对。”
毛泽东《新民主主义论》十五:“剔除其封建性的糟粕,吸收其民主性的精华。”
2、指精神元气。
汉 王充《论衡·书虚》:“﹝颜渊﹞彊力自极,精华竭尽,故早夭死。”
南朝 陈 徐陵《梁禅陈策文》:“精华既竭,耄勤已倦,则抗首而笑,惟贤是与。”
清 魏源《圣武记》卷十四:“鸦片耗中国之精华,岁千亿计,此漏不塞,虽万物为金,阴阳为炭,不能供尾闾之壑。”
3、犹光辉。
南朝 梁 江淹《效阮公诗》之八:“仲冬正惨切,日月少精华。”
明 冯惟敏《醉花阴·仰高亭中自寿》曲:“咫尺内青山翠岛,见放着日月精华龙虎朝,转头来游玩了。”
《红楼梦》第四九回:“精华欲掩料应难,影自娟娟魄自寒。”
⑻ 如何利用透析法进行脱盐浓缩蛋白
二、蛋白质的分离纯化
蛋白质的分离纯化方法很多,主要有:
(一)根据蛋白质溶解度不同的分离方法
1、蛋白质的盐析
中性盐对蛋白质的溶解度有显着影响,一般在低盐浓度下随着盐浓度升高,蛋白质的溶解度增加,此称盐溶;当盐浓度继续升高时,蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出,这种现象称盐析,将大量盐加到蛋白质溶液中,高浓度的盐离子(如硫酸铵的SO4和NH4)有很强的水化力,可夺取蛋白质分子的水化层,使之“失水”,于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同,故盐析所需的盐浓度也不一样,因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。
影响盐析的因素有:(1)温度:除对温度敏感的蛋白质在低温(4度)操作外,一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质(如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白)在较高的温度(25度)比0度时溶解度低,更容易盐析。(2)pH值:大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。(3)蛋白质浓度:蛋白质浓度高时,欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来(共沉现象)。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释,使蛋白质含量在2.5-3.0%。
蛋白质盐析常用的中性盐,主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。
其中应用最多的硫酸铵,它的优点是温度系数小而溶解度大(25度时饱和溶液为4.1M,即767克/升;0度时饱和溶解度为3.9M,即676克/升),在这一溶解度范围内,许多蛋白质和酶都可以盐析出来;另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好,不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的pH常在4.5-5.5之间,当用其他pH值进行盐析时,需用硫酸或氨水调节。
蛋白质在用盐析沉淀分离后,需要将蛋白质中的盐除去,常用的办法是透析,即把蛋白质溶液装入秀析袋内(常用的是玻璃纸),用缓冲液进行透析,并不断的更换缓冲液,因透析所需时间较长,所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶G-25或G-50过柱的办法除盐,所用的时间就比较短。
2、等电点沉淀法
蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小,因而溶解度也最小,各种蛋白质的等电点有差别,可利用调节溶液的pH达到某一蛋白质的等电点使之沉淀,但此法很少单独使用,可与盐析法结合用。
3、低温有机溶剂沉淀法
用与水可混溶的有机溶剂,甲醇,乙醇或丙酮,可使多数蛋白质溶解度降低并析出,此法分辨力比盐析高,但蛋白质较易变性,应在低温下进行。
(二)根据蛋白质分子大小的差别的分离方法
1、透析与超滤
透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。
超滤法是利用高压力或离心力,强使水和其他小的溶质分子通过半透膜,而蛋白质留在膜上,可选择不同孔径的泸膜截留不同分子量的蛋白质。
2、凝胶过滤法
也称分子排阻层析或分子筛层析,这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶(Sephadex
ged)和琼脂糖凝胶(agarose gel)。
(三)根据蛋白质带电性质进行分离
蛋白质在不同pH环境中带电性质和电荷数量不同,可将其分开。
1、电泳法
各种蛋白质在同一pH条件下,因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。值得重视的是等电聚焦电泳,这是利用一种两性电解质作为载体,电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度,当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时,到达各自等电点的pH位置就停止,此法可用于分析和制备各种蛋白质。
2、离子交换层析法
离子交换剂有阳离子交换剂(如:羧甲基纤维素;CM-纤维素)和阴离子交换剂(二乙氨基乙基纤维素;DEAE?FONT
FACE="宋体"
LANG="ZH-CN">纤维素),当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时,带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上,随后用改变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。(详见层析技术章)
(四)根据配体特异性的分离方法-亲和色谱法
亲和层析法(aflinity
chromatography)是分离蛋白质的一种极为有效的方法,它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来,而且纯度很高。这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体(Ligand)的分子能特异而非共价地结合。其基本原理:蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在,每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质,因此蛋白质的分离(Separation),提纯(Purification)
和鉴定(Characterization)是生物化学中的重要的一部分,至今还没的单独或一套现成的方法能移把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来,因此往往采取几种方法联合使用。
细胞的破碎
1、高速组织捣碎:将材料配成稀糊状液,放置于筒内约1/3体积,盖紧筒盖,将调速器先拨至最慢处,开动开关后,逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。
2、玻璃匀浆器匀浆:先将剪碎的组织置于管中,再套入研杆来回研磨,上下移动,即可将细胞研碎,此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高,适用于量少和动物脏器组织。
3、超声波处理法:用一定功率的超声波处理细胞悬液,使细胞急剧震荡破裂,此法多适用于微生物材料,用大肠杆菌制备各种酶,常选用50-100毫克菌体/毫升浓度,在1KG至10KG频率下处理10-15分钟,此法的缺点是在处理过程会产生大量的热,应采取相应降温措施。对超声波敏感和核酸应慎用。
4、反复冻融法:将细胞在-20度以下冰冻,室温融解,反复几次,由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀,使细胞结构破碎。
5、化学处理法:有些动物细胞,例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠(SDS)、去氧胆酸钠等细胞膜破坏,细菌细胞壁较厚,可采用溶菌酶处理效果更好。
无论用哪一种方法破碎组织细胞,都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中,使大分子生物降解,导致天然物质量的减少,加入二异丙基氟磷酸(DFP)可以抑制或减慢自溶作用;加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性,加入苯甲磺酰氟化物(PMSF)也能清除蛋白水解酥活力,但不是全部,还可通过选择pH、温度或离子强度等,使这些条件都要适合于目的物质的提取。
浓缩、干燥及保存
一、样品的浓缩
生物大分子在制备过程中由于过柱纯化而样品变得很稀,为了保存和鉴定的目的,往往需要进行浓缩。常用的浓缩方法的:
1、减压加温蒸发浓缩
通过降低液面压力使液体沸点降低,减压的真空度愈高,液体沸点降得愈低,蒸发愈快,此法适用于一些不耐热的生物大分子的浓缩。
2、空气流动蒸发浓缩
空气的流动可使液体加速蒸发,铺成薄层的溶液,表面不断通过空气流;或将生物大分子溶液装入透析袋内置于冷室,用电扇对准吹风,使透过膜外的溶剂不沁蒸发,而达到浓缩目的,此法浓缩速度慢,不适于大量溶液的浓缩。
3、冰冻法
生物大分子在低温结成冰,盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相中,操作时先将待浓缩的溶液冷却使之变成固体,然后缓慢地融解,利用溶剂与溶质融点介点的差别而达到除去大部分溶剂的目的。如蛋白质和酶的盐溶液用此法浓缩时,不含蛋白质和酶的纯冰结晶浮于液面,蛋白质和酶则集中于下层溶液中,移去上层冰块,可得蛋白质和酶的浓缩液。
4、吸收法
通过吸收剂直接收除去溶液中溶液分子使之浓缩。所用的吸收剂必需与溶液不起化学反应,对生物大分子不吸附,易与溶液分开。常用的吸收剂有聚乙二醇,聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝胶等,使用聚乙二醇吸收剂时,先将生物大分子溶液装入半透膜的袋里,外加聚乙二醇复盖置于4度下,袋内溶剂渗出即被聚乙二醇迅速吸去,聚乙二醇被水饱和后要更换新的直至达到所需要的体积。
5、超滤法
超滤法是使用一种特别的薄膜对溶液中各种溶质分子进行选择性过滤的方法,不液体在一定压力下(氮气压或真空泵压)通过膜时,溶剂和小分子透过,大分子受阻保留,这是近年来发展起来的新方法,最适于生物大分子尤其是蛋白质和酶的浓缩或脱盐,并具有成本低,操作方便,条件温和,能较好地保持生物大分子的活性,回收率高等优点。应用超滤法关键在于膜的选择,不同类型和规格的膜,水的流速,分子量截止值(即大体上能被膜保留分子最小分子量值)等参数均不同,必须根据工作需要来选用。另外,超滤装置形式,溶质成份及性质、溶液浓度等都对超滤效果的一定影响。Diaflo
超滤膜的分子量截留值:
膜名称分子量截留值孔的大的平均直径
XM-300300,000140
XM-200100,00055
XM-5050,00030
PM-30 30,00022
UM-2020,00018
PM-1010,00015
UM-21,00012
UM05500 10
用上面的超滤膜制成空心的纤维管,将很多根这样的管拢成一束,管的两端与低离子强度的缓冲液相连,使缓冲液不断地在管中流动。然后将纤维管浸入待透析的蛋白质溶液中。当缓冲液流过纤维管时,则小分子很易透过膜而扩散,大分子则不能。这就是纤维过滤秀析法,由于透析面积增大,因而使透析时间缩短10倍。
⑼ 常用的浓缩方法有哪些
常用的浓缩方法就是加热蒸发法,使水分蒸发,使溶液浓缩