1. 诱变育种有几种方法,
诱变育种
开放分类: 生物、自然科学、生物学、变异、遗传
在人为的条件下,利用物理,化学等因素,诱发生物产生突变,从中选择,培育成动植物和微生物的新品种.
诱变育种是指用物理、化学因素诱导植物的遗传特性发生变异,再从变异群体中选择符合人们某种要求的单株,进而培育成新的品种或种质的育种方法。它是继选择育种和杂交育种之后发展起来的一项现代育种技术。
诱发突变的物理因素主要指某些射线,如α射线、β射线、γ射线、X射线和中子流等;化学诱变剂主要指某些亚硝酸盐、烷化剂,碱基类似物,抗生素等化学药物。 物理诱变方法应用于植物始干1928年。 L.J·斯德勒首先证实了X射线对玉米和大麦有诱变效应。1930年和1924年H.尼尔逊·爱尔和D.托伦纳分别用辐射诱变技术获得了有实用价值的大麦突变体和烟草突变体。化学诱变剂在植物上的应用一般认为始于1943年,当时F·约克斯用马来糖(脲烷)诱发了月见草、百合和风铃草的染色体畸变。这些早期工作为确立诱变育种的地位奠定了基础。
通过近几十年的研究人们对诱变原理的认识也逐步加深。 我们知道,常规助杂交育种基本上是染色体的重新组合,这种技术一般并不引起染色体发生变异,更难以触及到基因。而辐射的作用则不同,它们有的是与细胞中的原子、分子发生冲撞、造成电离或激发;有的则是以能量形式产生光电吸收或光电效应;还有的能引起细胞内的一系列理化过程。这些都会对细胞产生不同程度的伤害。对染色体的数目、结构等都会产生影响,使有的染色体断裂了;有的丢失了一段,有的断裂后在“自我修复”的过程中头尾接倒了或是“张冠李戴”分别造成染色体的倒位和易位。当然射线也可作用在染色体核苷酸分子的碱塞上,从而使基因(遗传密码)发生突变。至于化学诱变,有的药剂是用其烷基置换其它分子中的 氢原子,也有的本身是核苷酸碱基的类似物,它可以“鱼目混珠”,造成DNA复制中的错误。无疑这些都会使植物的基因发生突变。 理、化因索的诱导作用;使得植物细胞的突变率比平时高出千百倍,有些变异是其它手段难以得到的。当然,所产生的变异绝大多数不能遗传,所以,辐射后的早代一般不急 于选择。
但是,可遗传的好性状一经获得便可育成品种或种质资源。 据世界原子能机构1985年统计,当时世界各国通过诱变已育成500多个品种,还有大量有价值的种质资源o 我国的 诱变育种同样成绩斐然,在过去的几十年中,经诱变育成的 品种数一直占到同期育成品种总数的10%左右。如水稻品种 原丰早,小麦品种山农辐63,还有玉米的鲁原单4号、大豆的铁丰18、棉花的鲁棉I号等都是通过诱变育成的。 当然与其它技术一样,诱变育种也有自身的弱点:一是诱变产生的有益突变体频率低;二是还难以有效地控制变异 的方向和性质;另外,诱发并鉴定出数量性状的微突变比较困难。因此,诱变育种应该与其它技术相结合,同时谋求技术上的自我完善。
2. 诱导基因突变的常用方法
诱导基因突变的常用方法:
一、碱基置换突变
可以通过两个途径即碱基结构类似物的参入和诱变剂或射线引起的化学变化来进行。
①类似物的参入5-溴尿嘧啶(BU)是胸腺嘧啶的结构类似物。它只是在第5位碳原子上以溴原子代替了胸腺嘧啶的甲基(─GH3),并且因此更易以烯醇式出现(图2)。基因突变
大肠杆菌在含有BU的培养基中培养后,细菌的 DNA中的一部分胸腺嘧啶被BU所取代,并且最后在培养物中可以发现有少数突变型细菌出现,取代BU的量愈大则突变型愈多。突变型细菌在不含有BU的培养基中长久培养时,不改变它的突变型性状,可是把突变型细菌在含有BU的培养基中培养后,又可以发现少数由于发生回复突变而出现的野生型细菌。BU的诱变作用可以表示。首先在DNA复制过程中酮式的BU代替了胸腺嘧啶T而使A:T碱基对变为A:BU,在下一次DNA复制中烯醇式的BU*和鸟嘌呤G配对而出现G∶BU碱基对,最后在又一次复制中鸟嘌呤G和胞嘧啶C配对而终于出现G:C碱基对,完成了碱基的置换。这里BU所起的作用是促成这一置换,起促成作用的原因是由于嘧啶的 5位上溴原子代替了甲基后便较多地出现烯醇式的嘧啶。
同一理论还可以用来说明 BU是怎样诱发 的置换突变或者突变型的回复突变(图4)
2-氨基嘌呤等其他碱基结构类似物同样具有诱变作用。
②药物或射线引起的化学变化亚硝酸能够作用于腺嘌呤(A)的氨基而使它变为次黄嘌呤(HX);可以作用于胞嘧啶(c)而使它变为尿嘧啶(U)。这两种氨基到酮基的变化带来碱基配对关系的改变,从而通过 DNA复制而造成A∶T→G∶C或者 G∶C→A∶T置换。
羟胺只和胞嘧啶发生专一性的反应,所以它几乎只诱发置换G∶C→A∶T而不诱发A∶T→G∶C置换。此外,pH值低或高温都可以促使DNA分子失去碱基特别是嘌呤,导致碱基置换。
紫外线的照射使 DNA分子上邻接的碱基形成二聚体,主要是胸腺嘧啶二聚体T-T。二聚体的形成使DNA双链呈现不正常的构型(见DNA损伤修复),从而带来致死效应或者导致基因突变,其中包括多种类型的碱基置换。
二、移码突变
诱发移码突变的诱变剂种类较少,主要是吖啶类染料(图6)。这些染料分子能够嵌入DNA分子中,从而使DNA复制发生差错而造成移码突变。
三、定向诱变
利用重组DNA技术使DNA分子在指定位置上发生特定的变化,从而收到定向的诱变效果。例如将DNA分子用某一种限制性核酸内切酶处理,再用分解DNA单链的核酸酶S1处理,以去除两个粘性末端的单链部分,然后用噬菌体T4连接酶将两个平头末端连接起来,这样就可得到缺失了相应于这一限制性内切酶的识别位点的几个核苷酸的突变型。相反地,如果在四种脱氧核苷三磷酸(dNTP)存在的情况下加入 DNA多聚酶Ⅰ,那么进行互补合成的结果就得到多了相应几个核苷酸的两个平头末端。在T4接连酶的处理下,便可以在同一位置上得到几个核苷酸发生重复的突变型。
在指定的位置上也可以定向地诱发置换突变。诱变剂亚硫酸氢钠能够使胞嘧啶脱氨基而成为尿嘧啶,但是这种作用只限于 DNA单链上的胞嘧啶而对于双链上的胞嘧啶则无效。用识别位点中包含一个胞嘧啶的限制性内切酶处理DNA分子,使粘性末端中的胞嘧啶得以暴露(例如HindⅢ的识别位点是,经限制酶HindⅢ处理后得到粘性末端,中间的这一胞嘧啶便暴露了)。经亚硫酸氢钠处理后胞嘧啶(c)变为尿嘧啶(U)。通过DNA复制原来的碱基对C∶G便转变成为 T∶A。这样一个指定位置的碱基置换突变便被诱发。
还可以把人工合成的低聚核苷酸片段引入基因组中,以一定的方式改变某一基因等。
3. 人工诱变的常用方法是
人工诱变的常用方法
1. 物理法:射线(紫外线、X光线、Y射线,中子线),激光微束,离子束,微波,超声波,热力等。
2. 化学诱变法:浸渍法、涂抹法、滴液法、注射法、施入法和熏蒸法。
化学诱变剂:碱基类似物、烷化剂,移码诱变剂,硫酸二乙酯(DFS)、5-溴尿嘧 啶(5-BU)、氮芥(Nm)、N'广甲基N'亚硝基胍(NTG)。
3. 生物法:空间条件处理诱变,病原微生物诱变,转基因诱变。
人工诱变
在人为的条件下,利用物理、化学等因素,诱发生物产生突变,从中选择、培育动植物和微生物的新品种。诱变育种是指用物理、化学因素诱导植物的遗传特性发生变异,再从变异群体中选择符合人们某种要求的单株,进而培育成新的品种或种质的育种方法。它是继选择育种和杂交育种之后发展起来的一项现代育种技术。
我们知道,常规助杂交育种基本上是染色体的重新组合,这种技术一般并不引起染色体发生变异,更难以触及到基因。而辐射的作用则不同,它们有的是与细胞中的原子、分子发生冲撞、造成电离或激发;有的则是以能量形式产生光电吸收或光电效应;还有的能引起细胞内的一系列理化过程。这些都会对细胞产生不同程度的伤害。对染色体的数目、结构等都会产生影响,使有的染色体断裂了;有的丢失了一段,有的断裂后在“自我修复”的过程中头尾接倒了或是“张冠李戴”分别造成染色体的倒位和易位。当然射线也可作用在染色体核苷酸分子的碱塞上,从而使基因(遗传密码)发生突变。至于化学诱变,有的药剂是用其烷基置换其它分子中的氢原子,也有的本身是核苷酸碱基的类似物,它可以“鱼目混珠”,造成DNA复制中的错误。无疑这些都会使植物的基因发生突变。理、化因索的诱导作用;使得植物细胞的突变率比平时高出千百倍,有些变异是其它手段难以得到的。当然,所产生的变异绝大多数不能遗传,所以,辐射后的早代一般不急于选择。
物理诱变
应用较多的是辐射诱变,即用α射线、β射线、γ射线、Χ射线、中子和其他粒子、紫外辐射以及微波辐射等物理因素诱发变异。当通过辐射将能量传递到生物体内时,生物体内各种分子便产生电离和激发,接着产生许多化学性质十分活跃的自由原子或自由基团。它们继续相互反应,并与其周围物质特别是大分子核酸和蛋白质反应,引起分子结构的改变。由此又影响到细胞内的一些生化过程,如 DNA合成的中止、各种酶活性的改变等,使各部分结构进一步深刻变化,其中尤其重要的是染色体损伤。由于染色体断裂和重接而产生的染色体结构和数目的变异即染色体突变,而DNA分子结构中碱基的变化则造成基因突变。那些带有染色体突变或基因突变的细胞,经过细胞世代将变异了的遗传物质传至性细胞或无性繁殖器官,即可产生生物体的遗传变异。
化学诱变
化学诱变除能引起基因突变外,还具有和辐射相类似的生物学效应,如引起染色体断裂等,常用于处理迟发突变,并对某特定的基因或核酸有选择性作用。
化学诱变剂:主要指某些烷化剂,碱基类似物,抗生素等化学药物。化学诱变剂在植物上的应用一般认为始于1943年,当时F·约克斯用马来糖(脲烷)诱发了月见草、百合和风铃草的染色体畸变。这些早期工作为确立诱变育种的地位奠定了基础。
化学诱变剂
(一)、烷化剂
烷化剂是栽培作物诱发突变的最重要的一类诱变剂。药剂带有一个或多个活泼的烷基。通过烷基置换,取代其它分子的氢原子称为"烷化作用"所以这类物质称烷化剂。
烷化剂分为以下几类:
1. 烷基磺酸盐和烷基硫酸盐
代表药剂:甲基磺酸乙酯(EMS)、硫酸二乙酯(DES)
2. 亚硝基烷基化合物
代表药剂:亚硝基乙基脲(NEH)、N-亚硝基-N-乙基脲烷(NEU)
3. 次乙胺和环氧乙烷类
代表药剂:乙烯亚胺(EI)
4. 芥子气类
氮芥类、硫芥类
烷化剂的作用机制--烷化作用重点是核酸,导致DNA断裂、缺失或修补。
(二)、核酸碱基类似物
这类化合物具有与DNA碱基类似的结构。
代表药剂:
5-溴尿嘧啶(BU)、5-溴去氧尿核苷(BudR) 为胸腺嘧啶(T)的类似物
2-氨基嘌呤(AP) 为腺嘌呤(A)的类似物
马来酰肼(MH) 为尿嘧啶(U)的异构体
作用机制:作为DNA的成份而渗入到DNA分子中去,使DNA复制时发生配对错误,从而引起有机体变异。
(三)、其它诱变剂
亚硝酸 能使嘌呤或嘧啶脱氨,改变核酸结构和性质,造成DNA复制紊乱。HNO2还能造成DNA双链间的交联而引起遗传效应。
叠氮化钠(NaN3) 是一种呼吸抑制剂,能引起基因突变,可获得较高的突变频率,而且无残毒。
提醒:有些化学诱变剂是有剧毒的。
4. 诱变育种一般采用什么方法
答案A
用射线或激光照射属于诱变育种,花药离体培养属于单倍体育种,秋水仙素处理萌发的种子属于多倍体育种,人工杂交属于杂交育种.
5. 人工诱变的化学方法
人工诱变育种的理论基础是基因突变,常用的方法有物理方法,如用X射线、γ射线、紫外线、激光等处理;化学方法如用亚硝酸和硫酸二乙酯等处理.
故答案为:
基因突变 X射线 γ射线 紫外线 激光 亚硝酸 硫酸二乙酯
6. 多倍体育种的诱变方法
人工诱变染色体加倍的方法很多,可分为物理诱变法、化学诱变法和生物诱变法。
物理法包括:机械损伤、高低温和射线照射等
生物学诱导途径包括:不同倍性材料间杂交育种,胚乳培养,细胞杂交等
化学诱变。主要利用化学诱变剂与细胞发生一系列生化反应阻止有丝分裂的正常进行,使分裂后期的染色体全部进入一个子代细胞中而产生多倍体。化学药剂包括秋水仙素、萘乙烷、异生长素、N-亚硝基-N-二甲脲、吲哚乙酸、氨磺灵、戊炔草胺、六氯化苯、三氯乙醛、氯化亚汞、富民隆等微管抑制剂。
7. 诱变育种的方法
物理、化学诱变的方法及其机理如下述。 应用较多的是辐射诱变,即用α射线、β射线、γ射线、Χ射线、中子和其他粒子、紫外辐射以及微波辐射等物理因素诱发变异。当通过辐射将能量传递到生物体内时,生物体内各种分子便产生电离和激发,接着产生许多化学性质十分活跃的自由原子或自由基团 。它们继续相互反应,并与其周围物质特别是大分子核酸和蛋白质反应,引起分子结构的改变。由此又影响到细胞内的一些生化过程,如 DNA合成的中止、各种酶活性的改变等,使各部分结构进一步深刻变化,其中尤其重要的是染色体损伤。由于染色体断裂和重接而产生的染色体结构和数目的变异即染色体突变,而DNA分子结构中碱基的变化则造成基因突变。那些带有染色体突变或基因突变的细胞,经过细胞世代将变异了的遗传物质传至性细胞或无性繁殖器官,即可产生生物体的遗传变异。
诱变处理的材料宜选用综合性状优良而只有个别缺点的品种、品系或杂种。由于材料的遗传背景和对诱变因素的反应不同,出现有益突变的难易各异,因此进行诱变处理的材料要适当多样化。由于不同科、属、种及不同品种植物的辐射敏感性不同,其对诱变因素反应的强弱和快慢也各异。如十字花科白菜的敏感性小于禾本科的水稻、大麦,而水稻、大麦的敏感性又小于豆科的大豆。另外,辐射敏感性的大小还同植物的倍数性、发育阶段、生理状态和不同的器官组织等有关。如二倍体植物大于多倍体植物,大粒种子大于小粒种子,幼龄植株大于老龄植株,萌动种子大于休眠种子,性细胞大于体细胞等。根据诱变因素的特点和作物对诱变因素敏感性的大小,在正确选用处理材料的基础上,选择适宜的诱变剂量是诱变育种取得成效的关键(表 1)。适宜诱变剂量是指能够最有效地诱发作物产生有益突变的剂量,一般用半致死剂量(LD50)表示。不同诱变因素采用不同的剂量单位。Χ、γ射线线吸收剂量以拉德(rad)或戈瑞(GY)为单位,照射剂量以伦琴(R)为单位,中子用注量表示。同时要注意单位时间的照射剂量(剂量率、注量率)以及处理的时间和条件。
辐照方法分外照射和内照射两种,前者指被照射的植物接受来自外部的γ射线源、Χ射线源或中子源等辐射源辐照,这种方法简便安全,可进行大量处理。后者指将放射性物质(如32P、35S等)引入植物体内进行辐照,此法容易造成污染,需要防护条件,而且被吸收的剂量也难以精确测定。干种子因便于大量处理和便于运输、贮藏,用于辐照最为简便。 化学诱变除能引起基因突变外,还具有和辐射相类似的生物学效应,如引起染色体断裂等,常用于处理迟发突变,并对某特定的基因或核酸有选择性作用。化学诱变剂主要有:①烷化剂。这类物质含有1个或多个活跃的烷基,能转移到电子密度较高的分子中去,置换其他分子中的氢原子而使碱基改变。常用的有甲基磺酸乙酯(EMS)、乙烯亚胺(EI)、亚硝基乙基脲烷(NEU)、亚硝基甲基脲烷(NMU)、硫酸二乙酯(DES)等。②核酸碱基类似物。为一类与DNA碱基相类似的化合物。渗入DNA后,可使DNA复制发生配对上的错误。常用的有5-溴尿嘧啶(BU)、5-溴去氧尿核苷(BudR)等。③抗生素。如重氮丝氨酸、丝裂毒素C等,具有破坏DNA和核酸的能力,从而可造成染色体断裂。
化学诱变主要用于处理种子,其次为处理植株。种子处理时,先在水中浸泡一定时间,或以干种子直接浸在一定浓度的诱变剂溶液中处理一定时间,水洗后立即播种,或先将种子干燥、贮藏,以后播种。植株处理时,简单的方法是在茎秆上切一浅口,用脱脂棉把诱变剂溶液引入植物体,也可对需要处理的器官进行注射或涂抹。应用的化学诱变剂浓度要适当(表 2)。处理时间以使受处理的器官、组织完成水合作用和能被诱变剂所浸透为度。化学诱变剂大都是潜在的致癌物质,使用时必须谨慎。
8. 求:人工诱变的常用方法及特点!!
在人为的条件下,利用物理,化学等因素,诱发生物产生突变,从中选择,培育成动植物和微生物的新品种.诱变育种是指用物理、化学因素诱导植物的遗传特性发生变异,再从变异群体中选择符合人们某种要求的单株,进而培育成新的品种或种质的育种方法。它是继选择育种和杂交育种之后发展起来的一项现代育种技术。
我们知道,常规助杂交育种基本上是染色体的重新组合,这种技术一般并不引起染色体发生变异,更难以触及到基因。而辐射的作用则不同,它们有的是与细胞中的原子、分子发生冲撞、造成电离或激发;有的则是以能量形式产生光电吸收或光电效应;还有的能引起细胞内的一系列理化过程。这些都会对细胞产生不同程度的伤害。对染色体的数目、结构等都会产生影响,使有的染色体断裂了;有的丢失了一段,有的断裂后在“自我修复”的过程中头尾接倒了或是“张冠李戴”分别造成染色体的倒位和易位。当然射线也可作用在染色体核苷酸分子的碱塞上,从而使基因(遗传密码)发生突变。至于化学诱变,有的药剂是用其烷基置换其它分子中的氢原子,也有的本身是核苷酸碱基的类似物,它可以“鱼目混珠”,造成DNA复制中的错误。无疑这些都会使植物的基因发生突变。理、化因索的诱导作用;使得植物细胞的突变率比平时高出千百倍,有些变异是其它手段难以得到的。当然,所产生的变异绝大多数不能遗传,所以,辐射后的早代一般不急于选择。
物理诱变
应用较多的是辐射诱变,即用α射线、β射线、γ射线、Χ射线、中子和其他粒子、紫外辐射以及微波辐射等物理因素诱发变异。当通过辐射将能量传递到生物体内时,生物体内各种分子便产生电离和激发,接着产生许多化学性质十分活跃的自由原子或自由基团。它们继续相互反应,并与其周围物质特别是大分子核酸和蛋白质反应,引起分子结构的改变。由此又影响到细胞内的一些生化过程,如 DNA合成的中止、各种酶活性的改变等,使各部分结构进一步深刻变化,其中尤其重要的是染色体损伤。由于染色体断裂和重接而产生的染色体结构和数目的变异即染色体突变,而DNA分子结构中碱基的变化则造成基因突变。那些带有染色体突变或基因突变的细胞,经过细胞世代将变异了的遗传物质传至性细胞或无性繁殖器官,即可产生生物体的遗传变异。
化学诱变
化学诱变除能引起基因突变外,还具有和辐射相类似的生物学效应,如引起染色体断裂等,常用于处理迟发突变,并对某特定的基因或核酸有选择性作用。
化学诱变剂主要指某些烷化剂,碱基类似物,抗生素等化学药物。化学诱变剂在植物上的应用一般认为始于1943年,当时F·约克斯用马来糖(脲烷)诱发了月见草、百合和风铃草的染色体畸变。这些早期工作为确立诱变育种的地位奠定了基础。
化学诱变剂
(一)烷化剂
烷化剂是栽培作物诱发突变的最重要的一类诱变剂。药剂带有一个或多个活泼的烷基。通过烷基置换,取代其它分子的氢原子称为"烷化作用"所以这类物质称烷化剂。
烷化剂分为以下几类:
1. 烷基磺酸盐和烷基硫酸盐
代表药剂:甲基磺酸乙酯(EMS)、硫酸二乙酯(DES)
2. 亚硝基烷基化合物
代表药剂:亚硝基乙基脲(NEH)、N-亚硝基-N-乙基脲烷(NEU)
3. 次乙胺和环氧乙烷类
代表药剂:乙烯亚胺(EI)
4. 芥子气类
氮芥类、硫芥类
烷化剂的作用机制--烷化作用重点是核酸,导致DNA断裂、缺失或修补。
(二)核酸碱基类似物
这类化合物具有与DNA碱基类似的结构。
代表药剂:
5-溴尿嘧啶(BU)、5-溴去氧尿核苷(BudR) 为胸腺嘧啶(T)的类似物
2-氨基嘌呤(AP) 为腺嘌呤(A)的类似物
马来酰肼(MH) 为尿嘧啶(U)的异构体
作用机制:作为DNA的成份而渗入到DNA分子中去,使DNA复制时发生配对错误,从而引起有机体变异。
(三)其它诱变剂
亚硝酸 能使嘌呤或嘧啶脱氨,改变核酸结构和性质,造成DNA复制紊乱。HNO2还能造成DNA双链间的交联而引起遗传效应。
叠氮化钠(NaN3) 是一种呼吸抑制剂,能引起基因突变,可获得较高的突变频率,而且无残毒。
提醒:有些化学诱变剂是有剧毒的。
9. 简述诱变育种的操作方法和步骤!
一、实验目的和内容目的:以紫外线诱变获得用于酱油生产的高产蛋白酶菌株为例,学习微生物诱变育种的基本操作方法。内容:1.对米曲霉(Aspergillsoryzae)出发菌株进行处理,制备孢子悬液。2.用紫外线进行诱变处理。3.用平板透明圈法进行两次初筛。4.用摇瓶法进行复筛及酶活性测定。二、实验材料和用具米曲霉斜面菌种;豆饼斜面培养基、酪素培养基、蒸馏水、0.5%酪蛋白;三角瓶(300mL、500mL)、试管、培养皿(9cm)、恒温摇床、恒温培养箱、紫外照射箱、磁力搅拌器、脱脂棉、无菌漏斗、玻璃珠、移液管、涂布器、酒精灯。三、操作步骤(一)出发菌株的选择及菌悬液制备1.出发菌株的选择可直接选用生产酱油的米曲霉菌株,或选用高产蛋白酶的米曲霉菌株。2.菌悬液制备取出发菌株转接至豆饼斜面培养基中,30℃培养3~5d活化。然后孢子洗至装有1mL0.lmol/LpH6.0的无菌磷酸缓冲液的三角瓶中(内装玻璃珠,装量以大致铺满瓶底为宜),30℃振荡30min,用垫有脱脂棉的灭菌漏斗过滤,制成把子悬液,调其浓度为106~108个/mL,冷冻保藏备用。(二)诱变处理用物理方法或化学方法,所用诱变剂种类及剂量的选择可视具体情况决定,有时还可采用复合处理,可获得更好的结果。本实验学习用紫外线照射的诱变方法。1.紫外线处理打开紫外灯(30W)预热20min。取5mL菌悬液放在无菌的培养皿(9cm)中,同时制作5份。逐一操作,将培养皿平放在离紫外灯30cm(垂直距离)处的磁力搅拌器上,照射lmin后打开培养皿盖,开始照射,与照射处理开始的同时打开磁力搅拌器进行搅拌,即时计算时间,照射时间分别为15s、30s、lmin、2min、5min。照射后,诱变菌液在黑暗冷冻中保存1~2h然后在红灯下稀释涂菌进行初筛。2.稀释菌悬液按10倍稀释至10-6,从10-5和10-6中各取出0.lmL加入到酪素培养基平板中(每个稀释度均做3个重复),然后涂菌并静置,待菌液渗入培养基后倒置,于30℃恒温培养2~3d。(三)优良菌株的筛选1.初筛首先观察在菌落周围出现的透明圈大小,并测量其菌落直径与透明圈直径之比,选择其比值大且菌落直径也大的菌落40~50个,作为复筛菌株。2.平板复筛分别倒酪素培养基平板,在每个平皿的背面用红笔划线分区,从圆心划线至周边分成8等份,1~7份中点种初筛菌株,第8份点种原始菌株,作为对照。培养48h后即可见生长,若出现明显的透明圈,即可按初筛方法检测,获得数株二次优良菌株,进大摇瓶复筛阶段。3.摇瓶复筛将初筛出的菌株,接入米曲霉复筛培养基中进行培养,其方法是,称取麦秩85g,豆饼粉(或面粉)15g,加水95~110mL(称为润水),水含量以手捏后指缝有水而不下滴为宜,于500mL三角瓶中装入15~20g(料厚为1~1.5cm),121℃湿热灭菌30min,然后分别接入以上初筛获得的优良菌株,30℃培养,24h后摇瓶一次并均匀铺开,再培养24~48h,共培养3~5d后检测蛋白酶活性。4.蛋白酶的测定方法(1)取样:培养后随机称取以上摇瓶培养物1g,加蒸馏水100mL,(或200mL),40℃水浴,浸酶1h,取上清浸液测定酶活性。另取lg培养物于105℃烘干测定含水量。(2)酶活性测定:30℃pH7.5条件下水解酪蛋白(底物为0.5%酪蛋白),每分钟产酪氨酸1μg为一个酶活力单位。计算公式为:(A样品OD680nm值-A对照OD680nm值)×K×V/t×NK:标准曲线中光吸收为“1”时的酪氨酸微克数;V:酶促反应的总体积;t:酶促反应时间(min);N:酶的稀释倍数。5.谷氨酸的检测此项检测也是酱油优良菌株的重要指标之一。检测培养基:豆饼粉:麸夫=6:4,润水75%,121℃湿热灭菌30min。谷氨酸测定:于以上培养基中加入7%盐水(W/V),40~45℃水浴,水解9d后过滤,以滤液检测谷氨酸含量(测压法)。四、注意事项1.紫外线照射时注意保护眼睛和皮肤。2.诱变过程及诱变后的稀释操作均在红灯下进行,并在黑暗中培养。五、实验报告1.试列表说明高产蛋白酶菌株的筛选过程和结果。2.你认为以上的筛选方法有什么优缺点,如何改进?六、问题和思考1.试述紫外线诱变的作用机理及其在具体操作中应注意的问题。2.为什么在诱变前要把菌悬液打散和培养一段时间?注:筛选菌株数的计算若按突变率为0.01计算,则一次筛选可取250—300个菌落,第一次筛选后可多选几株高产株,而二级筛选为重点阶段,其最适量可参考以下计算方法:如初筛菌株数为200株,二次筛选欲选株数为2株,则二级应选(200×2)1/2,为20株,这样的数量选择,使有可能从较少的数量中获得相对较多的优良菌株。
10. 诱变育种的基本步骤有哪些关键是什么何故
诱变育种步骤主要包括诱变和筛选,其中诱变过程包括:出发菌株的选择、单孢子或单细胞悬浮液的制备、诱变剂及诱变剂量的选择、诱变处理等。
诱变育种(mutation breeding)在人为的条件下,利用物理、化学等因素,诱发生物体产生突变,从中选择,培育成动植物和微生物的新品种。
(10)常用诱变方法扩展阅读:
诱变育种方法:
1、物理诱变
应用较多的是辐射诱变,即用α射线、β射线、γ射线、Χ射线、中子和其他粒子、紫外辐射以及微波辐射等物理因素诱发变异。当通过辐射将能量传递到生物体内时,生物体内各种分子便产生电离和激发,接着产生许多化学性质十分活跃的自由原子或自由基团[1]。
2、化学诱变
化学诱变除能引起基因突变外,还具有和辐射相类似的生物学效应,如引起染色体断裂等,常用于处理迟发突变,并对某特定的基因或核酸有选择性作用。化学诱变主要用于处理种子,其次为处理植株。