检测贝类毒素最常用的方法

① 软骨藻酸的检测方法

该法是根据美国公职化学家协会（AOAC）所标定的麻痹性贝中毒（PSP）的小鼠生物分析法加以变化的，是最早用于DA检测的一种经典方法。其原理是将毒素注射入小白鼠体内，根据注射后小鼠的存活时间和中毒症状来评价毒性，一般用半致死剂量表示。1987 年该方法首次应用于加拿大DA 中毒事件中DA 的测定，结果显示该方法适于检测贝类组织中高浓度的DA（高于30μg/g），DA 浓度较低时无法检测（低于20μg/g）。
该法更加注重研究DA的毒性效应和毒理研究。这是一般其他方法无法取代的，而且采用小白鼠生物检测法可以检测一些未知的毒性物质，通过半数致死剂量来评价该物质的毒性效应，因此小白鼠生物检测法在各个国家仍有很广泛的应用。但是，该方法的检出限较高，适用于检测贝类组织中高浓度的DA（300-1000μg/g），不适用于DA含量低于20μg/g组织的检测。
小白鼠生物检测法方法检测周期大于24h，特异性较差，干扰因素较多，样品处理为粗略提取，样品批次单一。小白鼠生物检测法检测DA是最早使用的一种方法，但是其试验结果受外部影响因素较为复杂，试验结果与小白鼠的品系和试验者本身操作有很大关系，并且小白鼠生物检测法一般要有至少1d的检测周期，该方法的检出限较低。此外，小白鼠生物法仅能测定毒性的大小，无法确定毒素的组成和各成分的含量。小白鼠生物检测法最大的局限性是小鼠本身造成结果的高变异性和低敏感性，而且对鼠种的要求较高。 高效液相色谱法（HPLC）是检测DA应用最广的方法，已被多国列为国家标准方法，中国国家标准中规定使用反相高效液相色谱法检测海产双壳类贝肉、贝柱、外套膜及其制品（不包括盐渍制品）中的DA含量，该方法检测限为1μg。生物分析法注重的是样品毒性的分析，其专一性和灵敏度低，而高效液相色谱法则能灵敏、快速、准确地确定各种毒素成分，被广泛用于研究和确认实验。HPLC检测DA是利用其在242nm处具有最大吸收值的特征使用紫外或二极管检测器进行检测，或者将DA衍生后通过荧光检测器进行分析，或使用质谱进行检测。高效液相色谱的检测器有紫外检测器、荧光检测器和质谱检测器，由于贝类提取液中干扰组分复杂，光度检测往往不能提供化合物的充分结构信息，因此会引起假阳性的结果。高效液相色谱法检出限低，方法成熟，但仪器昂贵、笨重，一次只能测定一个样品，不适合快速现场检测。对设备条件要求较高，也不能大量用于基层的日常监测工作。
软骨藻酸HPLC曲线参考文献。
DA-HPLC检测DA的方法主要有两大类，一种方法是贝类样品被提取后，经浓缩纯化后进行HPLC配紫外检测器（HPLC-UVD）分析。由于DA在242nm的紫外光谱区有最大吸收峰，因此反相高效液相色谱（RP-HPLC）-UV可有效而快速地对样品进行分离和检测，其基本原理是使用酸性流动相以抑制羧基的电离作用，并选用C18键合硅胶柱分离DA及其衍生物。HPLC-UVD法特别适用于分析贝类组织内的DA含量，其检测限在10-80ng/ml之间，且依提取和提纯方法的不同而异，如粗提取物未经提纯，其检测限约为1μg/g，适用于毒素含量超过20μg/g的检测。水中DA的检测与样品量及藻类的含量和种类等因素有关。另一种方法是针对海水和硅藻中DA进行的甲氧基芴甲酸（9-fluorenylmethyloxycarbonyl，FMOC）衍生化/HPLC配荧光检测器（HPLC-FLD）法，该法在DA分子上引进了荧光基团而使FLD检测的灵敏度提高，对海水中DA的检测限为1.5pg/ml。Hummert等提出了柱切换系统，它能有效降低提取物中的干扰，直接分析粗提的样品，省去了复杂的样品预处理过程。流动相的配比影响DA的保留时间，随着流动相中乙腈比例的减小，DA保留时间增加，DA色谱峰对称性增强，DA与DAC′5非对映异构体分离度增大。中国报道用RP-HPLC-UVD测定贝类中DA，经甲醇:水（1：1）溶液提取，强阴离子（stronganion exchange，SAX）固相萃取柱净化，C18反相色谱柱分离，流动相为乙腈:水（13：87），242nm波长下检测，最低检出限为0.2μg/g，在1.0-25.0μg/ml范围内有良好的线性关系，平均回收率为（97.23±2.43）%。流动相采用甲醇:水（22：78，pH2），最低检出限为10ng（1.0μg/ml），检测范围50-250ng（5-25μg/ml），DA的回收率可达（99.9±2.4）%。另有报道流动相为甲醇:乙腈:三氟乙酸（80：20：0.1），最低检出限为10ng（1.0μg/ml），在1-40μg/ml范围内线性关系良好。
高效液相色谱-紫外检测法（HPLC-UV）特别适用于贝类组织中DA含量的测定，尤其适用于毒素含量超过20μg/g的情况。Lawrence等人建立[以及Quilliam等改进的HPLC-UV法采用了反相C18柱在242nm处检测DA，该方法已被英国、爱尔兰等国定为标准方法。后来，又有一些研究人员对此方法进行了改进。López-Rivera等建立了一种不需要固相萃取预处理检测DA的HPLC-UV法，通过等梯度淋洗以及控制流动相pH来分离化合物，结果表明，最佳pH为2.5，方法检测限为25ng/mL。该方法快速、灵敏，能成功检测大批量贝类样品。HPLC-UV法已经被很多研究人员用来检测贝类等动物组织中的DA含量。Costa等用HPLC-UV法检测了葡萄牙海岸的两种章鱼E.cirrhosa和E.moschata体内DA的含量，结果表明，DA含量超过了100μg/g，其中，E.moschata体内毒素含量更高，表明DA可能通过食物链由这种章鱼体内进入更高级消费者如人类体内，潜在危险性更大。中国对DA的检测大多采用HPLC-UV法，张一兵等在借鉴国外方法的基础上应用高效液相色谱-紫外可见检测法（HPLC-UVD）进一步优化了DA的高效液相色谱-紫外检测法，选定pH2的甲醇/水=22∶78（V/V）为流动相，LC-SAX作为浓缩纯化柱，检出限为10ng，回收率达到92%-94%。陈西平等采用该方法检测了部分水及水生动物中DA的含量，回收率达到70%-93%，检出限为10ng。结果表明，虽然在海水及地面淡水中未检出DA，但部分海洋贝壳动物体内有检出。因此，随着海洋污染的加剧，现阶段中国的DA污染问题不容忽视，应加强对其污染状况的监测。
高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）联用技术可以不使用衍生试剂和毒素标准品，相比其他检测器，具有很大的优势。然而本方法对设备条件要求较高。Lawrence等建立的高效液相色谱-电喷雾离子阱质谱法（HPLC/ESI-MS）法是一种高灵敏度、高选择性的方法，被应用到了环境中各种介质的检测中，并被后人不断改进，但是这种方法对样品预处理的要求较高。宋琍琍等参考了这种方法来测定DA残留。样品经50%甲醇提取，LC-SAX 柱净化，然后选用电喷雾离子源进行测定分析，该方法的定量限为0.02μg/g。Pardo等采用加压湿法萃取（PLE）来提取DA，然后用液相色谱-电喷雾电离双质谱（HPLC-ESI-MS-MS）法来检测DA，电离源采用电喷雾可以提高分析信号，方法经过优化后回收率在81%至95%之间，他们用此方法成功检测了46个西班牙超市里的贝类样品，表明该方法能进行大批量检测。Wang 等采用LC-MS 对水样和浮游植物中的DA 进行了定性和定量分析，样品预处理采用C18柱进行固相萃取，结果表明，酸性条件有利于在C18 柱上保留亲水性的DA，加标水样的回收率超过了90%，浮游植物样品的回收率则接近98%，方法检测限为0.03ng/mL。Iglesia等也采用LC-MS法检测了海水中的DA及它的异构体，但样品预处理采用的是固相萃取盘，该方法的检测限为0.02ng/mL，回收率为92.1%-110.6%，用此方法能检测海水中的痕量DA。Vale等利用HPLC-MS的方法，以1+1的甲醇溶液作为洗脱液，对葡萄牙鱼类和贝类体内的软骨藻酸含量进行测定，结果表明在春季样品中DA含量最高；在分析的众多样品中，蛤仔和鸟蛤被软骨藻酸污染最为严重，紫贻贝和牡蛎等物种受污染较轻。陈燕青等利用HPLC-MS法测定虾夷扇贝和长牡蛎中软骨藻酸的残留，样品经浓度50%甲醇提取，LC-SAX柱净化，3ml0.1mol/L甲酸溶液洗脱，电喷雾离子源（ESI），在正离子、多反应监测方式（MRM）模式下进行定性与定量，该方法的检出限达0.01μg/g，线性范围为0.02-10.00μg/g。
高效液相色谱-荧光检测法是使用衍生剂将DA衍生成含荧光基团的物质，用荧光检测器进行检测，在DA分子上引入荧光基团可使方法的灵敏度提高。检出限可达到pg/ml。Maroulisb等利用柱后衍生法测定DA，加入4-氯-7-硝基-2，1，3-苯并氧杂恶二唑（NBD-Cl）与DA上的氨基反应生成荧光基团，提高了荧光检测检测器（FLD）的灵敏度，荧光检测器激发波长设为469和529nm，检出限低至25μg/kg。James等使用NBD-F来衍生化DA，用等梯度淋洗程序分离化合物，激发波长为470nm，发射波长为530nm，方法检测限高于1ng/mL，贝类组织中DA的回收率>95%，当用强阴离子交换SPE柱萃取DA时，检测限达到6ngDA/g贝类组织。Chan等参考了这种方法来检测DA，但他们改进了样品预处理方法，即在SPE柱中加入TiO2，可以更好地吸附DA，并探讨了最佳pH，结果表明，吸附的最佳pH为4，解吸时pH则为11，吸附平衡时间为2小时，最佳吸附剂装载量为0.67mgTiO2/ngDA。Maroulis等采用NBD-Cl柱后衍生DA进行检测，成功测得了贝类组织中DA含量为75μg/kg的样品，该方法检测限低至25ppb，能实现全自动化分析，对样品预处理要求低，干扰少。由于大多数衍生试剂价格昂贵、不稳定，且其分解产物可能出现在色谱图中，同时衍生试剂的变质也可能导致毒素的不完全衍生化，因此荧光检测法的实际应用很少。 免疫分析法（ELISA）是基于抗体与抗原或半抗原之间的高选择性反应而建立起来的一种生物化学分析法，即根据抗原-抗体反应，采用特异性贝类毒素的抗体来检测DA。免疫分析法主要包括酶联免疫法、放射性免疫法、荧光免疫法等，具有方便、快速的特点，但缺点是费用较高，而且各毒素之间的交叉反应低，不能全面体现出样品的毒性。检测DA所采用的免疫分析方法主要是酶联免疫吸附法（ELISA）。ELISA是利用抗原-抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，通过酶作用于底物后的显色反应判定结果，是应用最广泛的免疫学检测技术，由于其实验结果可用目测，也可用酶标仪测定光密度值以反映抗原含量，所以有易定性定量的双重优点。Engvall和Perlmann于1971年最先应用该法进行IgG定量测定，并命名为Enzyme linked immunosor-bentassay（ELISA）。由于ELISA方法灵敏，特异性强不需要特殊设备，被广泛应用于各种抗原和抗体测定。将ELISA应用于DA的检测中，利用原-抗体反应，采用特异性贝类毒素的抗体来检测DA。
Yu等采用匙孔血蓝蛋白（KLH）和小牛血清蛋白（BSA）为载体，进行直接酶联免疫测定，结果表明，蓝贻贝样品的检测限<25ng/g，回收率为81.1%，Yu等还将实验结果用HPLC方法进行了验证，最终发现15种被污染的贝类样品中有10种样品的DA含量<50ng/g。Maucher等结合ELISA技术使用血液采集卡来提取小鼠血液中的DA，这种方法可以避免DA在血液中被清除。一般说来，在4小时内，99%的DA会从血液中被清除，但使用该方法后，DA在24小时内仍然能被检测到。该方法灵敏度高，用血液采集卡提取样品方便，因此可用此方法来监测海洋哺乳动物体内的DA含量。Tsao等采用单克隆抗体ELISA检测法检测DA，并建立了基于单克隆抗体的胶体金免疫条检测法，免疫条检测法的检测限为5ng/mL，在十分钟内就可完成检测。Tsao等的实验结果表明，用免疫条检测得到的结果与用ELISA方法得到的结果有很好的吻合性，可以用来快速检测贝类样品中的DA。另外，Shaw等建立了基于基因工程单链抗体（scFv）竞争ELISA检测方法，相比传统方法，这种方法具有很多优势，基因工程单链抗体（scFv）可以在大肠杆菌中快速、大量地得到表达，且容易和其他小分子融合，形成融合蛋白以用于检测或其它用途。用该方法检测天然扇贝组织得到的数据与标准HPLC方法检测的结果基本相符。大多数ELISA法采用的都是直接法，而许道艳等则以DA-OVA为包被抗原，利用抗原抗体反应，建立了间接竞争酶联免疫吸附技术分析检测海水样品和海洋贝类中DA的方法。结果表明，该方法最低检出限为10μg/L，海水样品平均回收率为102.2%，贝类样品平均回收率为111.5%。ELISA方法能够进行批量检测，但特异性较差，因而主要用于DA的初步筛选。由于DA标准品昂贵，且DA分子量太小，因此制备免疫抗原较困难，从而限制了免疫方法在DA分析中的应用。 液质联用（LC-MS/MS）技术几乎可以分析所有的贝毒。液质联用依赖于高效液相色谱把贝毒成分通过离子化带到质谱中。电喷雾电离源（ESI）和大气压化学电离源（APCI），这两种技术都已经应用于贝毒分析。由于食品（动物组织）的背景非常复杂，样品间差异又相当大，采用LC-MS（MS/MS）技术测定食品中贝类毒素的关键是样品的前处理。国外文献方法多采用甲醇-水溶液提取，然后固相萃取法进行净化与浓缩，最常用的固相萃取柱有Cl8烷基键合硅胶柱，CN柱和离子交换柱，最常用的是阴离子交换柱，非键合硅胶柱也有很好的纯化和萃取效果。此外还有溶剂提取方法、液相色谱制备法和超临界流体萃取法等。食品（水产品）中的贝类毒素残留量甚微，一般为μg/kg水平。2005年方晓明等利用液相色谱四极杆-飞行时间质谱（LC/Q-TOFMS）联用技术对贝类样品的失忆性贝毒进行了研究。样品经甲醇/水（体积比为1：1）提取，经SAX固相萃取柱净化后，用Zorbax Eclipse XDB-18柱（250mm×2.1mm，3.5μm）色谱分离，以乙腈/水含0.05%甲酸水溶液作流动相，梯度淋洗，流速为0.20mL/min。Q-TOFMS选择电喷雾正离子模式，以[M+H]+作为前体离子进行TOFMS扫描。结果表明：样品加标的平均回收率为87.8%-94.6%，相对标准偏差为8.4%-11.9%，检测低限（LOQ）为0.1μg/g。由于Q-TOFMS具有高分辨率，能进行精确测定而不降低灵敏度，因此本方法作为对贝类样品中失忆性贝毒的确证分析方法具有高灵敏度和选择性。2003年HollandPT等用LC-MS/MS的方法测定了贝类中软骨藻酸和其异构体的含量，以甲醇/水（体积比为1：1）作为提取剂，以乙腈/水（体积比为1：1）作为稀释剂，经SPE固相萃取后，用C18柱色谱分离。选用了4种不同的贝类，当软骨藻酸在样品中的含量为1μg/g贝-2μg/g贝时，软骨藻酸的回收率为93%（RSD大于7%）。2007年PardoO等用甲醇/乙腈（体积比为9：1）作为提取剂，经PLE萃取后，通过电喷雾电离（ESI）界面与质谱联用（ESI-MS-MS）分析测定软骨藻酸。使软骨藻酸在0.05-5μg/mL范围内具有良好的线性关系，相关系数r=0.999；当方法检出限为0.2μg/g，回收率为81%；当方法检出限为0.5μg/g，回收率为95%。此方法成功应用于46个贝类样品的检测中。2007年WangZH采用离子碎片的方式，使用多反应器，以甲醇/水（体积比为1：1）作为提取剂，以乙腈/水（体积比为1：1）作为稀释剂，用4mL0.15%甲酸洗脱，经SPE固相萃取后，用C18柱色谱分离，当检测浓度为30pg/mL，使得回收率从90%提高到98%，建立了一种定量和定性的方法。

② 麻痹性贝类毒素是什么

麻痹性贝类毒素是一种神经毒素，因人们误食了含有此类毒素的贝类而产生麻痹性中毒的现象，所以称之为麻痹性贝毒。

其毒理与河豚毒素（TTX）相似，主要是通过对钠离子通道的影响而抑制神经的传导。麻痹性贝毒在许多种不同的贝毒中毒事件属最严重，因其强烈毒性，经常造成消费者中毒死亡事件，并且具有广布性与高发性。

麻痹性贝类毒素的急救措施

PSP食物中毒很难诊断，一般诊断主要是依据进食史，即发病前摄入过可能含有PSP 的水产品，临床症状是以神经系统和神经机能支配紊乱为主要症状，以及有很明显的心脏血管的表现等综合判断，并且需要与抗胆碱酯酶（如毒扁豆碱）杀虫剂中毒、河豚鱼中毒等进行鉴别。

没有特效的实验室检测方法来协助诊断，然而，可以收集中毒水产品的捕捞地水样检测有毒双鞭甲藻及对可疑食物PSP 定量定性检测来确定是否为麻痹性贝类中毒。

中毒早期可皮下注射盐酸阿朴吗啡5mg引吐，或洗胃后灌入2%碳酸氢钠1L，口服活性碳吸附剂使毒素被吸附排出。对肌肉麻痹者可在急性期后给予士的宁2~3mg皮下或肌肉注射。一旦发现呼吸困难，必须立即实行人工呼吸、气管插管或机械呼吸，及时供氧。

以上内容参考网络-麻痹性贝毒

③ 石房蛤毒素的检测方法

在食品卫生和安全方面，随着海洋环境的恶化，赤潮的大量发生，世界对贝毒的检验更加重视。美国从1925年就建立了贝毒监测制度，1958年以后，贝产地STX允许量为80μg/100g（相当于400MU/100g）。日本、加拿大等都有类似的规定。饮水中的STX及类似物含量健康警戒线为3μg/L。
生物检测法包括：（1）生物毒性试验法。小鼠生物法是AOAC推广的检测麻痹性贝类毒素的标准方法，是国际上都能接受的唯一的方法。该方法在检测样本总毒性方面相当成功，但是无法准确定性样本中单个毒素。此外，还有家蝇生物分析法、蝗虫生物分析法。上述3种生物分析技术原理相似。（2）细胞毒性试验法。石房蛤毒素具有Na+通道阻滞剂的特性，可拮抗箭毒、藜芦碱的作用，以减少或“解救”细胞形态的改变及细胞裂解死亡，且该拮抗或“解救”作用与毒素的量呈对应关系。根据该对应关系可以计算出毒素的含量。早期建立的方法是用显微镜计数活细胞数以检测PSP毒素的量，但试验时间长，操作繁琐，所需细胞量大。在该原理之上发展起来一种STX的快速诊断装置MIST，已成功用于酸性粗毒中PSP总毒性的测定及STX、neoSTX、GTX和dcSTX相关毒性的测定，该装置的灵敏度高，检测迅速且无需组织培养的设备及专业知识。（3）免疫分析技术。随着抗STX抗体的获得，免疫分析技术如血球凝聚反应、放射免疫分析（RIA）和酶联免疫分析（ELISA）等逐渐发展起来，其中直接竞争ELISA法是最常用的一种方法，检测限可达3pg/ml，间接ELISA的检测限也可达到10pg/ml。免疫方法灵敏度高，方便迅速，但抗体的获得是其关键，各毒素的交叉反应低，不能完全体现样品的毒性来源。（4）受体分析法。即固相受体结合法（solid-phase receptor binding assay），主要是根据PSP毒素能与Na+通道蛋白质结合的特点，应用同位素标记以检测PSP类毒素的量，具有快速、可靠、准确的特点。Llewellyn等以一种特异结合STX的类似转铁蛋白Saxiphilin代替Na+通道蛋白质，其对STX的鉴定具有专一性，从而与TTX的鉴定相区别。
仪器测定法包括（1）HPLC法及其联用技术。HPLC 法灵敏度高，专一性强，检出限量低，分析时间短，能够提供更多的毒素信息，是毒素检测的主要手段。但石房蛤毒素分子本身的生色基团很微弱，不易被检测，因而检测前要将其氧化成荧光生色团，用荧光检测器进行检测。氧化手段主要有柱前氧化和柱后氧化，柱后氧化在分离柱后另加的一个柱上进行，简化了操作步骤。随着质谱技术的发展，液质联用技术成为物质鉴定的一个强有力手段。（2）薄层色谱法（TLC）。TLC法是检测PSP毒素的传统方法之一，使用已较少。但新的检测设备的出现为其发展提供了新的空间。I在层析柱上对STX及其同系物进行棒状薄层层析分离，以火焰热离子检测器（FTID）进行检测，结果STX的检出限为5ng，其余同系物的检出限也均达到ng级。另外，气相色谱、离子交换柱层析、电泳法等均是检测STX毒素的传统技术，方法优劣各异。 小鼠生物测定法（mouse bioassay，MBA）是在STX得到鉴定之前就已经研究出来的检测方法，并且其它的检测方法都以该方法作为参照。MBA用于检测STX已经有很长的历史，是AOAC于1958年确认的法定检测方法。大部分国家依然在使用该方法。该方法技术上简单易行且不需特殊设备。鼠类的神经细胞对STX的反应与人类神经细胞的反应一样，因此，该方法的测定结果直接关系到人类健康的风险评估。多数国家规定海洋贝类产品中STX可接受的最大含量为80μg STXeq/100g，墨西哥控制在30μg STXeq/100g，菲律宾控制在40μg STX eq/100g。但也有人认为80μg STXeq/100g的检测限可以保证人类的健康不受威胁。这类毒素在饮用水中的含量规定也不同。1999年研究人员等通过实验计算出了饮用水中PSTs可接受的最大含量为3μg STXeq/L。后来，澳大利亚将这个浓度应用到了饮用水标准中，巴西将其定为强制性的法规标准，新西兰将这个浓度定为饮用水中可接受的最大含量。但是，MBA对该浓度的敏感度不够，样品不经过浓缩很难检测出来。MBA的最低检测限为40μg STXeq/100g，相当于0.2μg/mLSTX，或200μg/L STX。因此，尽管MBA一直被广泛应用于检测经生物富集作用而STX含量高的海产品中，却不适用于饮用水中STX含量的检测，同时无法准确定性样本中单个毒素，而且实验动物检测方法在某些地区已经被禁止。针对存在的这些问题，逐渐研究出一些新的检测贝毒的方法，如化学、生物化学、毒性测定等方法，同时也可用于检测淡水蓝藻和被污染的水源。
运用细胞生物测定法来检测PSTs含量的方法已经建立，并且可以代替MBA进行毒性检测，该方法专门用于检测像STX这类可以阻断电压门控Na+通道的毒素。神经瘤细胞测定是在神经细胞内的Na+通道水平上检测PSTs。STX是一种Na+通道阻断剂，其功能是可以通过与打开钠通道的藜芦定的拮抗作用检测出来。最初建立的细胞生物测定法是通过鼠神经母细胞瘤的形态学作为端点来评估测定结果，随后Jellet和Manger对这种方法进行了改进，采用色度法显示有更好的选择性。因此，如果实验室能承担得起基于MS的检测方法的仪器费用，那么这种检测方法在将来很可能会代替STX的色谱分析。 通过末点来测定细胞的活力，从而使其更便于自动控制。在这种测定方法中，神经瘤细胞培养于96孔细胞培养板中，用Na+通道激活剂藜芦定处理，增强Na+以及Na+/K+-ATP酶抑制剂乌本甙的内流，从而阻断Na+外流。在PSTs的存在下，通过使用MTT（3-[4，5-二苯基-2羟基]-2，5-二苯基四唑来测定细胞活力。通过使用标准量的藜芦定和乌本甙，细胞受保护的程度可以通过与PSTs的标准量对比，以此来定量PSTs的总量，然后结果转换成STX当量。鼠和人的成神经瘤细胞都可以用于该测定方法。
Saxiphilin是一种结构与转铁蛋白相似的蛋白，研究表明，其与PSTs有很高的亲和力。然而，不同的Saxiphilin对不同的类似物有不同的亲和力。到为止，从热带蜈蚣（Ethmostigmus rubripes）体内分离的Saxiphilin在试验中有最小的选择性。利用这一特性，Llewellyn LE等建立了检测PSTs的特异受体法，该方法的检测限为6.3μg STXeq/L，或1.3μg STXeq/100g贝肉。但研究人员声明，在没有额外的基质干扰下，如果增大样本容量，该方法的检测限会降低。从热带蜈蚣体内提取粗Saxiphilin的程序很简单，制备的产物很稳定，可以反复冻融，在-80℃下可以保存一年以上。编码Saxiphilin蛋白的基因克隆，以及文库的构建已经完成，可以通过真核表达系统表达该蛋白，并且得到的表达产物具有生物活性。更进一步的研究证明，同时采用SCBA 和Saxiphilin受体检测法检测介虫和贝类体内的非PSTs钠离子通道活性，其实用性很好，因为非PSTs如河鲀毒素（TTX）不与Saxiphilin结合，而且检测结果与HPLC和MBA的结果有很好的相关性。
该方法最初是用来监测贝类和鱼类产品中的海洋毒素，并且在检测海洋神经毒素类方面得到了很好的验证。其他的研究人员也运用此法检测在淡水蓝藻细菌中占优势的PSTs的衍生物，进一步对该法进行了的验证。研究表明，神经细胞瘤生物测定法得出的结果与鼠生物法测定的结果很接近（相关系数R2=0.96），而且有敏感性更高的的优点，其检测限为10ng STXeq/mL提取物（相当于2.0μg STXeq/100g 贝肉）。通过细胞生物测定法获得的结果与色谱法得到的结果也有很好的相关性。然而，生物测定法有其独特的优点，即对任何可以抑制Na+通道的毒素，无论是已知的PSTs类似物，还是未知的变异体，都有很好的敏感性。正如Humpage 等所描述，该测定方法可以检测未定性的、不能被色谱法检测出来的很多毒素。细胞生物测定法不能区分相似的毒素，只能提供一个所有毒素的累积效应值，因此与MBA相比，在细胞培养测定中该方法很难确定相关毒素类似物的毒性反应，除非将每个类似物进行单个的分析。然而，Llewellyn等提供的相关数据表明，当使用复杂的PSTs混合物时，细胞生物测定法与MBA相比是一个很好的毒性预测器。Llewellyn等还同时使用MBA、细胞培养测定、HPLC和放射性受体测定对含有复杂的PSTs的21种贝肉提取物进行了分析，在这四种检测技术中，与MBA相关的细胞培养测定法的测定结果与预期的毒性最接近。但是，细胞生物测定法依然存在一些缺点。首先，由于该方法依赖藜芦定和乌本甙的拮抗作用，必须使用适当的浓聚物以使其与PSTs反应敏感。正如Jellet等所讨论的，任何毒素浓聚物浓度的改变都会降低该方法对PSTs检测的敏感性。其次，该方法的标准检测装置运行慢，需要很长的细胞孵育时间（24-48 h），才能对成神经瘤细胞形成细胞毒性作用。 HPLC 被广泛用于有机化合物的分离，同时也是第一种用于检测PSTs的仪器分析方法。然而，该技术也存在一些缺点，首先需要毒素标准品作参照，其次缺少用来制备荧光产物的光反应酶或后置柱衍生物化法的载色体，尤其是在样品制备过程中PSTs可能会发生化学转化。这种转化经常会使低毒的毒素变成毒性强的毒素，导致无法确定原始样品中毒素的真实毒性。因此，毒素的变异促使检测方法也不断发展，促进更精确的抽提和分离方法的发展。最早的STX理化检测方法是由Bates和Rapoport提出的，由于缺乏STX的载色体，这种方法只能在碱性环境下，将STX用过氧化氢氧化成荧光化合物以达到检测的目的。那时，人们认为这种方法的敏感度比鼠生物法的要高，并且建议用这种方法来进行贝类样品的常规检测。然而，这种方法操作很复杂，使用好几种溶剂和10步以上的化学过程。他们对这种方法进行了改进，增加了精确度和可重复性，但这种方法的操作依然很复杂。
在20世纪80年代，许多研究机构使用诸如X射线衍射、薄层色谱-荧光检测、高速液相色谱（HSLC）等方法发现了新的化合物。1975年，Shimizu等第一次描述了gTX1、GTX2、和gTX3的存在。使用葡聚糖凝胶g或生物胶P-2聚丙烯酰胺凝胶柱，通过稀乙酸洗脱，从gTX成分里分离出了STX，然后使用HSLC将gTX的峰值分解成三种不同的毒素。1987年，Oshima和他的合作者开发了一种后置柱氧化法，该方法可以详细地分析天然甲藻、水华、贻贝、牡蛎等抽提物中所含的PSTs。与Oshima的后置柱氧化法相反，Lawrence等研制了使用前置柱氧化的液相色谱法，来产生带荧光的PSTs衍生物。他们证明，使用过氧化氢氧化对分析非羟基化毒素的敏感性更强，而高碘酸盐氧化作用对分析羟基化毒素的敏感性更强。在这一时期，他们改进了这种技术，例如向高碘酸盐氧化剂中添加了铵甲酸盐，从而改善了neoSTX、GTX1、B2和C3的分析结果，而且由于添加了这种化合物到流动相，使neoSTX和B2的色谱分析更好。由于在检测过程中，pH对检测结果的影响很大，研究人员在检测过程中对pH进行了控制。Gago-Martinez等使用前置柱方法时，分别将高碘酸盐和过氧化物氧化过程的pH调节到7.2-12和8.2-12.8，最后得到的荧光氧化产物的产量不同。当pH在8.2时，通过高碘酸盐氧化作用neoSTX的产量达到了最大，而pH在10-11.5时，STX、GTX2/3、dcSTX和gTX5的产量也都达到了最大。Lawrence等声明采用柱前氧化pH很容易控制，因此结果的可重复性更强，因为在后置柱氧化时pH变化很小，相应对标记上荧光的产物的产量影响很小。然而，尽管柱前方法相对比较简单，但是一些PSTs形成了相同的氧化产物，另外一些形成了不只一种荧光产物。这种方法被建议作为一种筛选方法来为监测程序服务。最初的提议是首先使用高碘酸盐氧化方法，当检测出大多数PSTs，并且毒素浓度超过常规检测限80μg STXeq/100g时，接着采用过氧化氢氧化。色谱氧化法已经用于检测贝类中的毒素，研究PSTs在不同地区鼠脑的分布，他们认为这种方法很合适，敏感度也很高，因此该方法已被欧洲国家确定为检测PSTs的官方检测方法之一。然而，Ben-Gigirey等进行了实验室研究，推断尽管该方法适合于检测研究，但对含有更复杂毒素的样品进行分析时，得到的结果不理想，并且也不是对所有的PSTs都有效。此外，该法只是针对STX、GTX2/3、dcSTX、dcGTX2/3等毒素类似物，可以得到满意的检测结果。Turner等使用该标准对Lawrence的方法进行了进一步的验证，主要包括其选择性、线性、检测限、准确性、回收率、精确度、可重复性、适用性，同时也包括添加dcNeoSTX、dcGTX2/3等PSTs。Turner等对该方法进行了改进，以增加氧化产物的稳定性，改善了固相离子交换的纯度，最终推断该方法可以得到满意的结果。
液相色谱-质谱联用法（Liquid chromatography–mass spectrometry，LC-MS）是一种有效的检测技术，可以用来鉴定未知的化合物，定量已知的物质，阐明新分子的化学性质和结构，实现检测的高敏感度、可选择性、精确定量和高通量。然而，LC-MS价格昂贵，需要有专业知识的技术人员操作和维护。尽管如此，Quilliam建议将LC-MS检测方法作为检测海洋毒素的普遍方法。MS检测PSTs面临的挑战之一是离子配对剂对目标化合物的离子化产生干扰，因此离子配对剂要对PSTs有高效的反相色谱。因此，Jaime等研制了一种色谱方法，该方法使用基于非离子配对洗脱和后置柱电化学氧化的阴阳离子串联交换柱。Dell’Aversano等开发了一种实用的亲水性液相色谱法，该方法不仅可以分离主要的PSTs，而且还可以分离蓝藻细菌中的甲醛类毒素、柱孢藻毒素等。采用该方法，在质谱仪运行选择性反应监控程序时，检测出了15种PSTs，并鉴定出了新的毒素类似物。Diener及其合作者使用两性离子亲水作用色谱法分别与MS和荧光检测联用，在单个梯度下来检测PSTs，他们推断这两种方法都可以得到可靠的定量结果，能够很好的分离更多相关的PSTs。这两种检测方法的检测限只有微小的不同，荧光检测仪有更好的敏感性，而MS检测仪在更短的运行时receptor-binding assay，RBA）、免疫学分析技术等。随着科学技术的发展，又出现了一些新的研究方法应用于检测STX及其类似物，例如生物传感器法、色谱-质谱连用法、荧光定量PCR等方法。 由于ELISA方法具有敏感、快速、操作简便的优点，已经广泛用于检测中，尤其是医学和食品检测领域。该技术所面临的挑战是检测像PSTs这样的多种相关化合物的混合物时，需要保持其识别靶物质结构多样性的能力，同时忽略复杂的基质中其它化合物的影响，对此Usleber等概述了建立抗体检测技术的研究进展。研究显示，抗STX的抗体与neoSTX有很弱的交叉反应，而且这种选择性可以应用于该家族的所有类似物。Chu 等研究发现基于抗STX抗体和抗neoSTX抗体的测定之间有很弱的相关关系，结合这两种测定结果，检出率虽然得到了改善，但是依然不高，只有MBA的80-85%，阳性结果较低。Kawatsu等建立了针对gTX2/3的单克隆抗体，以完善先前建立的针对STX和neoSTX的抗体。该抗体保持着与STX/neoSTX家族其它抗体的差别，但是和gTX2/3、dcGTX2/3、C1/2有着很相似的亲和力。Garthwaite等对多重检测方法进行了深入的研究，并建议使用一整套的ELISA，不仅检测贝类样品中的PSTs，也检测遗忘性贝类毒素、腹泻性贝类毒素和神经毒性贝类毒素。荧光定量PCR法Al-Tebrineh J等建立了一种SYBRgreen的特殊定量PCR 方法，来定量检测鱼腥藻属蓝藻细菌产生的STX。该方法主要是通过确定蓝藻细菌中已鉴定的STX基因簇中独特的多聚乙酰序列拷贝数来推断样品产毒性的能力。Al-Tebrineh J等使用这种方法检测了从澳大利亚不同地方的湖泊、水库、河流中采集的水样，通过HPLC和显微细胞计数确定了水华中STX的富集和蓝藻细菌细胞密度。通过实验证实，STX富集确实与STX基因拷贝数相关，这就表示后者可以作为一种测量鱼腥藻属和其它水华蓝藻细菌的产毒潜能的方法。定量PCR 方法的靶向STX基因也可以用于水华鱼腥藻属和其它几种蓝藻细菌产STX的能力的监测和生态生理学研究。

④ 关于蛤蚌毒素的一些资料

一种麻痹性贝毒素， 贝类毒素的一类统称。（蛤蚌毒素资料只有一些结构图，贝类毒素的参考资料如下：）

贝类毒素
生物学名称：
贝类中毒是由一些浮游藻类合成的多种毒素而引起的，这些藻类（在大多数病例中为腰鞭毛虫，可引起赤潮）是贝类的食物。这些毒素在贝类中蓄积，有时被代谢。其中有20种毒素可引起麻痹性贝类中毒（PSP），它们都是蛤蚌毒素的衍生物。而腹泻性贝类中毒（DSP）则大概是由一组高分子量的聚醚引起，这些聚醚包括冈田酸，甲藻毒素，pettenotoxins，和yessotoxin。而一类叫做短菌毒素的聚醚可引起神经毒性贝类中毒（NSP）。失忆性贝类中毒（ASP）是由特殊的氨基酸、软骨藻酸引起，它们是贝类污染物。
疾病名称：
贝类中毒的类型：麻痹性贝类中毒（PSP）、腹泻性贝类中毒（DSP）、神经毒性贝类中毒（NSP）、失忆性贝类中毒（ASP）。
疾病特征：
食用了被污染的贝类可以产生各种症状，这取决于毒素的种类、它们在贝类中的浓度、和食用被污染贝类的量。在麻痹性贝类中毒的病例中，临床表现多为神经性的，包括麻刺感，烧灼感，麻木，嗜睡，语无伦次，和呼吸麻痹。而DSP，NSP和ASP的症状更加不典型。DSP一般表现为较轻微的胃肠道紊乱，如恶心、呕吐、腹泻、和腹痛并伴有寒战、头痛和发热。NSP既有胃肠道症状又有神经症状，包括麻刺感和口唇、舌头、喉部麻木，肌肉痛，眩晕，冷热感觉颠倒，腹泻，和呕吐。ASP表现为胃肠道紊乱（呕吐，腹泻，腹痛）和神经系统症状（辨物不清，记忆丧失，方向知觉的丧失，癫痫发作，昏迷）。
引起疾病的相关食物：
所有的贝类（滤食性软体动物）都有潜在的毒性 。但是，PSP一般与贻贝(海虹)、蛤蜊、扇贝、和干贝有关；NSP与从佛罗里达海岸和墨西哥湾捕捞的贝类有关；DSP与贻贝(海虹)、牡蛎、和干贝有关，而ASP与贻贝(海虹)有关。
发病率：
因为对贝类中毒的发生及其严重性没有比较好的统计学资料，所以没有办法得到这类疾病的真正发病率。贝类中毒的病例常常被误诊为其它疾病，而且一般很少被报告。在贝类中毒的四种类型中，从公共卫生的角度来看，最严重的是PSP。过去，PSP毒素的强烈毒性已导致了非常高的死亡率。
并发症：
PSP：中毒症状进展相当快，在摄入贝类0.5到2小时内即可发生，这主要取决于摄入毒素的量。在严重的病例中，呼吸麻痹很常见，如果没有提供呼吸支持就可能发生死亡。如果在中毒后12小时内应用呼吸支持，病人常常可以完全恢复，而没有持久的副作用。对于特殊病例，由于这种毒素有弱的降低血压作用，即使有呼吸支持，仍然可能因为心血管衰竭而发生死亡。
NSP：这类中毒在摄入贝类后几分钟到几个小时内发生；持续时间相当短，从几个小时到数天。恢复完全几乎没有后遗症；尚无死亡的报告。
DSP：这类中毒的发生取决于摄入毒素的剂量，在摄入贝类后少则30分钟到两三个小时内即可发生，疾病症状持续2到3天。恢复完全无后遗症；这种疾病一般没有生命危险。
ASP：这类中毒以在24小时内出现胃肠道症状为特征；神经症状发生在48小时以内。在老年人中，中毒症状特别严重，可有阿尔齐默病的症状。迄今为止，所有死亡均发生在老年病人中。

⑤ 贝类毒素有哪些

贝类通过滤食有毒微藻（主要是藻黄素），经过生物累积和放大转化为有机毒素，即贝毒。贝类毒素主要分为腹泻性贝毒、麻痹性贝毒、神经性贝毒和记忆缺损性贝毒四类。腹泻性贝毒（DSP）是由海洋藻类产生，大量存在于软体贝类中的一种毒素，被摄食后，主要症状是腹泻；麻痹性贝毒（PSP）主要产自海洋中的单细胞甲藻，目前已经分离出20种毒素，毒理作用是神经肌肉麻痹剂，阻断细胞钠离子通道，造成神经系统传输障碍而产生麻痹作用；神经性贝毒（NSP）主要是因贝类摄食短裸甲藻后在体内蓄积，被人类食用后产生以神经麻痹为主要特征的中毒；记忆缺损性贝毒（ASP）引起中毒的成分是软骨藻酸（DA），它是一种强烈的神经毒性非蛋白氨基酸，能导致短期记忆功能长久损害。

⑥ 腹泻性贝毒的检测方法

因为DSP是一种潜在的毒物，在贝类中含量很少，因此测定方法需要十分灵敏可靠.在大多数可疑贝样中OA是DSP的主要成分，所以检测方法也主要集中在OA上.主要的检测方法有：腹泻性贝毒的分析方法主要包括小白鼠生物试验法、免疫分析（Immunoassays）、高效液相色谱（High-performance liquid chromatography，HPLC）、液相色谱－质谱联用（Liquidchromatography-massspectrometry，LC/MS）等。 N.Bouaicha首先用毛细管胶束电动电泳，紫外检测器检测贻贝中的OA与DTX-2，但由于缓冲液等问题，效果不是十分理想。

⑦ 贝类中毒的处理方法是什么

有些贝类，由于摄食有毒的藻类而具有毒性，常见的有蛤贝、扇贝、牡蛎等。人食用此种贝类引起中毒时，主要表现为麻痹，故又称为麻痹性贝类中毒。有毒贝类所含的毒素称为石房蛤毒素，人经口食入的致死纯品量为O.54~O.9毫克。

症状表现：

贝类中毒潜伏期为数分钟至2O分钟，开始为运动感觉障碍，唇、舌和指尖麻木，继而腿、臂和颈部麻木刺痛，手足有蚁行感，心悸，痉挛，腓肠肌疼痛，消化道症状有腹痛、便秘、恶心、呕吐，并可有发烧、喉头水肿、呼吸困难，严重者常在2~12小时死亡。

救治措施：

一旦发现中毒，应立即催吐，使块状贝类食物吐出；用5%碳酸氢钠溶液洗胃，并留置2O%药用碳悬液5O毫升于胃中吸附毒素，亦可导泻。

目前对麻痹性贝类中毒尚无有效的解毒剂，对症处置有一定的作用。如病情危重，应尽快请有经验的医生抢救。

⑧ 贝类毒素的检验方法

1 小鼠生物检测法
小鼠检测法是应用最多的贝类毒素检测方法，可用于所有贝类毒素的检测。该方法的优点是技术容易掌握，不需要使用专门仪器。小鼠生物检验法是将贝类毒素的提取物进行适当的稀释后，对小白鼠进行腹腔注射，并计算平均致死时间。根据Sommer表，查出相应的MU(给小白鼠腹腔注射毒素的系列稀释液，然后计算每只20g小白鼠的剂量作为1个死亡时间，以15min内杀死1只鼠单位<Mouse unit，MU>来表示毒性的大小，换算成MU/100g贝肉)。
小鼠生物测定法已被AOAC(美国公职分析家协会)作为国际海产品贸易中贝类麻痹性毒素的测定方法。但该方法的缺点是由于小鼠的大小以及小鼠个体情况的不同，因此造成灵敏度不高，偏差较大。而且存在实验小鼠用量大以及哺乳动物费用增加的缺陷。同时操作繁琐，以及用该法测定高毒性贝类样品时的变异性较高的缺陷[13]。因此需要一种新的测定方法来弥补小鼠检测法的不足。
2 高效液相色谱法
采用高效液相色谱(HPLC)等化学检测法测定贝类毒素发展很快。HPLC法主要应用于PSP， DSP和ASP的检验上[6]。与其它方法相比，HPLC法有着明显的优越性：(1)灵敏度高，专一性强，检出限低；(2)在酸性条件下不稳定的基团如氨甲酰基N)磺基在分析的过程中不会解离；(3)缩短了分析时间，通过自动注射技术，能处理更多的样品，便于进行毒素监控；(4)能提供关于毒素的更多信息，能测出每1个组分的具体含量及毒性的大小，从而有助于比较或了解毒素种类的差异。
HPLC法是唯一能定性、定量检测出各种毒素组分的技术，HPLC法发展非常迅速并极有可能代替小鼠检测法成为主要的检测方法。该法也存在一些如测定时需要昂贵的仪器、专业知识和费时等缺点。
3 免疫学测定方法
免疫学测定方法以抗原一抗体特异性反应为基础，其中包括凝集反应、沉淀反应、补体反应等。可用于PSP，DSP和NSP的检测，其原理是将兔子等实验动物暴露在毒素中，以功能性抗原刺激兔子产生抗体，然后从兔子的血清中提取抗体。抗体可用放射性或荧光物质标记。提取的贝类毒素或匀浆后的贝类组织(如贻贝)暴露于标记物中，然后检测抗血清一抗原混合物中放射性或荧光强度以测定样品中的毒素的含量。
4 细胞检验法
细胞检测法是建立在贝类毒素对生物细胞影响的基础上。许多实验已证明麻痹性贝类毒素的致病机理是通过对细胞钠通道的阻断，造成神经系统传输障碍而产生麻痹作用。
其实验原理如下：当加入乌本苷这种物质时，可增加钠的流入，此时小鼠的成神经细胞瘤扩张并最后溶解暴露在藜芦丁中。但在麻痹性贝类毒素存在时，这两种物质的作用可得到抑制，麻痹性贝类毒素通过对细胞钠通道的阻断，可使细胞形态保持完整。与麻痹性类毒素不同，腹泻性贝类毒素的细胞检验法是建立在肝细胞形态的变化基础上的。
5 其它检测方法
其它检测方法包括分光光度法，电泳法(最常用的是毛细管电泳，主要用于分离测定PSP毒素中的非衍生毒素)，薄层色谱法和气相色谱法(用来检验软海绵酸)等化学检验法，此外，还包括家蝇生物检验法，蝗虫生物检验法，神经细胞生物检验法(又称组织培养分析法，可用于PSP，ASP和DSP的分析的新方法)等生物检验法。