基因工程常用缓冲体系及配置方法

1. TE缓冲液的配制方法

配制方法：量取下列溶液于500ml烧杯中

1M Tris-HCl Buffer PH=8.0 5ml

0.5M EDTA PH=8.0 1ml

向烧杯中加入约400mldd H2O均匀混合；将溶液定容到500ml后，高温高压灭菌；室温保存.

1×TE Buffer

组成浓度：10mMTris-HCl1mM EDTA PH=8.0

配制量：500ml

(1)基因工程常用缓冲体系及配置方法扩展阅读

TE缓冲溶液（Tris-EDTA buffer solution）

在生化研究工作中，常常要用到缓冲溶液来维持实验体系的酸碱度。研究工作的溶液体系pH值的变化往往直接影响到我们工作的成效。如果提取酶实验体系的pH值变化或变化过大，会使酶活性下降甚至完全失活。所以我们要学会配制缓冲溶液。

由弱酸及其盐组合一起使具有缓冲作用。生化实验室常常用的缓冲系主要有磷酸、柠檬酸、碳酸、醋酸、巴比妥酸、Tris（三羟甲基氨基甲烷）等系统，在生化实验或研究工作中要慎重地选择缓冲体系，因为有时影响实验结果的因素并不是缓冲液的pH值，而是缓冲液中的某种离子。如硼酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐和三羟甲基甲烷等缓冲剂都可能产生不需要的反应。

硼酸盐：硼酸盐与许多化合物形成复盐、如蔗糖。

柠檬酸盐：柠檬酸盐离子容易与钙结合，所以存在有钙离子的情况下不能使用。

磷酸盐：在有些实验，它是酶的抑止剂或甚至是一个代谢物，重金属易以磷酸盐的形式从溶液中沉淀出来。而且它在pH7.5以上时缓冲能力很小。

三羟甲基氨基甲烷：它可以和重金属一起作用，但在有些系统中也起抑止的作用。其主要缺点时温度效应。这点往往被忽视，在室温pH是7.8的Tris一缓冲液，在4℃时是8.4，在37℃时是7.4，因此，4℃配制的缓冲液拿到37℃测量时，其氢离子浓度就增加了10倍。而且它在pH7.5以下，缓冲能力差。

2. 配制缓冲溶液常用什么方法

配制缓冲溶液常用方法有：
1、根据所需求的酸碱性选择合适的缓冲对，若是配制酸性缓冲液就选择弱酸与弱酸盐缓冲对；若是配制碱性缓冲液就选择弱碱与弱碱盐缓冲对。
2、根据所需要控制的PH范围以及弱酸和弱碱的解离常数（pKa/pKb）选择具体的共轭酸碱对，公式为PH＝pKa±1＝（14-pKb）±1。
3、根据公式计算缓冲溶液的组分比，酸性缓冲液PH＝pKa－lgc酸/c盐，碱性缓冲液PH＝14-pKb+lgc碱/c盐。
4、根据共轭酸碱对以及其组分比配制缓冲液，方法同普通溶液。
举例：试配制一种缓冲液，体积为1L，PH能维持在10.25左右。
a、依题意选择弱碱与弱碱盐的共轭对；
b、由PH＝（14-pKb）±1，算出pKb在3.75与4.75之间，查弱碱的解离常数表可知氨水（pKb=4.75）符合要求，故可选择NH3-NH4Cl体系；
c、由PH＝14-pKb+lgc碱/c盐，算出c(氨水)/c(氯化铵)＝10；
d、设氨水的浓度为10mol/L，则氯化铵的浓度为1mol/L，所以在浓度为10mol/L体积为1L的氨水中加入1mol的氯化铵即可。

3. 简述基因工程四大要素的作用及基因工程操作步骤

目的基因、运载体、工具酶、受体细胞
步骤：基本操作步骤
1.获取目的基因是实施基因工程的第一步。如植物的抗病（抗病毒
抗细菌）基因，种子的贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因干扰素基因等，都是目的基因。
要从浩瀚的“基因海洋”中获得特定的目的基因，是十分不易的。科学家们经过不懈地探索，想出了许多办法，其中主要有两条途径：一条是从供体细胞的DNA中直接分离基因；另一条是人工合成基因。
直接分离基因最常用的方法是“鸟枪法”，又叫“散弹射击法”。鸟枪法的具体做法是：用限制酶将供体细胞中的DNA切成许多片段，将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞提供的DNA（即外源DNA）的所有片段分别在各个受体细胞中大量复制（在遗传学中叫做扩增），从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法把带有目的基因的DNA片段分离出来。如许多抗虫抗病毒的基因都可以用上述方法获得。
用鸟枪法获得目的基因的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性。又由于真核细胞的基因含有不表达的DNA片段，一般使用人工合成的方法。
目前人工合成基因的方法主要有两条。一条途径是以目的基因转录成的信使RNA为模版，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需要的基因。另一条途径是根据已知的蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对的原则，推测出它的基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。如人的血红蛋白基因胰岛素基因等就可以通过人工合成基因的方法获得。
2.基因表达载体的构建（即目的基因与运载体结合）是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。
将目的基因与运载体结合的过程，实际上是不同来源的DNA重新组合的过程。如果以质粒作为运载体，首先要用一定的限制酶切割质粒，使质粒出现一个缺口，露出黏性末端。然后用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端。将切下的目的基因的片段插入质粒的切口处，再加入适量DNA连接酶，质粒的黏性末端与目的基因DNA片段的黏性末端就会因碱基互补配对而结合，形成一个重组DNA分子。如人的胰岛素基因就是通过这种方法与大肠杆菌中的质粒DNA分子结合，形成重组DNA分子（也叫重组质粒）的。
3.将目的基因导入受体细胞是实施基因工程的第三步。目的基因的片段与运载体在生物体外连接形成重组DNA分子后，下一步是将重组DNA分子引入受体细胞中进行扩增。
基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌，枯草杆菌，土壤农杆菌，酵母菌和动植物细胞等。
用人工方法使体外重组的DNA分子转移到受体细胞，主要是借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。例如，如果运载体是质粒，受体细胞是细菌，一般是将细菌用氯化钙处理，以增大细菌细胞壁的通透性，使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。目的基因导入受体细胞后，就可以随着受体细胞的繁殖而复制，由于细菌的繁殖速度非常快，在很短的时间内就能够获得大量的目的基因。
4.目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。这是基因工程的第四步工作。
望采纳，谢谢

4. 怎么配制标准缓冲溶液

1、只要知道缓冲对的PH值，和要配制的缓冲液的pH值（及要求的缓冲液总浓度），就能按公式计算盐和酸的量。总结出pH值与缓冲液对离子用量的关系并列出了表格。只要知道要配制的缓冲液的pH，经查表便可计算出所用缓冲剂的比例和用量。

2、例如配制pH5.8浓度为0.1摩尔/升的磷酸缓冲液。

3、经查表知pH5.8浓度为0.2摩尔的Na2HPO48.0毫升，而92.0毫升的0.2摩尔Na2HPO4。依此可推论出配制100ml0.1摩尔的磷酸缓冲液需要8.0毫升0.1摩尔的Na2HPO4，而0.1摩尔的Na2HPO4需要92.0毫升。

4、计算好后，按计算结果准确称好固态化学成分，放于烧杯中，加少量蒸馏水溶解，转移入50ml容量瓶，加蒸馏水至刻度，摇匀，就能得到所需的缓冲液。

5、各种缓冲溶液的配制，均按表格按比例混合，某些试剂，必须标定配成准确浓度才能进行，如醋酸、氢氧化钠等。另外，所有缓冲溶剂的配制计量都能从以上的算式准确获得。

(4)基因工程常用缓冲体系及配置方法扩展阅读：

缓冲体系：

一、常用作缓冲溶液的酸类由弱酸及其共轭酸盐组合成的溶液具有缓冲作用。

二、常见的缓冲体系有：

1、弱酸和它的盐（如H2CO3---Na2CO3）

2、弱碱和它的盐（NH3·H2O---NH4Cl）

3、多元弱酸的酸式盐及其对应的次级盐（如NaH2PO4---Na2HPO4）的水溶液组成。

三、生化实验室常用的缓冲系主要有磷酸、柠檬酸、碳酸、醋酸、巴比妥酸、Tris（三羟甲基氨基甲烷）等系统，生化实验或研究工作中要慎重地选择缓冲体系，因为有时影响实验结果的因素并不是缓冲液的pH值，而是缓冲液中的某种离子。

1、硼酸盐：硼酸盐与许多化合物形成复盐、如蔗糖。

2、柠檬酸盐：柠檬酸盐离子容易与钙结合，所以存在有钙离子的情况下不能使用。

3、磷酸盐：在有些实验，它是酶的抑止剂或甚至是一个代谢物，重金属易以磷酸盐的形式从溶液中沉淀出来。而且它在pH7.5以上时缓冲能力很小。

4、三羟甲基氨基甲烷：它可以和重金属一起作用，但在有些系统中也起抑制作用。其主要缺点时温度效应。在室温pH是7.8的Tris缓冲液，4℃时是8.4，37℃时是7.4，因此，4℃配制的缓冲液在37℃进行测量时，其氢离子浓度就增加了10倍。在pH7.5以下，其缓冲能力极为不理想。

5. 简要分析基因的表达系统的组成及优化策略。

原核表达系统 表达调控方式 组成型,诱导型 表达产物定位 分泌型,不分泌型(细胞内,细胞膜,周质空间) 产物纯化方式 是否融合蛋白,是否一步亲和纯化 产物溶解状况 可溶,包含体,分泌型
在各种表达系统中，最早被采用进行研究的是原核表达系统，这也是目前掌握最为成熟的表达系统。该项技术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA片段的载体(一般为质粒)转化细菌(通常选用的是大肠杆菌)，通过IPTG诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白。其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物，而且所需的成本相对比较低廉。但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点：如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控，有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难；而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低
为克服上述不足，许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控领域，其优点是
①根据原核生物蛋白与靶DNA间作用的高度特异性设计，而靶DNA与真核基因调控序列基本无同源性，故不存在基因的非特异性激活或抑制
②能诱导基因高效表达，可达105倍，为其他系统所不及；
③能严格调控基因表达，即不仅可控制基因表达的“开关”，还可人为地调控基因表达量
因此，利用真核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视。目前，基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。

2RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。
RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。。RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。在一步法RT-PCR中，逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下，在一只管中顺次进行。
逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性：

1、 依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链

2、 Rnase水解活性：水解RNA杂合体中的RNA

3、 依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA

用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT 及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。

实验方法如下
http://show.bioon.com/protocol/smallclass.asp?typeid=1724&newstype=RT-PCR

3 质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。在基因工程中质粒常被用做基因的载体。许多细菌除了染色体外，还有大量很小的环状DNA分子，这就是质粒(plasmid)（补充：部分质粒为RNA）。质粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四环素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。有些质粒称为附加体(episome)，这类质粒能够整合进细菌的染色体，也能从整合位置上切离下来成为游离于染色体外的DNA分子。
目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA分子(简称cccDNA)。细菌质粒的相对分子质量一般较小，约为细菌染色体的0.5%～3%。根据相对分子质量的大小，大致上可以把质粒分成大小两类：较大一类的相对分子质量是40×106以上，较小一类的相对分子质量是10×106以下(少数质粒的相对分子质量介于两者之间)。每个细胞中的质粒数主要决定于质粒本身的复制特性。按照复制性质，可以把质粒分为两类：一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1～2个质粒；另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。一般分子量较大的质粒属严紧型。分子量较小的质粒属松弛型。质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。
在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。常用的人工质粒运载体有pBR322、pSC101。pBR322含有抗四环素基因(Tcr)和抗氨苄青霉素基因(Apr)，并含有5种内切酶的单一切点。如果将DNA片段插入EcoRI切点，不会影响两个抗生素基因的表达。但是如果将DNA片段插入到Hind III、Bam H I 或 Sal I切点，就会使抗四环素基因失活。这时，含有DNA插入片段的pBR322将使宿主细菌抗氨苄青霉素，但对四环素敏感。没有DNA插入片段的pBR322会使宿主细菌既抗氨苄青霉素又抗四环素，而没有pBR322质粒的细菌将对氨苄青霉素和四环素都敏感。pSC101与pBR322相似，只是没有抗氨苄青霉素基因和PstI切点。质粒运载体的最大插入片段约为10 kb(kb表示为千碱基对)。

4 基因诊断（gene diagnosis）是以探测基因的存在，分析基因的类型和缺陷及其表达功能是否正常，从而达到诊断疾病的一种方法。它是继形态学、生物化学和免疫学诊断之后的第四代诊断技术，它的诞生与发展得益于分子生物学理论和技术的迅速发展。

常用基因诊断技术：
一、Southern印迹法（Southern blot）

基本原理是：硝酸纤维膜或尼龙滤膜对单链DNA的吸附能力很强，当电泳后凝胶经过DNA变性处理，覆以上述滤膜，再于其上方压上多层干燥的吸水纸，借助它对深盐溶液的上吸作用，凝胶上的单链DNA将转移到滤膜上。转移是原位的，即DNA片段的位置保持不变。转移结束后，经过80℃烘烤的DNA，将原位地固定于膜上。
当含有特定基因片段已原位转移到膜上后，即可与同位素标记了的探针进行杂交，并将杂交的信号显示出来。杂交通常在塑料袋中进行，袋内放置上述杂交滤膜，加入含有变性后探针的杂交溶液后，在一定温度下让单链探针DNA与固定于膜上的单链基因DNA分子按碱基到互补原理充分结合。结合是特异的，例如只有β珠蛋白基因DNA才能结合上β珠蛋白的探针。杂交后，洗去膜上的未组合的探针，将Ⅹ线胶片覆于膜上，在暗盒中日光进行放射自显影。结合了同位素标记探针的DNA片段所在部位将显示黑色的杂交带，基因的缺失或突变则可能导致带的缺失或位置改变。

二、聚合酶链反应

近年来，基因分析和基因工程技术有了革命性的突破，这主要归功于聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）的发展和应用。应用PCR技术可以使特定的基因或DNA片段在短短的2－3小时内体外扩增数十万至百万倍。扩增的片段可以直接通过电泳观察，也可用于进一步的分析。这样，少量的单拷贝基因不需通过同位素提高其敏感性来观察，而通过扩增至百万倍后直接观察到，而且原先需要一、二周才能作出的诊断可以缩短至数小时。

三、扩增片段长度多态性

小卫星DNA和微卫星DNA的长度多态性可以通过PCR扩增后电泳来检出，并用于致病基因的连锁分析，这种诊断方法称为扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism,Amp-FLP）连锁分析法。PCR扩增后，产物即等位片段之间的差别有时只有几个核苷酸，故需用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离鉴定。此法多用于突变性质不明的连锁分析.

四、等位基因的特异寡核苷酸探针诊断法

当基因的突变部位和性质已完全明了时，可以合成等基因特异的寡核苷酸探针（allele-specific oligonucleotide,ASO）用同位素或非同位素标记进行诊断。探针通常为长20bp左右的核苷酸。用于探测点突变时一般需要合成两种探针，与正常基因序列完全一致，能与之稳定地杂交，但不能与突变基因序列杂交；另一种与突变基因序列一致，能与突变基因序列稳定杂交，但不能与正常基因序列稳定杂交，这样，就可以把只有一个碱基发生了突变的基因区别开来.

PCR可结合ASO，即PCR－ASO技术，即先将含有突变点的基因有关片段进行体外扩增，然后再与ASO探针作点杂交，这样大大简化了方法，节约了时间，而且只要极少量的基因组DNA就可进行。

五、单链构象多态性诊断法

单链构象多态性（signle strand conformation polymorphism,SSCP）是指单链DNA由于碱基序列的不同可引起构象差异，这种差异将造成相同或相近长度的单链DNA电泳迁移率不同，从而可用于DNA中单个碱基的替代、微小的缺失或手稿的检测。用SSCP法检查基因突变时，通常在疑有突变的DNA片段附近设计一对引物进行PCR扩增，然后将扩增物用甲酰胺等变性，并在聚丙烯酰胺凝胶中电泳，突变所引起的DNA构象差异将表现为电泳带位置的差异，从而可据之作出诊断。

6. 基因工程研究中需要哪几类酶,这些酶各有什么作用 具体一些

用于基因工程的工具酶
一,限制性内切酶(Endonucleosase)
(一)限制性内切酶(Endonucleosase)的发现与分类
1) 50年代初发现细菌能将外来DNA片段在某些专一位点上切断,从而保证其不为外来噬菌体所感染,而其自身的染色体DNA由于被一种特殊的酶所修饰而得以保护,这种现象叫做限制-修饰,它们由三个基因位点所控制:hsd R, hsd M, hsd S, 十年后,人们搞清了细菌的限制与修饰分子机理:
hsd R---限制性内切酶
hsd M---限制性甲基化酶
hsd S---控制两个系统的表达
1968年Smith等人从流感嗜血杆菌株中分离出两个类内切酶,Hind II和Hind III,为基因工程技术的诞生奠定了基础.
截止到目前为止,已经分离出400余种II类酶,搞清识别位点的有300种,商品化的约有一百种,而实验室常用的有二十种 .
2)限制性核酸内切酶可分为三大类:
I类 能识别专一的核苷酸顺序,并在识别点附近切割双链,但切割序列没有专一性.
II类 识别位点(回文序列)严格专一,并在识别位点内将双链切断
III类 识别位点严格专一(不是回文序列),但切点不专一,往往不在识别位点内部.
因此在基因工程中具有实用价值的是II类限制性内切酶.
(二)II类限制性内切酶的命名及特性
命名原则:取属名的第一个字母大写,取种名的前两个字母小写,构成基本名称.该种中发现的不同的酶按照顺序编号I, II, III等.如存在变种和品系,取变种或品系的一个字母.若酶存在于质粒上,则需大写字母表示非染色体遗传因子.
如,HindIII从Haemophilus Influenzue d株中分离的第三个酶.EcoRI表示基因位于Escherichia coli中的抗药性R质粒上.
(三)II类限制性内切酶的底物识别顺序及切割位点
绝大多数的II类限制性内切酶在底物DNA上的识别顺序长度为4,5,6碱基对,这些碱基对的顺序呈回文结构(Palindromic),而且切点就在其内部,如EcoRI 5'-GAATTC-3' .
DNA被限制性内切酶切开之后,呈现两种断口:
钝端(平端)如Pvu II, Alu I, EcoR V等
粘端(粘性末端)如:EcoR I等
图2-1 限制性内切酶产生的末端
(四)识别位点在DNA分子中的频率
对于特定的限制性酶在DNA分子中的识别位点数目是可以计算的,四碱基的酶平均大约每256个核苷酸(44)有一个识别位点,而六碱基的酶大约4096(46)个核苷酸有一个识别序列,计算是在假定核苷酸随机排列的情况下进行的.实践中这种方法不完全正确,如λ DNA长49kb,对于六碱基的酶应该有12个切割位点,实际上要少一些,如Bgl II只有6个,BamHI只有5个,而SalI只有2个.
二,甲基化酶
在专一位点上甲基化,与限制性内切酶相对应.
(一)大肠杆菌中的甲基化酶
dam甲基化酶: 可在5'GATC3'序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基,这样可使一些识别顺序中含有5'GATC3'的限制性内切酶不能切割来自大肠杆菌的DNA如Bcl I(TGATCA),但BamH I(GGATAA)则不会因为N6A的甲基化而失去活性,因为这两种酶对底物的特异性不同.
dcm甲基化酶 此酶在序列5'CCAGG3'或5'CCTGG3'中的胞嘧啶C5上引入甲基,受其影响的限制性内切酶是EcoR II.
(二) 甲基化酶在基因工程中用途
许多II类限制性内切酶,都存在着相对的甲基化酶,它们可修饰限制酶识别顺序中的第三位腺嘌呤上,封闭酶切位点,从而使其免受切割.如:M.EcoRI催化s-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)的甲基转移到EcoRI识别顺序中的第三位腺嘌呤上,从而使DNA免受EcoRI的切割.
三,T4-DNA连接酶(T4-DNA Ligase)
来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌,连接修复3'端羟基和5'端磷酸基因,脱水形成3'-5'磷酸二酯键
连接双链DNA上的单链缺口(Nick),因此亦可连接限制内切酶所产生的粘性末端
连接RNA模板上的DNA链缺口
连接平头双链DNA速度很慢,在高浓度的底物和酶的作用下方可进行,这属于分子之间的连接.
图2-2 连接酶的作用方式
四,核酸酶
作用: 降解磷酸二酯键
分为:外切酶 内切酶
(一) Bal 31(来自于细菌Alteromonas espejiana) 单链特异的核酸内切酶活性,双链特异的内切酶活性.依赖于Ca2+
用途:
构建限制酶图谱
产生末端缺失突变
DNA超螺旋线性化
(二)E. coli外切酶III
只降解DNA分子的一条链,产生单链的DNA分子.
(三)S1核酸酶(来源于米曲霉菌)
特性:
1. 降解单链DNA或RNA,降解DNA的速度大于降解的速度
2. 降解发生的方式为内切和外切
3. 酶切活性需4.0-4.5pH环境,Zn2+激活
4. 酶量过大时会降解双链核酸,因为双链降解活性比单链低75000倍
(四) DNase I: 来自于牛胰腺, 既可以降解单链也可以降解双链,没有特异性,产生单核苷酸或短链
五,聚合酶
(一)DNA聚合酶I
5'-3'聚合酶活性
3'-5'外切酶活性
5'-3'外切酶活性
核酸内切酶活性
可以被枯草杆菌蛋白酶水解成:Klenow片段和N端具5'-3'外切酶活性的分子.
图2-3 DNA聚合酶I
(二) Klenow酶
该酶无5'-3'外切活性,保留了5'-3'聚合活性及3'-5'外切活性,基因工程中利用该酶:
修复限制性内切酶造成的5'突出的粘性末端
标记DNA探针
催化cDNA第二条链的合成
末端终止法测序
图2-4 Klenow 酶的作用方式
(三) T4 DNA聚合酶
与Klenow酶相似,外切酶活性更高.体外诱变反应中效率很高.
(四)T7 DNA聚合酶
测序酶
(五) Taq DNA聚合酶
耐高温,主要用于PCR反应.
(六) 逆转录酶:将mRNA转录成cDNA
AMV逆转录酶(鸟类成髓细胞性白血病病毒)
DNA聚合酶活性
RNase H活性
DNA内切酶活性
核酸结合活性
M-MLV逆转录酶(Moloney鼠白血病病毒)
两种逆转录酶的区别
肽链的组成
禽酶2条肽链,具聚合酶和很强的RNase H活性
鼠酶1条,较弱的RNase H活性
反应的最适温度
禽酶42°C,二级结构丰富RNA,禽酶效率高
反应的最适pH值
禽酶pH 8.3
鼠酶pH 7.6
六,DNA修饰酶
有大量的修饰酶,主要的有以下几种:
1) 碱性磷酸酯酶(来自于大肠杆菌或小牛肠道)可以去掉DNA分子的5'端的磷酸基团.
2) polynucleotide kinase: 来自于T4侵染的大肠杆菌,在5'端增加磷酸基团.
3) 末端脱氧核苷酸转移酶(terminal deoxynucleotidyl tansferase) 来自于小牛胸腺组织,在DNA分子的3'端增加一个或多个脱氧核苷酸.
4) Topoisomerase改变共价闭合双链DNA分子的结构
第二节 DNA的切割反应
一,缓冲系统的组成
II类酶的酶活条件:Tris-HCl PH7.5, 25-50mM;10mM MgCl2 ;NaCl 0-150mM; DTT 1mM
根据不同酶对盐离子要求不同,可将缓冲液分为以下三种情况:
高盐:100-150mM
中盐:50-100mM
低盐:0-50mM
二,酶切操作
DNA量的确定,加入酶量的确定,发应体积的确定(20μl),反应时间的确定,1-1.5hr,一般为37℃,但也有例外,如Taq I在65°C时活性最高.
单位限制性内切酶定义为:在最佳缓冲系统和20μl体积中反应1小时,完全水解1μgDNA所需的酶量.
三,酶切结果分析
(一) 酶切片段的检测
1) 通过凝胶电泳分离,根据分子量分离.根据凝胶的浓度可以分离不同分子量的片段,聚丙烯酰胺凝胶电泳可以分离1-300bp的分子.
2) DNA分子的检测 a. 染色EB,DNA分子小于25ng,很难检测到
b. 放射性自显影, 可以监测少到2ng DNA分子.
(二)估计DNA分子的大小
根据DNA分子的迁移率,可以用公式计算出分子量D=a-b(logM)
D是移动的距离,M是分子量,a, b是恒量但随着电泳条件的改变而改变.
也可以根据已知大小的片段进行比较,误差约在5%左右.
四,多酶联合酶解
对于对浓度要求相同的酶,原则上可以同时酶解;
对于对浓度要求不同的酶,可以:
1. 低盐浓度的酶先切,后补加NaCL
2. 一种酶切后,换缓冲液,加5mM NaAc 0.1体积,2体积乙醇,冰浴5min,4℃离心10min,干燥
五,定位酶切位点
建立酶切图谱需要一系列的酶.
首先确定每一种酶切后产生的分子量和片段的数目;
然后进行双酶切;
比较酶切和双酶切的结果,绘制酶切图谱;
含糊的位点可以通过部分酶切解决,可以短时间的酶切或者在4°C条件下进行.
六, 限制性内切酶的star活性
在PH不合适,或甘油浓度过高≥10%时,限制性内切酶的切割位点会出现非专一性,因此应确保酶的体积为总体积的十分之一以下.
第三节 DNA片段的连接
重组DNA分子构建的最后一步是连接,通过连接酶完成.相对而言,钝端的连接效率较低,因此一般提高DNA浓度的方法增加接触的机会.而粘性末端的连接效率较高,因为两个粘性末端可以通过氢键碱基互补配对.这种暂时的,碱基配对结构可以提高连接的效率.在分子克隆的连接方式主要有以下几种:
一,连接方式
(一)相同粘性末端的连接
来源:
相同的酶
同尾酶
问题:
极性有两种可能
同尾酶连接后,不能用任何一种酶酶切.称为"焊死".
(二)平头末端的连接
粘性末端--分子内部连接,平头末端--分子间的连接.
提高连接效率的方法:
加大酶用量(10倍)
加大平头末端底物的浓度
加入10%PEG(8000),促进分子间的有效作用
加入单价阳离子, 150-200mM NaCl
提高反应温度
平头连接同样存在两种极性
(三)不同粘性末端的连接
突出5'末端
Klenow补平,或S1核酸酶切平,然后平头连接
突出3'末端
T4-DNApol切平,然后平头连接
突出末端不同
Klenow补平,或S1核酸酶切平
连接后,可能恢复限制性位点,甚至还可能产生新的位点.XbaI与HindIII( XbaI恢复), XbaI与EcoRI(均保留),BamHI与Bgl II(产生ClaI位点)
(四)人工粘性末端的连接
5'突出的末端
外源片段先用Klenow补平;然后用TdT补加polyC;载体片段也用Klenow补平,加polyG,退火不经连接即可转化.目的是:不使酶切位点遭受破坏.
3'突出的末端
外源片段先用TdT加polyG;载体片段加polyC;然后退火;再用Klenow补齐;连接
平头末端
可直接用TdT补加末端,但以加polyA/T为佳.这样稍微加热,AT区就会出现单链区域,然后用S1核酸酶水解即可回收片段
(五)粘端与平端的连接
linker : 人工合成的,含有限制性内切酶识别序列的,短的双链DNA片段.
– 连接的效率较高
– 酶切时可能破坏DNA分子的完整.
adaptor:人工合成的,具有粘性末端寡聚核苷酸.
图 2-5 linker的连接方式
(六)粘性末端的更换
在DNA片段上某一酶切口处换成另一种酶切口
– BamHI酶切片段用Klenow补平,或用S1酶切平;连接一段linker或Adaptor,使之产生EcoRI粘性末端.这样BamHI切口就换成了EcoRI切口 .
– 由AluI更换EcoRI:AluI切开,T4-DNApol切平,另一段DNA EcoRI切开,Klenow补平,连接,原来含有AluI的片段变成含有EcoRI
二,重组率
重组率:连接反应结束后,含有外源DNA片段的重组分子数与加入的载体分子数之比.较为理想的重组率为25-75%
提高重组率的方法:
连接反应条件 外源片段:载体=2:1-10:1(分子数),增加碰撞机会,减少自身环化.
载体除磷 (磷酸酯酶5'除磷).
TdT在3'端增加人工粘性末端,防止载体自我环化 .

7. 各种pH的缓冲溶液怎么配制

配制方法：

只要知道缓冲对的PH值，和要配制的缓冲液的pH值（及要求的缓冲液总浓度），就能按公式计算[盐]和[酸]的量。

这个算法涉及对数换算，较麻烦，前人为减少后人的计算麻烦，已为我们总结出pH值与缓冲液对离子用量的关系并列出了表格。只要我们知道要配制的缓冲液的pH，经查表便可计算出所用缓冲剂的比例和用量。例如配制500nm pH5.8浓度为0.1M磷酸缓冲液。

经查表知pH5.8浓度为0.2M Na2HPO48.0毫升（1M=1 mol/L），而0.2M Na2HPO492.0毫升。依此可推论出配制100ml 0.1M的磷酸缓冲液需要0.1M Na2HPO48.0毫升，而0.1M Na2HPO4需要92.0毫升。

计算好后，按计算结果准确称好固态化学成分，放于烧杯中，加少量蒸馏水溶解，转移入50ml容量瓶，加蒸馏水至刻度，摇匀，就能得到所需的缓冲液。

各种缓冲溶液的配制，均按表格按比例混合，某些试剂，必须标定配成准确浓度才能进行，如醋酸、氢氧化钠等。另外，所有缓冲溶剂的配制计量都能从以上的算式准确获得。

(7)基因工程常用缓冲体系及配置方法扩展阅读

缓冲溶液的pH计算：

1、缓冲液的pH值与该酸的电离平衡常数Ka及盐和酸的浓度有关。弱酸的pKa值衡定，但酸和盐的比例不同时，就会得到不同的pH值。酸和盐浓度相等时，溶液的pH值与PKa值相同。

2、酸和盐浓度等比例增减时，溶液的pH值不变。

3、酸和盐浓度相等时，缓冲液的缓冲效率为最高，比例相差越大，缓冲效率越低，缓冲液的一般有效缓冲范围为pH=pKa±1,pOH=pKb±1。

8. Tris-HCl缓冲液的配制方法

Tris-HCl缓冲液的配制方法：
Tris：三羟甲基氨基甲烷
三羟甲基氨基甲烷（Tris(hydroxymethyl)aminomethane，一般简称为Tris）是一种有机化合物，其分子式为(HOCH2)3CNH2。Tris被广泛应用于生物化学和分子生物学实验中的缓冲液的制备。例如，在生物化学实验中常用的TAE和TBE缓冲液（用于核酸的溶解）都需要用到Tris。由于它含有氨基因此可以与醛发生缩合反应
Tris为弱碱，在室温（25℃下，它的pKa为8.1；根据缓冲理论，Tris缓冲液的有效缓冲范围在pH7.0到9.2之间。
Tris碱的水溶液pH在10.5左右，一般加入盐酸以调节pH值至所需值，即可获得该pH值的缓冲液。但同时应注意温度对于Tris的pKa的影响。
由于Tris缓冲液为弱碱性溶液，DNA在这样的溶液中会被去质子化，从而提高其溶解性。人们常常在Tris盐酸缓冲液中加入EDTA制成“TE缓冲液”，TE缓冲液被用于DNA的稳定和储存。如果将调节pH值的酸溶液换成乙酸，则获得“TAE缓冲液”（Tris/Acetate/EDTA），而换成硼酸则获得“TBE缓冲液”（Tris/Borate/EDTA）。这两种缓冲液通常用于核酸电泳实验中。
用途：有机合成中间体。在电泳缓冲液中同甘氨酸构成缓冲体系，稳定电泳过程中的PH值。在凝胶中也起到稳定PH的作用，只不过是Tris-HCl缓冲体系。
Tris缓冲液不仅被广泛用作核酸和蛋白质的溶剂，还有许多重要用途。Tris被用于不同pH条件下的蛋白质晶体生长。Tris缓冲液的低离子强度特点可用于线虫（C.
elegans核纤层蛋白lamin）的中间纤维的形成。Tris也是蛋白质电泳缓冲液的主要成分之一。此外，Tris还是制备表面活性剂、硫化促进剂和一些药物的中间物。Tris也被用作滴定标准物。
1
M
Tris-HCl
(pH7.4，7.6，8.0)
组份浓度
1
M
Tris-HCl
配制量
1L
配制方法：
1.称量121.1
g
Tris置于l
L烧杯中。
2.加入约800
ml的去离子水，充分搅拌溶解。
3.按下表加入浓HCl量调节所需要的pH值。
pH值
浓HCl
7.4
约70
ml
7.6
约60
ml
8.0
约42ml
4.将溶液定容至1
L。
5.高温高压灭菌后，室温保存。
注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。
1.5
M
Tris-HCl
(pH8.8)
组份浓度
1.5
MTris-HCl
配制量
1
L
配制方法
1.称量181.7
g
Tris置于1
L烧杯中。
2.加入约800
ml的去离子水，充分搅拌溶解。
3.用浓HCl调节pH值至8.8。
4.将溶液定容至1
L。
5.高温高压灭菌后，室温保存。
注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。
TE即Tris-EDTA
buffer（10mM
Tris，1mM
EDTA，pH7.4
pH7.6
pH8.0）。
常用分子生物学试剂，用于DNA的溶解等。
配制1
0×TE
Buffer
(pH7.4,
7.6，8.0)
组份浓度：
100
mM
Tris-HCl，10
mM
EDTA
配制量：
1
L
配制方法：
1.
量取下列溶液，置于l
L烧杯中。
1
M
Tris-HCl
Buffer(pH7.4，7.6，8.0)
100
ml
500
mM
EDTA(pH8.0)
20
ml
2.向烧杯中加入约800
ml的去离子水，均匀混合。
3.将溶液定容至1
L后，高温高压灭菌。
4.室温保存。

9. 缓冲溶液如何配置

缓冲体系配制方法为;先把各组分配成0.1mol/L的溶液，然后在柠檬酸(或磷酸氢二钠，三(羟甲基)氨基甲烷)中逐滴加入盐酸或柠檬酸，用酸度计测量pH值至所需要的pH值为止

10. 常见缓冲溶液是由什么组成的

常用作缓冲溶液的酸类由弱酸及其共轭酸盐组合成的溶液具有缓冲作用。常见的缓冲体系有：
1、弱酸和它的盐（如HAc---NaAc）
2、弱碱和它的盐（NH3·H2O---NH4Cl）
3、多元弱酸的酸式盐及其对应的次级盐（如NaH2PO4---Na2HPO4）的水溶液组成。

而生化实验室常用的缓冲系主要有磷酸、柠檬酸、碳酸、醋酸、巴比妥酸、Tris（三羟甲基氨基甲烷）等系统，生化实验或研究工作中要慎重地选择缓冲体系，因为有时影响实验结果的因素并不是缓冲液的pH值，而是缓冲液中的某种离子。如硼酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐和三羟甲基甲烷等缓冲剂都可能产生不需要的化学反应。

硼酸盐：硼酸盐与许多化合物形成复盐、如蔗糖。
柠檬酸盐：柠檬酸盐离子容易与钙结合，所以存在有钙离子的情况下不能使用。
磷酸盐：在有些实验，它是酶的抑止剂或甚至是一个代谢物，重金属易以磷酸盐的形式从溶液中沉淀出来。而且它在pH7.5以上时缓冲能力很小。
三羟甲基氨基甲烷：它可以和重金属一起作用，但在有些系统中也起抑制作用。其主要缺点时温度效应。这点往往被忽视，在室温pH是7.8的Tris缓冲液，4℃时是8.4，37℃时是7.4，因此，4℃配制的缓冲液在37℃进行测量时，其氢离子浓度就增加了10倍。在pH7.5以下，其缓冲能力极为不理想。