常用的致炎造模方法

㈠ 请阐述常用的灭菌方法

加热灭菌法

加热可破坏微生物中酶、蛋白质和核酸，导致微生物死亡。加热灭菌又分干热灭菌法和湿热灭菌法。在同一温度下，湿热灭菌的效果比干热灭菌好。主要是因湿热灭菌时，有水分存在，蛋白质容易变性。水分又易使微生物膜壁润湿，湿热的穿透力比干热大。

干热灭菌法 常用的有火焰灭菌法与干热空气灭菌法两种。

紫外线灭菌法

是指用紫外线照射杀灭微生物的方法。一般用于灭菌的紫外线波长是200~300nm，灭菌力最强的波长是253.7nm。紫外线作用于核酸蛋白促使其变性，同时空气受紫外线照射后产生微量臭氧，从而起共同杀菌作用。紫外线进行直线传播，可被不同的表面反射，穿透力微弱，但较易穿透清洁空气及纯净的水。因此本法适用于照射物体表面之灭菌、无菌室的空气及水的灭菌；不适用于药液的灭菌、固体物质深部的灭菌；普通玻璃可吸收紫外线，因此装于玻璃容器中的药物不能用此法灭菌。紫外线对人体照射过久，会发生结膜炎，红斑及皮肤烧灼等现象，故一般在人入室前开启紫外线灯1~2小时，关闭后人才进入洁净室。如果必须在人进去后仍要开紫外线灭菌，则人的皮肤及眼睛应有有效的防护措施。一般在6~15m3的空间可装置30瓦紫外线灯一盏，离地面2.5~3m为宜。

用紫外线照射灭菌时要注意下列问题：

1、紫外线的杀菌力，随使用时间增加而减退，一般使用时间达到额定时间70%时应更换紫外线灯管，以保证杀菌效果。国产紫外线灯平均寿命一般为2000h。
2、紫外线的杀菌作用随菌种不同而不同，杀霉菌的照射量要比杀杆菌大40~50倍。

3、紫外线照射通常按相对湿度为60%的基础设计，室内湿度增加时，照射量应相应增加。

4、紫外线灭菌效果与照射的时间长短有关，这需要通过验证来确定照射时间。
5、紫外照射灯的安装形式及高度，应根据实际情况,参考使用说明决定。灭菌方法的验证采用生物指示剂挑战试验，生物指示剂多用枯草芽孢杆菌。

微波灭菌法

微波是指频率在30~3000MHz之间的电磁波。水可强烈地吸收微波，使其极性分子转动，分子间的磨擦而生热，且升温迅速，靠热力而灭菌。在数十秒至几分钟之内可达100～150℃，并全部杀死液体中的微生物，适于水溶性注射液的灭菌。另外，固体药材饮片及固体制剂（丸剂、散剂、胶囊粉等）也含少量水分，微波能穿透到固体内部，由表至里被均匀加热，而起干燥、灭菌的作用。多用于口服液体制剂的灭菌，有望用于注射液的灭菌。但可能对某些药品的PH值、含量、颜色有影响。

辐射灭菌法

辐射灭菌是应用γ射线、β射线杀灭细菌的方法，又称电离辐射，前者由钴-60或铯-137发出，穿透力强；后者由电子加速器产生，带电荷，穿透力弱，灭菌效果差。

化学灭菌法

化学灭菌法系指用化学药品来杀灭微生物的方法。同一种化学药品的低浓度时呈现抑菌作用，而在高浓度时则能起杀菌作用。其杀菌机理可能是：能使微生物蛋白质变性死亡，或与酶系统结合影响代谢，或改变膜壁通透性使微生物死亡等。常用的方法有消毒剂消毒法和化学气体灭菌法等。

消毒剂消毒法

消毒是指杀死病原微生物的方法。但化学消毒剂大多仅能杀死微生物的繁殖体而不能杀死芽孢，能控制一定范围的无菌状态。可将消毒剂配成适宜浓度，采用喷淋、涂擦或浸泡等方法对物料、环境、器具等进行消毒。常用的化学消毒剂有0.1%～0.2%苯扎溴铵溶液、3%～5%的酚或煤酚皂溶液、75%乙醇等。常用于物体表面灭菌。但要注意其浓度不要过高，以防止化学腐蚀作用。洁净室的墙面、天花板、门窗、机器设备、仪器、操作台、车、桌、椅等表面以及人体双手（手套）在环境验证及日常生产时，应定期清洁并用消毒剂喷洒，无菌室用的消毒剂必须在层流工作台中，用0.22μm的滤膜过滤后方能使用。

化学气体灭菌法

系指利用化学药品的气体或产生的蒸汽进行杀灭微生物的方法。

1.环氧乙烷灭菌法

环氧乙烷灭菌法是利用环氧乙烷气体进行杀菌的方法。它是一种传统的灭菌方法，可应用于工衣灭菌、不耐加热灭菌的药品、医用器具、设施、设备等的灭菌。

环氧乙烷灭菌系统，主要有下列四项互相制约的重要因素影响灭菌效果：
1、温度；2、湿度；3、气体浓度；4、灭菌时间。因为环氧乙烷是易燃易爆物质，明火可以引起燃烧，同时由于气体分解还可能引起爆炸，环氧乙烷灭菌中应十分注意安全问题。

2.甲醛等蒸汽熏蒸法

采用甲醛、丙二醇或过氧醋酸等化学品，通过加热产生蒸汽进行空气环境灭菌。
(1)、计算房间体积，按10g/m3的比例称出甲醛。
(2)、将甲醛倒入甲醛发生器或加热盘或烧杯中，并放好加湿用水，必要时还需加入高锰酸钾（2~3g/m3），然后加热（甲醛发生器用蒸汽加热，加热盘或烧杯用热水盛入其中加热）使其蒸发成气体。
(3)、灭菌流程：空调器停止运转→启动甲醛气体发生器或在加热盘中加热甲醛 →让甲醛气体扩散约30分钟→启动空调器让甲醛气体循环约30分钟→停止空调器，房间熏蒸消毒，时间不少于8小时→ 房间排气，用新鲜空气置换约2小时→ 恢复正常运行。当相对湿度在65%以上，温度在24~40℃时，甲醛气体的消毒效果最好。

3、臭氧消毒法

臭氧（O3）的消毒原理是：臭氧在常温、常压下分子结构不稳定，很快自行分解成氧（O2）和单个氧原子（O），后者具有很强的活性，对细菌有极强的氧化作用，臭氧氧化分解了细菌内部氧化葡萄糖所必须的酶，从而破坏其细胞膜，将其杀死。多余的氧原子则会自行重新结合成为普遍氧分子（O2），不存在任何有害残留物，故称为无污染消毒剂。它不但对种种细菌（包括肝炎病毒、大肠杆菌、绿脓杆菌及杂菌等）有极强的杀灭能力，而且对霉菌也很有效。

㈡ 骨膜炎常用的治疗方法有哪些

骨膜炎一般是因为外伤或过度运动而造成骨膜的炎症反应。在情况比较轻的时候可以给予活血化瘀，消炎，消肿止痛治疗。可以用中药骨膜骨方 医-贴。可以配合远红外线，热敷，电疗等等。严重时最好的治疗办法是局部封闭治疗。同时必须限制患肢的活动，减少炎症的进一步加重。如果在关节周围，应该用弹力绷带固定关节，限制关节周围的活动。

㈢ 搔刮损伤血管内膜法和球囊内皮剥脱法的操作和工具

1 体外血栓形成法

1.1 混合血栓形成法 即取动物自身血自然凝固形成血栓。此法制作简单，且可根据需要制成合适大小和形状，以栓塞特定部位。如建立大鼠冠状动脉微栓塞模型〔1〕，取大鼠自身尾静脉血凝固成血栓，玻璃研磨器研磨5分钟，使之成为较均匀颗粒状悬液备用。大鼠麻醉后，取仰卧位，术区备皮消毒，气管插管，呼吸机辅助通气。取第2肋间水平横切口，剪断胸骨，切开心包，暴露主动脉根部， 钳夹升主动脉，同时使用直径0.5mm细针刺入主动脉根部注入血栓微粒，10s后松开钳夹的升主动脉，以栓塞微动脉。由于血栓来源自身，且富含血小板，纤维蛋白，红细胞等，符合冠脉微栓塞时病理生理改变。

1.2 白色血栓形成法 取动物自身血，常温下离心，后取上层血浆加入凝血酶，凝固成白色血栓。此血栓主要成分为纤维蛋白和血小板。人类缺血性脑梗死多为动脉粥样硬化斑块脱落形成的白色血栓栓塞所致，施海滨等〔2〕用介入技术建立犬急性脑栓塞模型适用于影像诊断和溶栓治疗的研究: 抽取犬自体静脉血，常温下以4000转/min离心10min后，取出上层血浆1ml，加入凝血酶100U混匀并注入尖端缩细的玻璃试管中(缩细部分内径1.0mm，长5cm)，凝固后取出，置入生理盐水中反复漂洗，剪成长为5～8mm的血栓条，再透视下将导管经股动脉插至颈内动脉，注入血栓条，即可形成脑栓塞。此法具有操作简单，创伤小，易存活，栓塞可靠的优点，可用于脑梗死的早期诊断及溶栓治疗研究。

2 体内血栓形成法

2.1 机械性损伤法 机械损伤血管内膜后，使内皮下细胞外基质裸露，促使血小板与胶原接触而被激活和黏附，启动凝血过程，导致血栓形成。根据机械损伤方法的不同又可再分为搔刮损伤血管内膜法〔3〕和球囊内皮剥脱法〔4〕通常采用家兔，麻醉后分离股动脉，然后用微型刮匙搔刮血管内膜或用球囊剥脱血管内皮，成功率达100%，操作简便易行。

2.2 电流损伤法 利用电刺激，破坏局部血管，使血管内膜损伤，促使血小板黏附聚集从而形成血栓。可根据需要建立冠状动脉，颈总动脉〔5〕，髂动脉〔6〕等部位的血栓形成模型。

2.1.1 冠状动脉内直流电刺激法 家犬分离冠状动脉左旋支，放入电磁流量仪探头记录血流量。于电磁流量仪探头远端将正电极穿过左旋支管壁作刺激电极，负电极缝在胸部皮下，以形成回路。用100uA直流电刺激300min〔7〕，即形成血栓。另外，血栓形成时，由于血流量的减少，冠状动脉血流会出现反应性的增加，而影响血栓的形成，为避免这种情况的发生，可在电极刺激部位放置一缩窄器〔8〕，此时刺激时间可大大缩短。

2.1.2 冠状动脉外直流电刺激法〔9〕家犬分离左冠状动脉前降支，剪一塑料片置于游离的冠状动脉下方，将双型刺激电极置于塑料片上，直流电0～5mA范围内可调，当刺激部位冠状动脉外膜呈黄褐色并失去弹性及远端冠脉充盈状态消失后既停止刺激。此方法和冠状动脉内直流电刺激法一样，所形成的血栓与人类动脉血栓形态结构类似，其主要成分为血小板，白细胞等。该方法是国内外常用的冠状动脉血栓形成方法。冠状动脉外电刺激比冠状动脉内电刺激法血栓形成耗时短，并保持了动脉管壁的完整，其关键是刺激电量的选择。

2.3 动脉异物法 动脉管腔狭窄形成湍流以及异物的诱导，均可激活血小板，使其黏附性和聚集性增加，血小板黏附于受损内膜下的胶原和异物，激活凝血途径形成血栓。犬麻醉后， 穿刺左颈总动脉，在导丝引导下，将固定有铜网圈的球囊送到左前降支中段，扩张球囊，将网圈固定在冠状动脉内膜上，退出球囊，即可诱发血栓形成。本法除直接影响血小板功能外，铜网圈的植入也可能诱发冠状动脉痉挛加速血栓形成，对研究抗冠状动脉血栓形成所致心肌梗死和药理学的研究及溶栓治疗是一种有价值的模型〔10〕。

2.4 结扎法 该法常用于制备下腔静脉血栓模型，静脉结扎后，引起局部血流淤滞，低氧，导致血管内皮损伤，启动凝血过程，而致静脉血栓形成。分离大鼠下腔静脉，结扎下腔静脉2～6h后于结扎线下方剖开管腔，取出血栓称重。犬手术显露双侧股静脉，在其近，远端分别结扎，持续48h，可造成犬股静脉血栓。该法所形成血栓为红色血栓，是简单易行的静脉血栓模型〔1112〕。

2.5 光化学法 本法系将光敏物质引入机体后在特定波长光线的照射下，发生光化学反应而产生单线态氧等活性氧，继而损伤血管内皮细胞，引起白细胞附壁，激发血小板黏附，聚集而形成血栓。光化学法诱导血栓形成常用的光敏物质有荧光素钠，血卟啉，二碘曙红，伊文思蓝等，用于照射的光源为单色绿光，滤去紫外光的汞灯，He-Ne激光等〔13〕。光化学法诱导肠系膜微循环栓塞时〔14〕， 由大鼠尾静脉注入血卟啉，10min后进行肠系膜微循环观察，选择直径为40～50um的细静脉，作为血栓形成的靶血管，用落射荧光显微镜100W汞灯作光源经紫外滤光片(波长为455nm)， 光斑直径为200um，照射在靶血管上以形成血栓。利用荧光显微镜自身配置的光源，照明简便，光照强度，照射区域的大小等易掌握，可控性强;梗塞形成过程与人类血管内血栓形成的病理过程相似。微血栓形成的全过程可直接通过显微镜进行观察，并可通过计算机图像采集系统读入，用计算机图像处理技术进行分析，定量计算血栓大小，对研究血栓形成过程及定量评价抗血小板聚集药物的效果是十分有用的。

2.6 化学药物致血栓形成法

2.6.1 月桂酸钠 其原理是利用化学物质损伤血管内膜，促进血小板黏附，聚集和促进血管活性物质的释放，形成闭塞性血栓。

2.6.1.1 月桂酸钠所致大脑微动脉血栓形成 大鼠麻醉后，分离一侧颈动脉系统，月桂酸盐分两次分别经颈外动脉及颈总动脉插管缓慢注入颈内动脉，造成大脑微动脉血管内皮损伤而致血栓形成。该模型无须开颅，创伤小，操作简便，因手术操作而导致的死亡率几乎为零，血管内皮的损害及紧接着血栓的梗阻都是有选择性的发生在MAC的一些小分支，MAC内皮无损伤或血栓形成，特异性较高，且大脑梗死范围及行为学改变较恒定，所形成血栓主要成分为纤维蛋白〔15〕。

2.6.1.2 月桂酸钠所致冠状动脉微血栓形成 大鼠麻醉后，气管切开，插管连接呼吸机，左前外侧中心切口进胸，分离主动脉并用血管夹夹闭主动脉后，迅速以微量注射器从心尖部直接向左心室注入月桂酸钠， 血管夹夹闭10s后松开，从而导致冠状动脉微血栓形成〔16〕。此法能很好的模拟由于内皮损伤，继发血小板粘附聚集以及炎症反应形成微血栓这一病理生理过程。

2.6.2 角叉菜胶致大鼠尾动脉血栓形成 大鼠皮下注射角叉菜胶，此后多数动物尾尖部在3～14出现暗红色血栓形成区，并逐渐向尾根部扩大，48～72经发绀变为黑色，随后干细脱落。该方法病理学检查可见病变区较大血管呈炎性改变伴有混合性血栓形成，血栓形成发生在尾部，界限明显，可从体表测量血栓形成的范围和程度，可利用该模型检测多种药物的抗栓效应。但需注意保证温度等实验条件的一致性。角叉菜胶常被用作致炎因子，它所诱发的大鼠尾动脉血栓形成与血管内炎症密切相关，此外角叉菜胶在体外能引起血小板聚集〔17〕。

2.6.3 氯化铁(FeCl3)致颈总动脉和血栓形成 大鼠麻醉后，暴露颈总动脉，将吸有FeCl3溶液的滤纸片包裹动脉〔28〕;或将吸有FeCl3溶液的小片定量滤纸敷在上，以损伤局部血管壁形成血栓〔29〕。该模型血栓的形成为混合性血栓，主要成分为血小板，红细胞和纤维蛋白。并且血栓形成部位固定，既可评价溶栓因子又可检验抗栓因子，为研究抗栓药物提供了较好的方法。

2.6.4 胰蛋白酶致颈总动脉血栓形成 家兔麻醉后分离一侧颈总动脉，用显微外科动脉夹夹住近心端和远心端，两端分别插入针头，经近心端针头用输液泵匀速灌注胰蛋白酶，随后以相同速度灌注0.9%氯化钠溶液冲洗，灌注液经远心端排出该模型所致血栓富含血小板和纤维蛋白，类似于临床血栓形成〔20〕。

2.6.5 高分子右旋糖苷致DIC形成 高分子右旋糖酐具有高粘，高聚作用，使血粘度高，血细胞聚集增多，导致微血栓形成。微血栓动物模型的复制采用10%高分子右旋糖酐。可引起心脏，肠系膜的微栓塞及弥散性血管内凝血〔21〕。

3 弥散性血管内凝血模型的建立

3.1 兔脑粉悬液复制弥散性血管内凝血 兔脑浸液的制备:将家兔放血处死，去处兔脑，去净附着的血管和脑膜，用自来水缓缓冲洗后再用纱布及滤纸吸干，置研钵中加入丙酮，将脑组织研磨压碎，后将丙酮倒净或过滤，反复更换丙酮，研磨6～7次，以去处水分及脂肪，直至脑质被捣成灰白色颗粒为止，最后将脑组织平铺再滤纸上，置37℃温箱中半小时，待丙酮蒸发，脑组织成粉末状。用生理盐水配制成2%兔脑粉悬液后从兔耳缘静脉注入，形成DIC模型〔22〕。其原理是兔脑悬液富含组织因子，经静脉注入后启动外源性凝血途径，从而导致DIC的发生〔23〕。

3.2 凝血酶建立兔急性弥散性血管内凝血 方法采用凝血酶和氨基己酸静脉滴注造成家兔急性模型。 氨基己酸能够抑制网状内皮系统对于凝血酶等活化了的凝血因子的消除作用，所以在造模中加用氨基己酸可辅助凝血酶造成体内血栓形成。用此种方法建立的DIC模型，用时短，效果明显，成功率高〔24〕。

3.3 内毒素致DIC 内毒素通过损伤血管内皮，激活巨噬细胞，单核细胞而释放组织因子，启动凝血过程，形成DIC。用内毒素直接静脉注射或小鼠腹腔注射即可形成DIC模型〔25〕，该法简单快捷，是目前常用的建立DIC模型的方法。

通过制作动物模型，人们进行新的治疗筛选和评估，为人类攻克血栓性疾病和DIC打下了坚实的实验基础。上述血栓形成及弥散性血管内凝血的造模方法和原理各异，应用时应根据不同的目的而选用合适的方法。

㈣ 抑菌试验的常用方法

A、抗菌药物贮存液制备
1.1.1.抗菌药物贮存液制备 抗菌药物贮存液浓度不应低于1000μg/ml(如1280μg/ml)或10倍于最高测定浓度。溶解度低的抗菌药物可稍低于上述浓度。抗菌药物直接购自厂商或相关机构。所需抗菌药物溶液量或粉剂量可公式进行计算。例如：需配制100 ml浓度为1280μg/ml的抗生素贮存液，所用抗生素为粉剂，其药物的有效力为750μg/mg。用分析天平精确称取抗生素粉剂的量为182.6 mg。根据公式计算所需稀释剂用量为：（182.6 mg×750μg/ml）/1280μg/ml=107.0ml，然后将182.6 mg抗生素粉剂溶解于107.0ml稀释剂中。制备抗菌药物贮存液所用的溶剂和稀释剂见表5。配制好的抗菌药物贮存液应贮存于-60℃以下环境，保存期不超过6个月。
B、药敏试验用抗菌药物浓度范围
1.1.2.药敏试验用抗菌药物浓度范围 根据NCCLS抗菌药物敏感性试验操作标准，药物浓度范围应包含耐药、中介和敏感分界点值，特殊情况例外。
C、培养基
1.1.3. 培养基 NCCLS推荐使用Mueller-Hinton（MH）肉汤，pH7.2~7.4。需氧菌及兼性厌氧菌在此培养基中生长良好。在测试葡萄球菌对苯唑西林的敏感性时，应在肉汤中加入2%（W/V）氯化钠，按制造厂家的要求配制需要量的MH肉汤。嗜血杆菌属菌使用HTM肉汤，肺炎链球菌和其它链球菌使用含2%~5%溶解马血的MH肉汤。
D、接种物的制备
1.1.4.接种物的制备 有2种方法配制接种物，一是细菌生长方法，用接种环挑取形态相似待检菌落3-5个，接种于4-5ml的水解酪蛋白（MH）肉汤中，35℃孵育2-6h。增菌后的对数生长期菌液用生理盐水或MH肉汤校正浓度至0.5麦氏比浊标准，约含1~2×108CFU/ml。二是直接菌落悬液配制法，对某些苛养菌，如流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌和链球菌及甲氧西林耐药的葡萄球菌等菌株，推荐直接取培养18~24h的菌落调配成0.5麦氏比浊标准的菌悬液。用MH肉汤将上述菌悬液进行1∶100稀释后备用。注意应在15分钟内接种完配制好的接种物，并取一份接种物在非选择性琼脂平板上传代培养，以检查接种物纯度。
注：在临床微生物学检验中，麦氏比浊法常用于细菌鉴定、药敏实验前配置菌液时大致判断菌液浓度的一种方法，通常认为，如将配菌液浓度配成0.5麦氏比浊管时，相当于1.5×108细菌数/ml，由于方法本身就是一种估计的方法，所以尽管不同细菌大小差异很大，除了真菌孢子，细菌的差别不大，结果不会有影响。但是，标准比浊管的浓度，是药敏实验结果的影响因素之一。
E、附：0.5麦氏比浊管配制方法
0.048M BaCL2 (1.17% W/V BaCL2 . 2H2O) 0.5ml
0.36N H2SO4 (1%, V/V) 99.5ml
将二液混合，置螺口试管中，放室温暗处保存。用前混匀。
有效期为6个月。
F、稀释抗菌药物的制备及菌液接种
1.1.5.稀释抗菌药物的制备及菌液接种 取无菌试管（13×100mm）13支，排成一排，除第1管加入1.6mlMH肉汤外，其余每管加入MH肉汤1ml，在第1管加入抗菌药物原液（如1280μg/ml） 0.4ml混匀，然后吸取1ml至第2管，混匀后再吸取1ml至第3管，如此连续倍比稀释至第11管，并从第11管中吸取1ml弃去，第12管为不含药物的生长对照。此时各管药物浓度依次为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml。然后在每管内加入上述制备好的接种物各1ml，使每管最终菌液浓度约为5×105CFU/ml。第1管至第11管药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、05、0.25、0.125μg/ml。
G、孵育
1.1.6.孵育 将接种好的稀释管塞好塞子，置35℃普通空气孵箱中孵育16~20h；嗜血杆菌和链球菌在普通空气孵箱中孵育20~24h；对可能的耐甲氧西林葡萄球菌和耐万古霉素肠球菌应持续孵育满24h。
H、结果判断与解释
1.1.7.结果判断与解释 在读取和报告所测试菌株的MIC前，应检查生长对照管的细菌生长情况是否良好，同时还应检查接种物的传代培养情况以确定其是否污染，质控菌株的MIC值是否处于质控范围。以肉眼观察，药物最低浓度管无细菌生长者，即为受试菌的MIC。甲氧苄胺嘧啶或磺胺药物的肉汤稀释法终点判断，与阳性生长对照管比较抑制80%细菌生长管药物浓度为受试菌MIC。
根据NCCLS推荐的分界点值标准，判断耐药（resistant, R）、敏感(susceptible, S)或中介（intermediate, I）。S表示被测菌株所引起的感染可以用该抗菌药物的常用剂量治疗有效，禁忌症除外。R指该菌不能被抗菌药物的常用剂量在组织液内或血液中所达到的浓度所抑制，或属于具有特定耐药机理（如β-内酰胺酶），所以临床治疗效果不佳。I是指MIC接近药物的血液或组织液浓度，疗效低于敏感菌。还表示被测菌株可以通过提高剂量（如β-内酰胺类药物）被抑制，或在药物生理性浓集的部位（如尿液）被抑制。另外，中介还作为“缓冲域”，以防止由微小的技术因素失控，所导致较大的错误解释。 A、抗菌药物和培养基制备
1.2.1.抗菌药物和培养基制备 同常量肉汤稀释法。
B、MIC板制备
1.2.2.MIC板制备 无菌操作，将倍比稀释后不同浓度的抗菌药物溶液分别加到灭菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第11孔加药液，每孔10μl，第12孔不加药作为生长对照，冰冻干燥后密封，-20℃以下保存备用。
C、接种物制备
1.2.3.接种物制备 将用生长法或直接菌悬液法制备的浓度相当于0.5麦氏比浊标准的菌悬液，经MH肉汤1∶1000稀释后，向每孔中加100μl，密封后置35℃普通空气孵箱中，孵育16~20h判断结果。当试验嗜血杆菌属，链球菌属时，孵育时间为20~24h，试验葡萄球菌和肠球菌对苯唑西林和万古霉素的药敏试验时孵育时间必须满24h。此时，第1孔至第11孔药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/ml。
D、结果判断
1.2.4.结果判断 以在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。当阳性对照孔（即不含抗生素）内细菌明显生长试验才有意义。当在微量肉汤稀释法出现单一的跳孔时，应记录抑制细菌生长的最高药物浓度。如出现多处跳孔，则不应报告结果，需重复试验。通常对革兰阴性杆菌而言，微量肉汤稀释法测得的MIC与常量肉汤稀释法测得的结果相同或低一个稀释度（1孔或2倍）。 A、介绍
琼脂稀释法是将不同剂量的抗菌药物，加入融化并冷至50℃左右的定量MH琼脂中，制成含不同递减浓度抗菌药物的平板，接种受试菌，孵育后观察细菌生长情况，以抑制细菌生长的琼脂平板所含最低药物浓度为MIC。本法优点是可在一个平板上同时作多株菌MIC测定，结果可靠，易发现污染菌；缺点是制备含药琼脂平板费时费力。
B、培养基制备
2.1.培养基制备 使用MH琼脂，按商品说明书进行配制，pH7.2~7.4。淋病奈瑟菌使用GC琼脂基础加1%添加剂；其它链球菌使用含5%（V/V）绵羊血的MH琼脂（当试验磺胺药时，使用溶解的马血）。
C、含药琼脂平板制备
2.2.含药琼脂平板制备 根据实验设计，将已倍比稀释的不同浓度的抗菌药物分别加入已加热溶解，并在45~50℃水浴中平衡的MH琼脂中，充分混匀倾倒灭菌平皿，琼脂厚度3~4mm。通常按1∶9比例配制药物琼脂平板，根据需要来选择药物浓度范围。配制好的含药琼脂平板应装入密封塑料袋中，置2~8℃冰箱可贮存5天。
D、接种物制备与接种
2.3.接种物制备与接种 制备浓度相当于0.5麦氏标准比浊管的菌悬液，再1∶10稀释，以多点接种器吸取制备好菌液（约1~2μl）接种于琼脂平板表面，每点菌数约为104CFU，形成直径为5~8mm的菌斑。接种好后置35℃孵育16~20h（甲氧西林耐药葡萄球菌、万古霉素耐药肠球菌孵育时间应满24h），观察结果。奈瑟菌属、链球菌属细菌置5%二氧化碳、幽门螺杆菌置微需氧环境中孵育。
E、结果判断
2.4.结果判断 将平板置于暗色、无反光物体表面上判断试验终点，以抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC。在含甲氧苄胺嘧啶或磺胺琼脂平板上可见轻微细菌生长，与生长对照比较抑制80%以上细菌生长的最低药物浓度作为终点浓度。
如果出现有2个以上菌落生长于含药浓度高于终点水平的琼脂平板上，或低浓度药物琼脂平板上不长而高浓度药物琼脂平板上生长现象，则应检查培养物纯度或重复试验。 纸片扩散法(K-B法)又称琼脂扩散法
K-B法药敏试验时接种物配制有两种方法。
第一种是肉汤增菌法（对数生长法），是用接环挑取3-5个细菌菌落入肉汤增菌管中进行增菌4-6小时，然后用生理盐水或肉汤对增菌管中的培养物进行稀释校正使其浓度达到0.5麦氏比浊标准（因为经过增菌培养其培养物浓度一般都高于此标准）。
第二种方法是直接菌落法：从孵育18-24小时的非选择性培养基上，挑取3-5菌落，直接用肉汤或盐制成悬液作为接种，然后将浊度调整至0.5麦氏比浊标准。此法是检测苛养菌（如嗜血杆菌、淋病奈瑟菌和链球菌）和潜在的对甲氧西林耐药的葡萄球菌的推荐方法。
将菌制成菌悬液用无菌棉签蘸取菌液在管壁上挤去多余菌液 ,涂布整个M2H平板表面 ,反复 3 次 ,每次将平板旋转60 度 ,保证涂布均匀 ,35 ℃培养后菌落呈半融合状态 ,否则影响药敏结果。
K-B 法指定用 M-H琼脂平板 ,应用直径90cm平皿 ,在水平的无菌台上倾倒 ,准确量取高压灭菌后的M2H琼脂液25ml ,使之琼脂板厚度为 4mm。否则厚度过高 ,使含药物纸片的药物半球形扩散的体积加大 ,导致假耐药;反之导致假敏感。
要求纸片直径 6.00～6.35mm每片吸水量约012 μl ,纸片的药物含量必须与 K 2B 法规定的
一致 ,用前必须做质量鉴定 ,质量合格方可使用。纸片的保存尤为重要 ,一般要求保存在有干燥剂的容器内低温保存 ,纸片取出后须放室温10min后方可打开 ,否则空气中的水份冷凝在纸片上易潮解 ,使药物失效影响药敏试验结果。 E试验是指浓度梯度琼脂扩散试验，其原理基本同扩散法，即浓度呈连续梯度的抗菌药物从塑料试条中向琼脂中扩散，在试条周围抑菌浓度范围内受试菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。E试验综合了稀释法和扩散法的原理和特点，同时还弥补了二者的一些不足，可以像稀释法一样直接定量测出抗菌药物对受试菌的MIC。
A、培养基、菌液制备和接种
3.1.培养基、菌液制备和接种 同纸片扩散法。
B、贴E试验条
3.2.贴E试验条 同纸片扩散法，E试验条的刻度面朝上，不得贴反，一旦接触琼脂后不得再移动。直径150mm的平皿内可放置6根E试验试条，90mm者一般只能放置1根。
C、孵育时间和温度
3.3.孵育时间和温度 同纸片扩散法。
D、结果阅读
3.4.结果阅读 孵育后围绕试条可形成一个椭圆形的抑菌圈，在抑菌圈和试条的横切相交处试条上的读数刻度即是测定抗菌药物对受试菌的MIC。阅读时应注意的问题见供应商的产品说明书。

㈤ 常用的消毒方法包括哪些内容

（1）常规消毒

所有的预防性消毒均属于常规消毒。消毒的目的是为了杀灭环境中的传染源（病原体）和切断各种传播媒介、传播途径，从而使禽类疫病得到有效的控制。

常规消毒主要包括：种蛋的消毒、孵坊及孵化器的消毒、禽舍的消毒、养禽场场地及活动场所、道路、器械用具等的消毒。

禽场的常规消毒是通过严格的制度和责任到人来落实的，再好的方法和制度必须通过认真的实施才能取得应有的效果。

常规消毒的方法有：

①物理消毒法

是消毒中最常用、最简单、最有实效的方法，包括打扫、洗刷（冲洗）、日晒、通风、干燥、火焰消毒、焚烧等方法，也是将环境中受病原体污染含量最大的灰尘、粪便、垫料、垫草、饲料残渣等清除掉的最适用的办法。火焰高温消毒可以彻底杀灭病原体，对患有高致病性禽流感、新城疫、雏鸭肝炎、鸭瘟、小鹅瘟等烈性传染病的病禽及其污染的垫料、垫草、粪便等排泄物、分泌物、病禽的尸体等用焚烧的方法，可使传染源得到彻底的消灭，也是传染病防控中常用的方法之一。

②化学消毒法

主要是用化学药剂的喷洒和熏蒸等方法而使环境中（含内外环境）的病原体得以杀灭。但消毒药的使用有许多注意事项，这点将在后面的有关章节加以叙述。化学消毒法也是养禽业中最常用的消毒方法。

③生物消毒法

打扫后的粪便、垫草、尘土、污染物等可以通过堆积发酵的方法，来杀死其中的细菌、病毒、寄生虫卵等（利用微生物发酵，可使温度达到70℃以上），但细菌芽孢难以杀死。堆积发酵的地点应选择养禽场围墙外的下风向。

（2）紧急消毒

紧急消毒一般是在发生重大动物疫情（如高致病性禽流感）时，为扑灭疫情或防止疫情传入而对疫区、受威胁区采取的紧急防控措施之一。紧急消毒带有强制性（通过政府的各级组织强制执行）、社会性（包括辖区内所有养禽场、屠宰加工厂、农贸市场及农村的散养禽舍、场地等）和时限性（即在一定时间内必须完成）。

用于强制性消毒的消毒药及其使用方法，一般由兽医主管部门和动物防疫监督机构指定品种和逐极发放，在各级兽医人员的指导和监督下进行，以保证消毒的效果。

紧急消毒时往往是物理消毒、化学消毒、生物消毒几种方法同时使用。所选用的消毒药应考虑杀菌谱广、有效浓度低、作用快、对人畜无害、性能稳定、易溶于水、使用方便、易推广、使用后残留量少或副作用小等。

（3）带禽消毒

带禽消毒是指在家禽饲养期内，定期用消毒药液对禽舍、笼具和禽体进行喷雾消毒。带禽消毒能有效抑制舍内氨气的发生和降低氨气浓度，可杀灭多种病原微生物，有效防止马立克氏病、法氏囊病、葡萄球菌病、大肠杆菌病以及各种呼吸道疾病的发生，创造良好的禽舍环境；为保障禽群健康起到重要作用，夏季还有防暑降温的作用。带禽消毒的要点为：

消毒日龄

一般在10日龄以后即可实施带禽消毒，以后根据具体情况而定。一般在育雏期每周消毒两次，育成期每周消毒一次，发生疫情时每天消毒一次。

清洁环境

为保证消毒效果，首先要彻底打扫禽舍，消除禽粪、羽毛、垫料、屋顶蜘蛛网及墙壁、地面、物品上的尘土。对一些可有可无的物品，应清出禽舍。对于笼养禽舍在彻底清扫后，可用清水冲刷禽舍地面。水洗的目的是将残留在禽舍内的污物冲洗出舍，以提高消毒效果。冲洗后的污水，应通过下水道或暗渠排至远处，不能排在禽舍周围。

慎重选药

带鸡消毒对药品的要求比较严格，并非所有的消毒药都能用。选用消毒药的第一个原则是必须广谱、高效、强力。第二个原则是对金属和塑料制品的腐蚀性小，以人和鸡的吸入毒性、刺激性、皮肤吸收性小，无异臭，不会渗入或残留在肉和蛋中为标准。可用于带鸡消毒的消毒剂有：过氧乙酸、新洁尔灭、次氯酸钠、百毒杀、菌毒敌、复合酚和农福等。

科学配液

配制消毒药液应使用自来水或白开水，不要使用井水。配制消毒液应用热水稀释，水温一般控制在45℃以下。消毒药配成消毒液后稳定性变差，不宜留存，一般应一次用完。

正确喷药

带禽消毒的对象包括舍内一切物品、设备和禽群。消毒器械一般选用雾化效果良好的高压动力喷雾器或背式喷雾器。消毒时应朝禽舍上方以画圆圈方式喷洒，切忌直对禽头部喷雾。雾粒大小控制在80～120微米。雾粒太小易被禽吸入呼吸道，引起肺水肿，甚至诱发呼吸道疾病；雾粒太大易造成喷雾不均匀和禽舍太潮湿。喷雾距离禽体50厘米左右为宜，每立方米空间用15～20毫升消毒液。喷雾时按由上至下、由内至外的顺序进行。以地面、墙壁、天花板均匀湿润和家禽体表微湿的程度为止。

注意事项

①活疫苗免疫接种前后3天内停止带禽消毒，以防影响免疫效果。

②为减少应激，喷雾消毒时间最好固定，且应在暗光下或在傍晚时进行。

③喷雾时应关闭门窗，消毒后应加强通风换气，便于禽体表及禽舍干燥。

④根据不同消毒药的消毒作用、特性、成分、原理，最好以几种消毒药交替使用。一般情况下，一种药剂连续使用2～3次后，就要更换另外一种药剂，以防病原微生物对消毒药产生抗药性，影响消毒效果。

⑤带禽消毒会降低禽舍温度，冬季应先适当提高舍温3～4℃后再喷药消毒。

（4）炕孵消毒

炕孵消毒的重要性。

①孵坊病原体的来源

“百家蛋”（收集许多养殖户的种蛋）蛋壳的带入，农户自备的装雏箱或筐及垫草带入，出雏过程中的霉菌孢子极易被孵坊环境和孵化器吸入。

②炕孵中感染率高的常见病原体有

小鹅瘟病毒、沙门氏菌、曲霉菌、马立克氏病病毒、脑脊髓炎病毒、新城疫病毒、雏鸭肝炎病毒、支原体、禽大肠杆菌等。

炕孵消毒的具体做法

①孵坊应保持清洁卫生的环境，执行严格的卫生消毒制度。孵坊的室内外场地应经常性消毒，在出雏期间应每天用百毒杀等消毒液喷洒。

②孵化器在上蛋前或每出孵一次，都要将出孵污物及时清理；孵化箱、出雏箱、蛋架、蛋盘及所有用具等先用清水冲洗后，再用0.5%氨水或其他消毒液高压冲洗消毒，并用甲醛熏蒸消毒一次。

③规模孵坊应每个月大清洗大消毒一次。种蛋贮存室、孵化器、出雏室等均应有各自独立的通风设备，防止病原体污染的空气在室内互相传染。有条件的孵坊应向饲养户提供经过消毒处理的装雏箱和保温用品，以防止外来的不洁装雏用具带入病原体。

㈥ 哪里可以提供类风湿关节炎（RA）动物模型是用什么方法造模的啊

威斯腾生物的信用很好的，我们这边很多实验都交给他做，动物模型是他们的拳头产品，不过他们建议的是整体实验外包，保证提供真实可靠的实验结果。

㈦ 小鼠抑郁模型造模多少天

小鼠抑郁模型造模5到6天。

小鼠造模方法。方法三次造模分别采用：免疫介导法：小鼠经6.0Gy60Coγ射线亚致死量全身由尾静脉输入DBA/2小鼠的胸腺、淋巴结混合细胞悬液1×106个细胞/0.2ml/只。混合方法：小鼠一次全身3.0Gy60Coγ射线照射后，分照射后，5、6天腹腔注射环磷酰胺50.0mg/kg及氯霉素62.5mg/kg。

中文摘要

随着生活节奏的加快和生存竞争压力的增大，抑郁症患者日益增多。一般认为，抑郁的发病是由于中枢神经系统内5-羟色胺（5-HT）功能下降引起的，选择性5-HT再摄取抑制剂成为目前临床上一线的抗抑郁药物。然而，关于中枢5-HT与抑郁症发病间的关系仍存在很多不明之处，很大原因是已有的动物模型存在一些明显的缺陷。

㈧ 牙周炎的治疗方法

牙周疾病的基础治疗是洁治术和刮治术。
彻底清除牙石，龈上牙石使用洁治术，龈下结石使用刮治术进行牙石清除。
根面平整术：刮除受到毒素污染的病变牙骨质，从而去除引起牙龈炎症的刺激物，形成有利于牙周附着性愈合的条件。
了解口腔卫生知识，培养良好的口腔清洁习惯，控制牙菌斑的生长。
药物治疗
抗生素
抗生素有助于控制细菌感染，一般使用的抗生素包括含抗生素的漱口水、抗生素软膏、口服抗生素等。抗生素需要在医生指导下使用，不能擅自购买使用。
含抗生素漱口水
含有抗生素或抗炎成分的漱口水，如含有甲硝唑的复方氯己定漱口水。
抗生素乳膏
含抗生素的乳膏直接涂抹在牙龈与牙齿的间隙处可以有效地抑制细菌，如米诺环素凝胶。
口服抗生素
一般需要口服抗生素药物才能够彻底清除细菌感染。常用的有以下几类。
硝基咪唑类：如甲硝唑、替硝唑、奥硝唑等，甲硝唑最为常用。该类药物对厌氧菌有很好的抗菌效果。该类药物可与酒精发生相互作用，引起腹部痉挛、恶心、呕吐、头痛、面部潮红等“双硫仑样反应”，因此在用药期间和停药3天后不可饮酒。孕妇和哺乳期妇女及有活动性中枢神经疾病的人禁用。
四环素类：包括四环素、多西环素、米诺环素等，属于广谱抗生素。四环素类药物可致发育中的牙齿着色，牙釉质发育不良，并可通过血-胎盘屏障影响胎儿牙齿及骨骼发育，因此6～7岁以下儿童及孕妇禁用。此外，还有胃肠道反应、肝损害等不良反应，应慎重使用。
青霉素类：常用的有阿莫西林，可与甲硝唑联用。需要注意是否有青霉素过敏，过敏者禁用。
大环内酯类：常见的有罗红霉素、阿奇霉素、螺旋霉素等。常见的不良反应是腹泻、恶心、呕吐。
镇痛药
如果有比较严重的疼痛，可以使用布洛芬、对乙酰氨基酚来缓解疼痛，注意遵医嘱用药。
所有药物均应遵医嘱使用，不可自行调整剂量或停药。
手术治疗
手术方法
翻瓣术：目的为将牙周袋变浅或消除。切开牙龈后翻开，暴露牙根和牙槽骨，进行龈下清洁和根面平整，以及牙槽骨的修整。适用于经过基础治疗后仍有较深的牙周袋并出血；根面牙石不易彻底清除，炎症不能控制；牙周基础治疗后遗留的一些病理状态如根分叉病变、牙龈退缩等。
植骨术：适用于牙周炎导致的骨缺损。移植物可以取自身的骨质，也可以使用人工合成材料。

㈨ 角叉菜胶的致炎作用

目的：观察威灵仙总皂苷对角叉菜胶致炎大鼠足跖肿胀的影响，探讨其抗炎作用机制。方法：以角叉莱胶致大鼠足跖肿胀为实验模型，测定大鼠的足肿胀度，测定并比较各组大鼠血清一氧化氮（nilricoxide，NO）、溶茵酶和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量及一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）、抗超氧阴离子自由基、超氧化物歧化酶（superoxide disnmtase，SOD）的活力。结果：威灵仙总皂苷100mg／kg能够显着抑制大鼠足肿胀度，威灵仙总皂苷100，50mg／kg能够显着降低致炎大鼠血清NO、溶菌酶和MDA含量，升高抗超氧阴离子自由基、SOD活力，并能抑制NOS的活力。结论：威灵仙总皂苷的抗炎作用与其调节血清炎性递质的平衡相关。
关键词: 自身免疫性疾病 , 威灵仙总皂苷 , 角叉菜胶 , 抗炎
角叉菜胶(Carrageenan或Carra-geenin)为目前国内外广为应用的急性炎症模型的良好致炎剂.以往国内使用的角叉菜胶皆为国外产品.为填补空白,辽宁省药物研究所研制并生产了本品.我们对其致炎作用进行了实验研究. 实验材料 角叉菜胶 辽宁省药物研究所产品是从角叉菜(Chondrus Ocellatus)中提取的浅黄色粉末;英国产品是从Cho-ndrus crispis中提取的浅黄色粉末(BDH Chemicals Ltd poole Englandprod 38100,9045340,C2509);日本产品λ-Carrageenin(日本和光纯药工业株式会社生产)亦为浅黄色粉末.
观察电针对角叉菜胶致炎大鼠的抗炎效应及其对环氧合酶(COX)蛋白表达的干预作用,以探讨电针抗急性炎症作用及其部分机理.方法:大鼠右后足跖皮下注射2%角叉菜胶诱导急性炎症模型,分别采用电针,消炎痛和罗非昔布治疗.采用毛细管放大法,放射免疫分析法和Western Blotting法分别检测足跖肿胀度,血清PGE2含量和足爪炎症组织及脾脏组织COX-1/-2蛋白表达水平.结果:电针可有效抑制角叉菜胶致炎大鼠足跖肿胀,尤以造模后3 h最为显着;与模型对照组比较,电针可有效降低血清中的PGE2含量;电针对环氧合酶蛋白表达无显着影响.结论:电针对角叉菜胶致炎大鼠急性炎症具有良好的抗炎效应,并通过抑制血清中PGE2含量控制炎症进一步的发展.在急性炎症过程中,电针尚未对环氧合酶蛋白表达起干预作用,其具体的抗炎机制还有待于进一步深入研究.

㈩ 我现在要做膝关节骨性关节炎造模实验，需将兔子的膝关节捆绑固定，使其关节处于伸直位，怎么才能固定好

找一块木板，四角钉上钉子。然后让兔子背朝下，把四脚拉直用绳子系在钉子上，就可以了。我们实验时就是这样做的。材料简单，收效还好。奥，提醒一下：兔子的腿一定要拉直~