目前最常用的原生质体融合方法

A. 原生质体融合的所有方法方法

现在被广泛采用并证明行之有效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法、高Ca、高pH值法和电融合法。

B. 原生质体融合常用什么方法，急用

电击，PEG。高PH-高Ca离子

C. 原生质体融合的诱导融合法是怎样做的

诱导融合的方法大体可以分为物理的和化学的两类。前者是利用显微操作、灌流吸管、离心或振动等机械以促使原生质体融合，这种方法目前多与诱导剂结合起来使用，化学融合法是用不同的试剂作诱导剂，促使原生质体融合，形成异核体（heterokaryons）。

目前常用的较有效的是高pH—高钙法、NaNOsubscript3subscript和聚二乙醇法。

图3-1：原生质体融合方法

D. 细胞融合的方法有哪些

一、细胞融合的方法有三种：生物方法、化学方法、物理方法。
二、细胞融合也称细胞杂交 , 是指细胞通过介导和培养, 在离体条件下用人工方法将不同种的细胞通过无性方式融合( 合并) 成一个核或多核的杂合细胞的过程。体细胞融合后可形成四倍体或多倍体细胞，由此形成的杂交细胞，其特性会有很大的变化。
三、化学诱导融合1.盐类融合法。此法是应用最早的诱导原生质体融合的方法。盐类融合剂对原生质体的破坏小。今后研究应提高其融合率 ,使其对液泡化发达的原生质体能够诱发融合。2高钙和高pH值融合法。高 Ca2+和高pH值可以诱发融合。提高该方法的使用范围是亟待解决的问题。3、聚乙二醇融合法(PEG法) 。1974年发现的聚乙二醇(PEG)使不同科属的植物原生质体之间都可以融合，融合率可达30%。聚乙二醇是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子量的多聚体。PEG可与水分子借氢键结合，导致细胞脱水而发生质膜结构的变化，从而引起细胞融合。为了发挥PEG促进细胞融合的效力，必须采用较高的浓度(40%～50%，分子量为6000)，但PEG在高浓度下，细胞可能因脱水而受到显着的破坏。因此，选择合适的分子量、浓度及作用时间是PEG融合技术的关键。影响原生质体融合的因素很多。特别是环境中的阳离子存在，融合时的pH 也对原生质体融合有较明显的影响。一般来讲钙、镁离子有助于融合。如有钙离子存在时，可得到较高的融合率。但在缺乏钙离子时，若pH 较低，融合频率也较高。这是因为钙离子和带负电荷的PEG与细胞膜表面分子相互作用，使原生质体带电，彼此易于附着发生凝集所致。PEG诱导细胞融合由于具有容易制备和控制、活性稳定、使用方便等特点，在细胞融合领域取得了可喜的成绩，大量的研究仍采用此法。虽然PEG作为融合剂有很多成功的报道，但存在着对细胞损伤大、残存有毒性、融合率较底及经验性大等缺陷。
四、 物理诱导融合1。细胞电融合技术细胞电融合是以脂质膜和脂质一蛋白质膜的电学性质为基础的，以双向电泳和电子击穿细胞质膜的联合作用为手段，和细胞电注射构成一对互补技术。在短时间强电场的作用下，细胞膜发生可逆性电击穿(Reverisb leb reakdown)，瞬时失去其高电阻和低通透特性，然后在数分钟后恢复原状。当可逆电击穿发生在两个相邻细胞的接触区时，即可诱导他们的膜相互融合，从而导致细胞融合。细胞融合分为两步：第一步是建立细胞间接触(cell-to-cell contact) ； 第二步，接受区膜结构受扰动而紊乱，然后恢复并融合。根据其诱导细胞接触的性质，分为特异性和非特异性两大类。非特异性细胞电融合法是指在进行细胞电融合时，无法排除亲本细胞的自体融合而只进行双亲本间的细胞杂交融合。主要原因是细胞间的相互接触是无选择性的，是非特异性细胞聚集。非特异性电融合技术包括细胞物理聚集电融合法和细胞化学聚集电融合法。细胞融合所必需的两个步骤为：①细胞间接触；②接触区的膜结构受到瞬间扰动而导致融合。只要其中的任意一步有特异性，就能形成特异性的细胞融合。 2.激光诱导法。激光诱导细胞融合术是利用激光微束对相邻细胞接触区的细胞膜进行破坏(或扰动)，可将两个不同特性、不同大小的细胞在显微镜下实现融合。即利用光镊捕捉并拖动一个细胞使之靠近另一个细胞并紧密接触，然后对接触处进行脉冲激光束处理，使质膜发生光击穿，产生微米级的微孔。这样，由于质膜上微孔的可逆性，细胞开始变形融合，最终成为一个细胞。使用此技术时，使细胞接触的方法可用①光俘虏法；②用低浓度的融合剂PEG (5% )使细胞聚法。目前，最新颖的方法是利用激光光阱建立两细胞间接触，即光镊利用激光高斯光束光场的梯度力把细胞从光束边缘拉向光束中间，在光斑直径与光波波长尺度相比拟时，指向束腰的轴向梯度力要大于沿光束方向的散射力，该梯度力把细胞竖直地拉到激光束腰下方处，从而实现对细胞的操作。 

E. 原生质体融合的步骤

原生质体融合的程序包括：①标记菌株的筛选；②原生质体的制备和再生（过程见8.1.1）；③原生质体的融合；④融合子遗传标记的筛选；⑤融合子的鉴定。

8.2.2.1 标记菌株的筛选

进行原生质体融合的亲本需要携带遗传标记，以便于融合后重组子的筛选。常用营养缺陷型和抗性作为遗传标记，也可以采用热致死、孢子颜色、菌落形态作为遗传标记。遗传标记的选择要根据实际实验目的来确定。如果原生质体融合的目的是进行遗传分析，那么应该采用带有隐性基因的营养缺陷型或抗性菌株；如果从育种角度进行原生质体融合，由于大多数营养缺陷型菌株都会影响代谢产物的产量，所以在选择营养缺陷型标记时，应尽量避免采用对正常代谢有影响的缺陷型菌株。

8.2.2.2 原生质体的融合

原生质体融合就是把亲株的原生质体在高渗条件下进行混合。在原生质体融合中，诱导融合的方法主要有化学法（PEG促融法）、物理法（包括电融合和激光诱导融合法等）。

仅仅将原生质体等量地混合在一起融合频率通常是很低的，只有通过加入融合剂例如表面活性剂聚乙二醇（PEG）或特定物理措施例如电击和激光诱导等，融合频率才会提高。

（1）PEG促融法：其诱导融合的可能机制是PEG带有负电荷的醚键，与带负电荷的原生质体相遇后，在Ca²⁺等阳离子作用下形成共同的静电荷，从而促进异源原生质体的黏着和接合，常用的PEG是相对分子量为4000和6000的两种。在有钙离子存在的条件下融合时为碱性能刺激产生最大的融合频率，这是因为pH值能够改变体系的电性状态，从而影响原生质体的融合。PEG既是融合剂又是渗透压稳定剂，浓度低于20%会使原生质体破裂而失去稳定性，浓度过高又会引起原生质体收缩而降低融合频率，因此，融合时PEG的最终浓度常采用30%～40%。由于PEG的加入，原生质体间的黏着强烈地发生，融合就能较长时间有效地进行，所以PEG的处理时间不得太长。此外，PEG在高浓度下有毒，因此也要求融合时间不宜过长。

（2）电融合法：其原理是在短时间强电场的作用下，当原生质体被置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体，使原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串，原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲，细胞膜发生可逆性电击穿，瞬时失去其高电阻和低通透性，然后在数分钟内恢复原状。当可逆电击穿发生在两个相邻细胞的接触区时，即可诱导它们的膜相互融合，从而导致细胞融合。电融合是以空间定向，时间同步的可控方式来实现原生质体的融合，从而改变了PEG融合的随机过程。该法的优点是融合频率高，无化学毒性，操作简便，可在显微镜下进行，具有极强的可操控性。

（3）激光融合法：其原理是先让细胞或原生质体紧密贴在一起，再用高峰值功率密度激光照射接触处，从而使质膜击穿或产生微米级的微孔，质膜上产生微孔是一个可逆的过程，质膜恢复的过程中细胞连接微孔的表面曲率很高，使细胞处于高张力状态，此时细胞由哑铃形逐渐变为圆球状，进而细胞发生融合。该法的优点是毒性小，损伤小，具高度选择性；缺点是操作技术难度大，所需设备昂贵复杂，因此很难被推广应用。

8.2.2.3 融合子遗传标记的筛选

原生质体融合后，融合子的选择方法是使原生质体融合技术得以应用的关键。以A和B细胞融合来说，可能会形成AA，AB及BB 三种融合形式。而要筛选出的是AB，即具有A细胞核B细胞的两个遗传标记就可以确定其为融合子。因此，就可以通过A和B细胞所分别具有的选择性遗传标记，在选择培养基上挑出融合子。但是，由于原生质体融合后会产生两种情况，一种是真正的融合，即产生杂合二倍体或单倍重组体；另一种是暂时的融合，形成异核体。两者均可以在选择培养基上生长，一般前者较稳定，而后者则是不稳定的，会分离成亲本类型，有的甚至可以以异核状态转接几代。因此，要获得真正的融合子，必须在融合原生质体再生后，进行几代自然分离、选择，才能加以确定。融合子的筛选是融合过程的关键。下面列举几种常见的筛选方法。营养缺陷型标记筛选融合子、抗药性标记筛选融合子、荧光色素标记筛选融合子、灭活原生质体标记筛选融合子、利用双亲对碳源利用不同而筛选融合子和利用某些特殊生理特征作为标记筛选融合子等方法筛选。

8.2.2.4 融合子的鉴定

融合子筛选出后，还要对其进行鉴定。常用的鉴定方法有菌体或孢子形态、大小的比较，同工酶电泳谱带的比较，酶活性的测定，DNA含量的比较，对结构蛋白及非基因直接编码的次生代谢产物的分析，对染色体稳定性的研究等。刘玲等（2007）采用酯酶同工酶电泳对f1和f2融合子进行鉴定，融合子有不同于亲本的新酶带出现，融合子菌落呈现新的性状，菌落形态、颜色、菌丝形状都与亲本部分性状相似，又存在差异，并且菌株生长速度也不同于双亲本，在生理生化性状上与亲本存在明显的差异，这说明融合子f1、f2是融合双亲性状的新菌株。

F. 植物是怎样进行原生质体培养与体细胞杂交的

植物原生质体是指植物细胞除去细胞壁后质膜包围的裸露细胞原生质培养是给予游离原生质体适当的培养条件，使之重新形成细胞壁，并分裂增殖，直至分化形成再生植株的过程不同物种的原生质体融合多采用电融法和化学融合法在原生质体培养过程中更容易产生变异，其中包括抗病性变异，通过抗病体细胞突变体筛选，可获得抗病新种质，用于抗病育种原生质体可作为基因工程的受体，通过脂质体介导法PEG(聚乙二醇)融合法等，将外源基因导入植物细胞

通过原生质体融合(protoplastfusion)创造杂种的方法称为体细胞杂交(somatichybridization)由于不经过有性过程，避过了有性杂交不亲和的生殖障碍，适于转移远缘种属的抗病基因例如，可以利用体细胞杂交的方法，将野生欧白芥或亚麻芥对黑斑病(Alternariabrassicae)的抗病性导入甘蓝，得到高度抗病的体细胞杂种(Hansen等，1997;Sigareva等，1999)用芜菁和抗细菌性软腐病的甘蓝作亲本，经原生质体融合，获得了体细胞杂种，有的个体抗病性甚至高于抗病亲本(Ren等，2000)连勇等(2004)应用原生质体电融合技术获得了茄子近缘野生种与栽培种(六叶茄)的种间体细胞融合四倍体再生植株，带有抗病基因，部分植株能正常结果

G. 诱导原生质体融合的方法

诱导原生质体融合的过程中可用的方法有三种：物理法、化学法、生物法。
将不同植物体细胞放在一起培养，必须通过一定的技术手段进行人工诱导。诱导方法有物理法和化学法两大类。
物理法就是利用离心、振动、电刺激等促使原生质体融合；化学法是用聚乙二醇等试剂作为诱导剂诱导细胞的原生质体融合，聚乙二醇简称为PEG；诱导动物细胞融合时还可以用生物法，即用灭活的病毒进行诱导，重压不能促使原生质体的融合。
植物体细胞杂交,又称原生质体融合是指将植物不同种、属，甚至科间的原生质体通过人工方法诱导融合，然后进行离体培养，使其再生杂种植株的技术。植物细胞具有细胞壁，未脱壁的两个细胞是很难融合的，植物细胞只有在脱去细胞壁成为原生质体后才能融合，所以植物的细胞融合也称为原生质体融合。

H. 什么叫原生质体融合,他的基本操作是怎样的,此法在育种工作中有何重要性

原生质体是去掉细胞壁的植物细胞，原生质体融合就是植物细胞的融合。常用的方法有振动，电击，离心，聚乙二醇（PEG）处理等。先用纤维素酶和果胶酶处理原植物细胞，得到原生质体再在培养液中使用上述方法进行融合。这种方法的原理是细胞的流动性。当细胞核完成融合，并且重组细胞重生出细胞壁后，就表明杂种细胞已成功得到。之后利用植物的组织培养技术用得到的细胞就可以培养出完整个体，得到一株具有新形状的植物个体。
植物细胞融合技术的发明打破了生物物种之间的界限，克服了远缘杂交不亲和的问题，为培养兼有两种物种优良性状的新物种提供了可能。不过由于人类还不完全了解遗传物质的调控机理，一些杂种植物并不能按人们希望的那样表达性状。

希望楼主采纳，这些字是我一个一个敲的。

I. 原生质体融合的高pH—高钙法是怎样做的

高pH—高钙法是受动物细胞融合研究的启发而产生的。用pH9.510.5、大于0.03molL浓度的Casuperscript2+superscript溶液处理原生质体，融合效果较好。高pH能导致质膜表面离子特性的改变，增加了质膜的流动性，有利于原生质体的融合。钙能稳定原生质体，也起联系融合的作用。

具体处理方法是：在原生质体沉淀中加入含有0.05molL：CaClsubscript2subscript·2Hsubscript2subscriptO和0.4molL甘露醇，pH调整到10.5，在37摄氏度下保温0.5h，可使原生质体融合率达到10%左右。

J. 原生质体融合的原理

两个具有不同遗传性状的细胞，采用适宜的水解酶溶解细胞壁后，在自发情况或融合剂作用下，两个原生质体接触，融合成为异核体，经过繁殖复制进一步核融合，形成杂合二倍体，再经过染色体交换产生重组体，达到基因重组的目的，并在适宜的条件下再生出细胞壁，对重组体进行生产性能、生理生化和遗传特性分析获得所需重组子。其中，细胞在用酶分离原生质体过程中发生的原生质体自然融合现象又称自发融合；而分离原生质体以后，通过加入诱导剂或利用其他方法诱导不同亲本原生质体发生融合的过程又称诱导融合。理论上讲原生质体融合可在包括种内、种间、属间、科间甚至是界间的任何原生质体间进行，它不仅可以突破物种间的生殖隔离，创造远缘杂种；还可以使双亲的细胞质基因结合在一起，从而达到改良由胞质基因控制的性状的目的。