细胞工程常用的组织分离方法

❶ 细胞分离

体外培养（in vitro culture）包括：组织培养（tissue culture）、细胞培养（cell culture）、器官培养（organ culture）。顾名思义，就是将活体结构成分（如活体组织、活体细胞或者活体器官等）从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长发育的方法。广义组织培养与体外培养同义。

体外培养已经历了约一百年的发展历史，但发展初期进程比较缓慢，没有引起很多学者的重视。直到上世纪50年代后期，体外培养技术才广泛应用于生物学研究的各个领域，使这项技术得到飞速发展。现在体外培养已成为细胞工程、基因工程、抗体工程的重要组成部分。

细胞培养指从生物机体取出部分组织分散成单个细胞或直接从机体取出单个细胞，也可把体外培养细胞分散成单个细胞在体外条件下培养，细胞能继续存活与增殖。培养过程中细胞不再形成组织。

发展与完善细胞培养技术围绕防止污染、改进培养方法、设计新型培养容器、设计不同的培养液等几个方面进行。

1885年Roux温生理盐水培育鸡胚组织；

1903年Jolly，1906年Beebe等发明了盖片悬滴培养；

1907年Harrison培养蛙胚神经成功，开始创建盖片凹玻璃悬滴培养法；
1910、1912年Carrel采用无菌操作、更新培养基、传代，完善了悬滴培养法；
1924年Maximow采用双盖片悬滴培养法；
1923年Carral设计创立了卡氏瓶培养法，用此法可根据需要随时更换培养液，既有利于组织不断生长，又可以运用不同种类的营养液培养不同的细胞，极大地推动了当时组织培养研究。

Earle等加以改进，使大量细胞能直接生长于玻璃瓶壁上，培养了正常细胞与肿瘤细胞的细胞株。至此大多数研究人员都采用培养瓶培养细胞。

组织培养从二十世纪40年代起迅速发展,在培养容器、培养基和培养技术等方面出现了很多革新。

在培养容器方面, 由简单的用试管、旋转管培养，发展到多种培养瓶培养，近年来，塑料瓶、皿、多孔培养板的使用已日趋普遍。

在培养基方面，从50年代初，Parke、Eagle等设计出合成培养基后，从纯天然培养基到合成培养基、从鸡胚浸出液发展到动物血清（促细胞生长物），直至60年代设计出无血清培养基。

首先反映在设计不同种类的缓冲盐溶液，以用来培养不同的细胞和洗涤细胞。Earle在1948年设计了含有碳酸氢钠等盐类的Earle氏盐溶液，Hank’s在1949年设计了Hank’s氏盐溶液。

在培养技术方法方面，革新进展更为迅猛，Earle、Dulbecco等于1943年创建单层细胞培养法，首建长期传代的L-细胞系。
1948年Sanford创建单细胞分离培养法，获L-细胞纯系。
1951年Gey首建人肿瘤细胞——Hela细胞系。
1961年Hayflick首建人二倍体细胞系25种，开辟了应用新方向。
从50年代末开始，组织培养技术应用进入了一个繁盛的阶段，广泛应用于生物学和医学研究各个领域。
诱变建立遗传缺陷细胞株、杂交瘤技术制备单抗、发展细胞大量培养技术、利用重组技术构建工程细胞株，已成为生物工程的重要生产手段。

在连续灌注培养工艺方面，美国Ohashi,Ryo等人2001年报道采用2L一次性生物反应器灌注培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体，以Becton Dickenson Cell Mab+10%胎牛血清+1％聚醚F-68为培养基，最高活细胞密度超过1×107cells/ml；2001年瑞士Heine, Holger等人用带超声细胞分离器(UCS)的连续灌注搅拌罐生物反应器培养鼠杂交瘤细胞生产单克隆抗体，稳态培养时活细胞密度超过2×107cells/ml；2004年德国Thomas等人在1L搅拌罐生物反应器中培养rCHO细胞生产人MUC-1糖蛋白，采取葡萄糖浓度限制的高产率灌注工艺减少有害代谢物，代谢转向TCA循环增加，活细胞密度保持在(1～2)×107cells/ml。

在流加悬浮培养工艺方面，美国麻省理工Xie Liang等人2000年报道在2L生物反应器中流加培养杂交瘤细胞，通过营养控制降低氨和乳酸的比生成速率，补充培养基包括营养成分、胎牛血清和痕量金属，最大活细胞密度达到1.7×107cells/mL。

细胞分离就是通过物理、生物、化学的方法，将生物组织分离为单细胞分散系的过程。
一般动物组织经培养，其细胞会延培养基表面平铺生长，自行达到细胞分离的目的。还可用胶原酶处理分离。
而植物组织培养后会形成愈伤组织，要用化学方法才能获得单个细胞（一般用纤维素酶）。

❷ 细胞工程的研究对象及方法有哪些

细胞工程是生物工程的一个重要方面。总的来说，它是应用细胞生物学和分子生物学的理论和方法，按照人们的设计蓝图，进行在细胞水平上的遗传操作及进行大规模的细胞和组织培养。当前细胞工程所涉及的主要技术领域有细胞培养、细胞融合、细胞拆合、染色体操作及基因转移等方面。通过细胞工程可以生产有用的生物产品或培养有价值的植株，并可以产生新的物种或品系。
细胞工程(Cell engineering)：

是指应用现代细胞生物学、发育生物学、遗传学和分子生物学的理论与方法，按照人们的需要和设计，在细胞水平上的遗传操作，重组细胞结构和内含物，以改变生物的结构和功能，即通过细胞融合、核质移植、染色体或基因移植以及组织和细胞培养等方法，快速繁殖和培养出人们所需要的新物种的生物工程技术。

细胞工程与基因工程一起代表着生物技术最新的发展前沿，伴随着试管植物、试管动物、转基因生物反应器等相继问世，细胞工程在生命科学、农业、医药、食品、环境保护等领域发挥着越来越重要的作用。

21世纪合成生物学的发展，采用计算机辅助设计、DNA或基因合成技术，人工设计细胞的信号传导与基因表达调控网络，乃至整个基因组与细胞的人工设计与合成，从而刷新了基因工程与细胞工程技术，并将带来生物计算机、细胞制药厂、生物炼制石油等技术与产业革命。

❸ 生物技术的细胞工程

关于细胞工程的定义和范围还没有一个统一的说法，一般认为，细胞工程是根据细胞生物学和分子生物学原理，采用细胞培养技术，在细胞水平进行的遗传操作。细胞工程大体可分染色体工程、细胞质工程和细胞融合工程。
1、细胞培养技术
细胞培养技术是细胞工程的基础技术。所谓细胞培养，就是将生物有机体的某一部分组织取出一小块，进行培养，使之生长、分裂的技术。细胞培养又叫组织培养。近二十年来细胞生物学的一些重要理论研究的进展，例如细胞全能性的揭示，细胞周期及其调控，癌变机理与细胞衰老的研究，基因表达与调控等，都是与细胞培养技术分不开的。
体外细胞培养中，供给离开整体的动植物细胞所需营养的是培养基，培养基中除了含有丰富的营养物质外，一般还含有刺激细胞生长和发育的一些微量物质。培养基一般有固态和液态两种，它必须经灭菌处理后才可使用。此外，温度、光照、振荡频率等也都是影响培养的重要条件。
植物细胞与组织培养的基本过程包括如下几个步骤：
第一步，从健康植株的特定部位或组织，如根、茎、叶、花、果实、花粉等，选择用于培养的起始材料（外植体）。
第二步，用一定的化学药剂（最常用的有次氯酸钠、升汞和酒精等）对外植体表面消毒，建立无菌培养体系。
第三步，形成愈伤组织和器官，由愈伤组织再分化出芽并可进一步诱导形成小植株。
动物细胞培养有两种方式。一种叫非贴壁培养：也就是细胞在培养过程中不贴壁， 条件较为复杂， 难度也大一些，但是容易同时获得大量的培养细胞。这种方法一般用于淋巴细胞、肿瘤细胞和一些转化细胞的培养。另一种培养方式是贴壁培养：也称为细胞贴壁，贴壁后的细胞呈单层生长，所以此法又叫单层细胞培养。大多数哺乳动物细胞的培养必须采用这种方法。
动物细胞不能采用离体培养，以人的皮肤细胞培养为例，动物细胞培养的主要步骤如下：
第一步，在无菌条件下，从健康动物体内取出适量组织，剪切成小薄片。
第二步，加入适宜浓度的酶与辅助物质进行消化作用使细胞分散。
第三步，将分散的细胞进行洗涤并纯化后，以适宜的浓度加在培养基中，37℃下培养，并适时进行传代。
在细胞培养中，我们经常使用一个词——克隆。克隆一词是由英文clone音译而来，指无性繁殖以及由无性繁殖而得到的细胞群体或生物群体。细胞克隆是指细胞的一个无性繁殖系。自然界早已存在天然的克隆，例如，同卵双胞胎实际上就是一种克隆。
基因工程中，还有称为分子克隆（molecular cloning）的，是科恩等在 1973年提出的。分子克隆发生在DNA分子水平上，是指从一种细胞中把某种基因提取出来作为外源基因，在体外与载体连接，再将其引入另一受体细胞自主复制而得到的DNA分子无性系。
2、细胞核移植技术
由于克隆是无性繁殖，所以同一克隆内所有成员的遗传构成是完全相同的，这样有利于忠实地保持原有品种的优良特性。人们开始探索用人工的方法来进行高等动物克隆。哺乳动物克隆的方法主要有胚胎分割和细胞核移植两种。其中，细胞核移植是发展较晚但富有潜力的一门新技术。
细胞核移植技术属于细胞质工程。所谓细胞核移植技术，是指用机械的办法把一个被称为“供体细胞”的细胞核（含遗传物质）移入另一个除去了细胞核被称为“受体”的细胞中，然后这一重组细胞进一步发育、分化。核移植的原理是基于动物细胞的细胞核的全能性。
采用细胞核移植技术克隆动物的设想，最初由一位德国胚胎学家在1938年提出。从1952年起，科学家们首先采用两栖类动物开展细胞核移植克隆实验，先后获得了蝌蚪和成体蛙。1963年，我国童第周教授领导的科研组，以金鱼等为材料，研究了鱼类胚胎细胞核移植技术，获得成功。到1995年为止，在主要的哺乳动物中，胚胎细胞核移植都获得成功，但成体动物已分化细胞的核移植一直未能取得成功。
1996年，英国爱丁堡罗斯林研究所，伊恩?维尔穆特研究小组成功地利用细胞核移植的方法培养出一只克隆羊——多利，这是世界上首次利用成年哺乳动物的体细胞进行细胞核移植而培养出的克隆动物。。
在核移植中，并不是所有的细胞都可以作为核供体。作为供体的细胞有两种：一种是胚胎细胞，一种是某些体细胞。
研究表明，卵细胞、卵母细胞和受精卵细胞都是合适的受体细胞。
2000年6月，我国西北农林科技大学利用成年山羊体细胞克隆出两只“克隆羊”，这表明我国科学家也掌握了哺乳动物体细胞核移植的尖端技术。
核移植的研究，不仅在探明动物细胞核的全能性、细胞核与细胞质关系等重要理论问题方面具有重要的科学价值，而且在畜牧业生产中有着非常重要的经济价值和应用前景。
3、细胞融合技术
细胞融合技术属于细胞融合工程。细胞融合技术是一种新的获得杂交细胞以改变细胞性能的技术，它是指在离体条件下，利用融合诱导剂，把同种或不同物种的体细胞人为地融合，形成杂合细胞的过程。细胞融合术是细胞遗传学、细胞免疫学、病毒学、肿瘤学等研究的一种重要手段
动物细胞融合的主要步骤是：
第一步，获取亲本细胞。将取样的组织用胰蛋白酶或机械方法分离细胞，分别进行贴壁培养或悬浮培养。
第二步，诱导融合。把两种亲本细胞置于同一培养液中，进行细胞融合。动物细胞的融合过程一般是：两个细胞紧密接触→细胞膜合并→细胞间出现通道或细胞桥→细胞桥数增加扩大通道面积→两细胞融合为一体。
植物细胞融合的主要步骤是：
第一步，制备亲本原生质体。
第二步，诱导融合。
微生物细胞的融合步骤与植物细胞融合基本相同。
从20世纪70年代开始，已经有许多种细胞融合成功，有植物间、动物间、动植物间甚至人体细胞与动植物间的成功融合的新的杂交植物，如 “西红柿马铃薯”、“拟南芥油菜”和“蘑菇白菜”等。（图4-36是利用细胞融合培育杂交植物）从目前的技术水平来看，人们还不能把许多远缘的细胞融合后培养成杂种个体，尤其是动物细胞难度更大。
酶工程、发酵工程与蛋白质工程
1、酶工程酶工程是指利用酶、细胞或细胞器等具有的特异催化功能，借助生物反应装置和通过一定的工艺手段生产出人类所需要的产品。它是酶学理论与化工技术相结合而形成的一种新技术。
酶工程，可以分为两部分。一部分是如何生产酶，一部分是如何应用酶。
酶的生产大致经历了四个发展阶段。最初从动物内脏中提取酶，随着酶工程的进展，人们利用大量培养微生物来获取酶，基因基因工程诞生后，通过基因重组来改造产酶的微生物，近些年来，酶工程又出现了一个新的热门课题，那就是人工合成新酶，也就是人工酶。
酶在使用中也存在着一些缺点。如遇到高温、强酸、强碱时就会失去活性，成本高，价钱贵。实际应用中酶只能使用一次等。利用酶的固定化可以解决这些问题，它被称为是酶工程的中心。
60年代初，科学家发现，许多酶经过固定化以后，活性丝毫未减，稳定性反而有了提高。这一发现是酶的推广应用的转折点，也是酶工程发展的转折点。如今，酶的固定化技术日新月异。它表现在两方面：
一是固定的方法。目前固定的方法有四大类：吸附法、共价键合法、交联法和包埋法。
二是被固定下来的酶，具有多种酶，能催化一系列的反应。
与自然酶相比，固定化酶和固定化细胞具有明显的优点：
1、可以做成各种形状，如颗粒状、管状、膜状，装在反应槽中，便于取出，便于连续、反复使用；
2、稳定性提高，不易失去活性，使用寿命延长；
3、便于自动化操作，实现用电脑控制的连续生产。
如今已有数十个国家采用固定化酶和固定化细胞进行工业生产，产品包括酒精、啤酒、各种氨基酸、各种有机酸以及药品等等。
2、发酵工程
现代的发酵工程。又叫微生物工程，指采用现代生物工程技术手段，利用微生物的某些特定的功能，为人类生产有用的产品，或直接把微生物应用于工业生产过程。
发酵是微生物特有的作用，几千年前就已被人类认识并且用来制造酒、面包等食品。20世纪20年代主要是以酒精发酵、甘油发酵和丙醇发酵等为主。20世纪40年代中期美国抗菌素工业兴起，大规模生产青霉素以及日本谷氨酸盐（味精）发酵成功，大大推动了发酵工业的发展。
20世纪70年代，基因重组技术、细胞融合等生物工程技术的飞速发展，发酵工业进入现代发酵工程的阶段。不但生产酒精类饮料、醋酸和面包，而且生产胰岛素、干扰素、生长激素、抗生素和疫苗等多种医疗保健药物，生产天然杀虫剂、细菌肥料和微生物除草剂等农用生产资料，在化学工业上生产氨基酸、香料、生物高分子、酶、维生素和单细胞蛋白等。
从广义上讲，发酵工程由三部分组成：上游工程，发酵工程和下游工程。其中上游工程包括优良种株的选育，最适发酵条件（pH、温度、溶解氧和营养组成）的确定，营养物的准备等。发酵工程主要指在最适发酵条件下，发酵罐中大量培养细胞和生产代谢产物的工艺技术。下游工程指从发酵液中分离和纯化产品的技术。
发酵工程的步骤一般包括：
第一步，菌种的选育。
第二步，培养基的制备和灭菌。
第三步，扩大培养和接种。
第四步，发酵过程。
第五步，分离提纯。
发酵工程在医药工业、食品工业、农业、冶金工业、环境保护等许多领域得到广泛应用。
3、蛋白质工程
在现代生物技术中，蛋白质工程是在20世纪80年代初期出现的。蛋白质工程是指在深入了解蛋白质空间结构以及结构与功能的关系，并在掌握基因操作技术的基础上，用人工合成生产自然界原来没有的、具有新的结构与功能的、对人类生活有用的蛋白质分子。
蛋白质工程的类型主要有两种：
一是从头设计，即完全按照人的意志设计合成蛋白质。从头设计是蛋白质工程中最有意义也是最困难的操作类型，目前技术尚不成熟，已经合成的蛋白质只是一些很小的短肽。
二是定位突变与局部修饰，即在已有的蛋白质基础上，只进行局部的修饰。这种通过造成一个或几个碱基定位突变，以达到修饰蛋白质分子结构目的的技术，称为基因定位突变技术。
蛋白质工程的基本程序是：首先要测定蛋白质中氨基酸的顺序，测定和预测蛋白质的空间结构，建立蛋白质的空间结构模型，然后提出对蛋白质的加工和改造的设想，通过基因定位突变和其它方法获得需要的新蛋白质的基因，进而进行蛋白质合成。（图4-37）
由于蛋白质工程是在基因工程的基础上发展起来的，在技术方面有很多同基因工程技术相似的地方，因此蛋白质工程也被称为第二代基因工程。
蛋白质工程为改造蛋白质的结构和功能找到了新途径，而且还预示人类能设计和创造自然界不存在的优良蛋白质的可能性，从而具有潜在的巨大社会效益和经济效益。

❹ 一、简述干细胞分离纯化的主要方法 二、简述干细胞体内体外的检测方法

ES细胞的分离方法：
A: 免疫学方法
利用ES细胞所具有的特殊标记，借助荧光细胞分离器从单细胞悬液分离ES细胞。
B:免疫外科学方法
利用囊胚腔对抗体的不通透性，通过抗体与补体结合后所产生的对其它细胞的毒性杀伤作用，除去滋养层细胞，保留ES细胞。
C：组织培养法
胚胎用外源激素处理后，所分化出的胚泡进行体外培养，其中的ES细胞垂直向上生长，呈卵圆柱状，可显微镜下检出另培养。
D：显微外科学法
用显微操作系统直接从胚泡中吸取ES细胞。

❺ 两种贴壁细胞共同培养后怎样分离

两种贴壁细胞共同培养后怎样分离
细胞培养（cell culture）细胞培养的含义，简单地说即是把来自机体的组织经分散成为单个细胞，放在类似于体内的体外环境中生存，使其不断生长、繁殖或传代，借以观察细胞的生长、繁殖、衰老等生命现象。还可以利用细胞进行细胞工程与细胞癌变等重大问题的研究。细胞培养也是研究病毒与研制疫苗的基础技术。因此细胞培养技术在遗传学、免疫学、肿瘤学、病毒学、分子生物学等领域已得到广泛的应用。细胞培养分为原代培养和传代培养，下面介绍原代培养和传代培养的基本概念。

原代培养 通过组织块直接长出单层细胞或用酶或机械方法将组织分散成单个细胞开始培养，在首次传代前的培养可认为是原代培养。原代培养最大的优点是，组织和细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大变化，在一定程度上能反映体内状态。特别是在细胞培养会合时，原代培养的某些特殊功能表达尤为强烈。在这样的培养阶段能更好地显示与亲体组织紧密结合的形态学特征。在供体来源充分、生物学条件稳定的情况下，采用原代培养做各种实验，如药物测试、细胞分化等，效果很好。但应注意，原代培养组织是由多种细胞成分组成的，比较复杂。即使全为同一类型的细胞，如上皮细胞或成纤维细胞，也仍具有异质性，在分析细胞生物学特性时比较困难。其次，由于供体的个体差异及其他一些原因，细胞群生长效果有时也不一致。

原代培养也是建立各种细胞系（株）必经的阶段。假如原代培养能够维持几小时甚至更长，即可进行进一步筛选。有的细胞具有继续增殖能力，有的细胞类型只是存活而不增殖，而另外一些细胞只是在特殊条件下应用而不存活，因而细胞类型的分布将会改变。在单层培养的情况下，瓶底全部铺满细胞，达到会合以后，对密度有依赖性的细胞则逐渐减少生长，而失去密度依赖敏感性的细胞则生长增加，天然或自发转化的细胞则过度生长。借助于频繁传代，保持细胞低密度生长，有利于保存细胞的正常表型（如小鼠成纤维细胞）。而自发转化则倾向于高细胞密度的过度生长。

传代培养 原代培养形成的单层细胞汇合以后，需要进行分离培养，否则细胞会因生成空间不足或由于细胞密度过大引起营养枯竭，都将影响细胞的生长，这一程序常称为传代或传代培养。原代培养在首次传代时即为细胞系，能连续培养下去的为连续细胞系；不能连续培养的为有限细胞系。通常，传代培养是指扩大培养，也就是将一份细胞一分为二或者一分为三进行培养等。但严格说来，不论稀释与否，将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶即称为传代或传代培养。可以理解，在任何时候，细胞从一个瓶子接种到另一个瓶子时总会丢失一部分，因此，在客观上细胞必定有所稀释。

传代代数这一概念常常容易同“增殖代数”相混淆。细胞“一代”一词仅指从细胞接种到分离再培养时的一段时间。如某一细胞系为第153代，即指该细胞系已传代153次。它与细胞“增殖代数”（细胞世代或倍增）不同，在细胞一代中，细胞约能倍增3～6次。由此可见，细胞代数与增殖代数相关，确切的代数则依赖于细胞株和培养条件的不同而异。但构成一个细胞系的生长条件必须是同样的，因而细胞系应该表达近似的增殖代数或倍增代数。

❻ 细胞生物学中常用的实验技术或者方法

第二节 细胞生物学实验方法与技术
当前细胞生物学与医药保健事业联系的较为紧密的热点问题主要有以下几种：1）真核细胞基因结构及其表达调控；2）细胞膜、膜系、受体与信号传递研究；3）细胞生长、分化、衰老、癌变、死亡，尤其是程序性细胞死亡的研究；4) 细胞工程，包括基因工程及体细胞核移植的研究。
一、细胞培养常用方法
1、细胞原代培养（primay culture） 又称初代培养，即直接从机体取下细胞、组织、或器官、让他们在体外维持与生长。原代细胞的特点是细胞或组织刚离开机体，他们的生物状态尚未发生很大的改变，一定程度上可反映他们在体内的状态，表现出来源组织或细胞的特性，因此用于药物实验尤其是药物对细胞活动、结构、代谢、有无毒性或杀伤作用等研究是极好工具。常用的原代培养方法有组织快培养法及消化培养法。前者方法简单，细胞也较易生长，尤其是培养心肌有时能观察到心肌组织块的搏动。细胞从组织块外长并铺满培养皿或培养瓶后即可进行传代。2、细胞的传代培养 当细胞生长至单层汇合时，便需要进行分离培养否则会因无繁殖空间、营养耗竭而影响生长，甚至整片细胞脱离基质悬浮起来直至死亡。为此当细胞达到一定密度时必须传代或再次培养，目的是借此繁殖更多的细胞，另一方面是防止细胞的退化死亡。
二、器官培养方法
器官培养（organ culture）是指用特殊的装置使器官、器官原基或它们的一部分在体外存活，幷保持其原有的结构和功能。器官培养可模拟体内的三维结构，用于观察组织间的相互反应、组织与细胞的分化以及外界因子包括药物对组织细胞的作用。
器官培养方法很多，最经典的方法即表玻皿器官培养法；一种最常用的方法是不锈钢金属网格法及Wolff培养法和扩散盒培养法，实验者可根据情况选择采用。
三、放射自显影术测定
放射自显影术（autoradiography）是利用放射性同位素电离辐射对核子乳胶的感光作用，显示标本或样品中放射物的分布、定量以及定位的方法。放射性同位素能在紧密接触的感光乳胶中记录下它存在的部位和强度，准确显示出形态与功能的定位关系。现已可将放射自显影术与电镜以及生物分子结合起来。不但可以研究放射性物质在组织和细胞内的分布代谢，而且可以揭示核酸合成及其损伤等改变，目前已在生命科学各领域被广泛应用。
四、染色体分析技术
染色质或染色体是遗传物质在细胞水平的形态特征。前者是指当细胞处于合成期时遗传物质经碱性染料着色后，呈现出细丝状弥漫结构；当细胞进入分裂期时，染色质细丝高度螺旋化凝聚为形态有特征的染色体。特别是在分裂中期，复制后的染色体达到最高程度的凝聚，称为中期染色，是进行染色体形态观察分析的最佳时期。染色体分析应用领域越来越广，主要用于以下几方面：1）为临床诊断提供新手段；2）研究不育和习惯性流产发生的遗传基础；3) 通过检查胎儿的染色体，预防有染色体异常患儿出生（先天愚型）；4）根据染色体的多肽性进行亲子和异型配子的起源研究；结合DNA重组技术可以将基因定位于染色体的具体区带上。
五、电镜技术
早在1940年，英国剑桥大学首先试制成功扫描电子显微镜，但因分辨率低无实用价值。1965年英国剑桥科学仪器有限公司开始生产出商品扫描电镜，其以显着优点广泛用于生物学、医学、物理学、化学、电子学及勘探、冶金、国防、公安、机械与轻工业等诸多领域，并已成为非常有用的研究工具。

❼ 为了进行细胞培养,首先要从生物体取得细胞,目前获取细胞的方法有两种,分离法

实验:细胞培养

1.实验目的

初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程，为生物工程在医学上的应用打下基础。

实验原理 2.

从生物体中取出某种组织或细胞，模拟体内生理条件，在人工培养条件下使其生存、生长、繁殖或传代，这一过程称为细胞培养。细胞培养技术的最大优点是使我们得以直接观察活细胞，并在有控制的环境条件下进行实验，避免了体内实验时的许多复杂因素，还可以与体内实验互为补充，可同时提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象，耗费少，比较经济，因此成为生物学研究的重要手段。近年来，在体细胞遗传、分化、胚胎发生、肿瘤发生、免疫学、细胞工程、放射生物学以及老年学等一系列的研究领域中得到广泛的应用，并取得了丰硕的成果。

细胞培养可分为原代培养和传代(继代)培养。直接从体内获取的组织细胞进行首次培养为原代培养;当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1:2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养，传代培养的累积次数就是细胞的代数。

细胞培养是一种程序复杂、要求条件多而严格的实验性工作。所有离体细胞的生长都受温度、渗透压、pH值、无机盐影响，消毒、配液等均有严格的规范和要求，特别是无菌操作是细胞培养成败的关键。

❽ 核质分离原理

核质分离原理：细胞核与细胞质分离。

在细胞工程中，核移植实验就是将细胞核与细胞质进行分离，然后与另外的细胞质或细胞核进行融合，构建杂交细胞。细胞核质分离是根据细胞膜和核膜裂解的难易程度用不同强度的裂解液裂解细胞，达到细胞质和细胞核物质分离的效果。

细胞核作为一个功能单位，完整地保存遗传物质，并指导RNA合成，进而表达出相应的蛋白，在一定程度上细胞核控制着细胞的代谢、生长、分化和繁殖活动。因此细胞核的分离是研究基因表达及细胞核形态结构的首要步骤。不同组织来源的细胞经匀浆后，可用分级离心等方法将细胞核进行分离纯化。

实验要点：

1、为了得到较好的结果，外周血单个核细胞分离后应立即使用。

2、所有操作过程应在18-20℃中进行。

3、仔细覆盖各种Percoll分层液，避免破坏其界面。

4、洗涤分离细胞3次，以除去残存的Percoll分层液和血小板。

5、如果所制备的细胞仍不纯，可使用包被有抗CD2、抗CD3、抗CD19抗体分子的磁珠，以除去残存的NK、T、B淋巴细胞。

❾ 细胞组织的细胞工程在植物方面的应用

通过茎尖培养或微嫁接技术，可以脱去植物体内的病毒，获得无病毒苗木，如苹果、草莓等。另外，在组织培养过程中，如愈伤组织培养、细胞悬浮培养、原生质体培养等，通过pH值、温度、离子浓度等条件的变化，可增加其变异，从中可筛选出优良的突变体，从而为新品种的选育开辟一条崭新的途径。
愈伤组织、悬浮细胞、原生质体等是基因转化的良好受体材料，并且在离体培养条件下进行植株再生也是实现植物遗传转化的重要环节。
此外，微繁技术为种质的保存（germplasm storage）提供了新方法。很多种质资源在离体培养条件下，通过减缓生长和低温处理而达到长期保存目的，并可进行不同国家、地区间的种质资源收集、互换、保存和应用，即建立“基因银行”（gene bank），实现种质资源的全球共享。例如，在比利时Catholic University的Leuven研究中心有大量离体保存的香蕉种质库。 细胞大量培养有用次生代谢产物是植物细胞工程另一个重要应用领域。通过细胞工程技术，刺激植物体内某些重要次生代谢产物的合成和积累，然后进行分离、提纯，如某些名贵药物、香精、色素等，实现植物产品的工业化生产。
早在1964年我国就开始进行人参细胞培养。1980年以后，我国研究者相继开展了紫草、三七、红豆杉、青蒿、红景天和水母雪莲等植物的细胞大量培养和研究，并利用生物反应器进行药用植物的细胞大量培养的小试和中试。其中新疆紫草中试的规模达到100L，并小批量生产了紫草素，用于研制化妆品及抗菌、抗病毒和抗肿瘤药物。红豆杉细胞大量培养在我国也获得初步成功，从细胞培养物中得到了珍贵的抗癌药物紫杉醇，但产率还有待提高。 单倍体育种和相关研究在农业和园艺植物中得到了广泛的应用。用Blakeslee等（1922年）和Kostoff（1941年）分别得到了单倍体植株单倍体有利于突变的检测和抗性细胞系的筛选，并且大大缩短了育种的时间。此外单倍体在基因图谱、基因转移研究中具有重要作用。
自然形成的单倍体是极少见的，并且仅限于几种植物。花药培养是单倍体形成的重要途径。自1964年第一例花药培养获得成功以来，花药培养技术已取得了显着的进展，尤其在水稻、小麦、玉米等作物中已获得巨大成功。现已取得成功的果树树种主要有番荔枝（Nair等，1983年）、番木瓜（Litz和Conover，1978年）、4个柑橘品种（Chen，1985年）、龙眼（Yang和Wei，1984年）、荔枝（Fu和Tang，1983年）、苹果（Zhang等，1990年）、梨（Jordan，1975年）、葡萄（Rajasekaran和Mullins，1979年）等。薛光荣等（1980年）对东方草莓（四倍体）的单核期花粉进行培养，成功的诱导出单倍体植株。
花药培养主要是受基因型、花药的发育阶段、预处理和培养条件的影响，其存在的主要问题是单倍体的诱导频率低，单倍体自发加倍形成的二倍体与体细胞组织形成的二倍体很难区分。例如，Fowler等（1971年）、Nishi等（1974年）和Rosati等（1975年）以八倍体草莓花药为材料诱导愈伤组织，并分化出植株，发现其再生植株仍为八倍体，这些八倍体是由无性器官发育而来，还是由单倍体自发加倍而成则难以区分。
除花药培养外，植物的卵细胞、助细胞、反足细胞等单倍体细胞通过离体培养可以分化成单倍体胚或愈伤组织。胚珠、子房培养也曾进行了大量尝试，但大多数情况下，在愈伤组织阶段生长停止。 胚的离体培养是直接应用于植物改良最早的组织培养技术。胚培养可以克服杂交后胚的衰亡，保证种内或种间杂交的成功，或用于无性繁殖困难的植物的培养。胚培养还可以克服种子的休眠和败育。Magdalita等（1996年）和Drew等（1997年）分别进行了番木瓜的种内杂交，得到合适的胚子后，进行了胚培养，以促进杂交成功。Jordan（1992年）得到了愈伤组织，但未得到再生植株。
澳大利亚国际农业技术研究中心对番木瓜和其野生种的杂交胚进行了培养研究，已获成功，并得到了杂交后代，野生种的抗性、高含糖量等优良性状得到了遗传。荔枝是较难进行离体培养的果树树种之一，Kantharajah等（1992年）培养了长度为3mm的荔枝幼胚。其他通过未成熟胚培养进行再生的树种有鳄梨、番荔枝和番木瓜等。姚强（1990年）对桃、油桃和番桃花后60d的未成熟胚进行培养，获得了再生植株。J.Button等（1975年）利用甜橙种胚愈伤组织离体培养获得了完整植株。 （Protoplast culture）与体细胞杂交（Somatic hybridization）原生质体是去掉细胞壁的单细胞，它是在离体培养条件下能够再生完整植株的最小单位。每个原生质体都含有该个体的全部遗传信息，在适宜的培养条件下，具有再生成与其亲本相似的个体的全能性。原生质体培养的主要目的是通过原生质体的融合，克服远缘杂交障碍，实现体细胞杂交，从而产生杂交后代。在原生质体培养过程中，往往产生大量的变异，可从中选择优良突变体。原生质体可以摄取外源细胞器、病毒、DNA等各种大分子遗传物质，是进行遗传转化的理想工具，此外，在同一时间内获得的大量原生质体在遗传上是同质的，可为细胞生物学、发育生物学、细胞生理学、细胞遗传学及其他一些生物学科建立良好的实验体系。
Lizz（1986年）曾分离得到番木瓜的原生质体，Krikorian等（1988年）分离得到了香蕉的原生质体，但二者均未得到持续分裂的细胞。Nyman等（1987年，1988年）首先报道了草莓栽培品种Sengana和Canaga试管苗叶肉原生质体培养及植株再生。1992年，他们获得了草莓试管苗幼叶和叶柄原生质体的再生植株。Infante等以森林草莓用（Fragaria vesca）Alpine营养系试管苗叶片和叶柄为材料分离原生质体，并获得了再生植株。愈伤组织和悬浮细胞是制备原生质体的重要材料，但在落叶果树上，只有少数树种利用愈伤组织或悬浮细胞分离原生质体并获得培养的成功，其中最成功的树种当属猕猴桃。蔡起贵等（1988年）通过愈伤组织分离出中华猕猴桃的原生质体，并获得了再生植株。Kovalenko等（1990年）和Ochatt等（1988年）分别在Colt樱桃和欧洲葡萄上利用悬浮细胞系分离原生质体并获得再生植株。
林定波等（1997年）以胚性愈伤组织为材料，分离得到锦橙的原生质体，并获得了再生植株。易干军等（1997年）也以胚性愈伤组织为材料，分离得到柑橘（红江橘）的原生质体，并获得再生植株。但以叶肉为材料分离得到的原生质体未获得成功。马锋旺等（1998年）对山杏的原生质体进行了分离和培养，在适宜条件下，山杏原生质体4~5d变形，5~6d开始第一次分裂，20d左右可形成15~20个细胞的小细胞团，60d后可形成肉眼可见的微愈伤组织。微愈伤组织经继代培养后，可诱导不定芽和不定根，形成完整植株。丁爱萍等（1994年）曾对苹果进行了原生质体培养和植株再生研究，以胚性愈伤组织建立的悬浮细胞系为材料，分离得到原生质体，并获得了再生植株。
植物细胞在去除细胞壁后，能像受精过程那样相互融合，可实现常规杂交不亲和的亲本之间进行遗传物质重组，从而开辟了体细胞杂交的新领域。体细胞杂交已广泛用于植物育种，已在胞质雄性不育、抗病等方面取得了显着进展。同时，在木本果树植物上也得到了有经济价值的体细胞杂种植株。
目前两种最有效的融合系统PEG——高pH/Ca2+ 方法和电击融合方法。
第一例体细胞杂交是通过西红柿和马铃薯的原生质体融合实现的。原生质体融合技术在柑橘种间杂交中得到大量应用。Ohgawary将甜橙的原生质体与飞龙的原生质体融合，得到了体细胞杂种植株。
美国学者Grosser将甜橙的悬浮培养细胞的原生质体与豪壳刺属的Severinia disticha 愈伤组织的原生质体融合，得到了属间异源四倍体的体细胞杂种植株。S.distcha 具有抗病、耐寒、耐盐等优良性状，适合作柑橘的砧木。 分子生物学的飞速发展，导致了植物科学的一场新革命。经过多年的探索，人们从分子水平对生物学和遗传学有了深刻的认识，与组织培养技术相结合，分子生物学技术已开始应用于植物基因组的修饰和改变。
由于基因编码的同一性，任何有机体内（如病毒、菌类、昆虫）的有用基因都可以转入到植物体。由于基因（如抗虫或抗病基因）的导入，导致了新的基因型的出现或实现基因型的改良，可选育出抗虫或抗病的基因型。
目前已经分离或应用的目的基因主要有抗植物病虫害基因、抗非生物胁迫、改良作物产量品质的基因、改变植物其他性状的基因等。
有关外源基因导入植物细胞的方法有多种，如农杆菌质粒介导法（包括Ti质粒的Ri质粒）、植物病毒载体介导法、DNA直接导入法（包括PEG介导、脂质体介导等化学诱导DNA直接转化法，电激法、超声波、显微注射、激光微束、基因枪法等物理诱导DNA直接转化法等）和种质系统介导基因转化法（包括花粉管导入法，生殖细胞浸泡法，囊胚、子房注射法等）。目前最常用且最为有效的方法为根癌农杆菌介导法和基因枪法。自1983年首次用农杆菌介导法在烟草和马铃薯上取得成功以来，约有120种植物采用此方法进行转化。农杆菌介导法对双子叶植物十分有效，但在单子叶植物中也已开始应用。基因枪法既可以愈伤组织作为受体，又可以悬浮细胞作为受体，并且对单双子叶植物都十分有效。

❿ 细胞工程的种类

又称为染色体转导，或染色体介导的基因的转移。染色体转导术，目前有两类，其一，称为微细胞转移术。应用低浓度秋水仙素长时间处理可使细胞微核化，经去核处理后，可得到只含相当于几个乃至一个染色体的微细胞。微细胞被导入完整细胞以后仍显示RNA合成，因而微核编码的基因信息可望在微细胞异核体内表达出来。如小鼠的微细胞可被导入至另一品系的小鼠或仓鼠乃至人的HeLa细胞内。电泳检测显示存在着小鼠基因型的大分子物质，如脂酶D、嘌呤核苷磷酸化酶和肽酶B。已知前两种酶的结构基因定位于小鼠的第14号染色体上。提示小鼠的该号染色体已进入宿主细胞内并行使其功能。
另一种方法是先诱发细胞同步分裂，继用秋水仙素阻抑细胞分裂于中期，再破碎细胞，通过离心收集大量的中期染色体。有人把此法得到的人或仓鼠的中期染色体转移到小鼠细胞内，并探查到有特异的供体基因的功能产物， 动物的染色体工程与育种
如胸苷激酶(TK)与次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)。并推测整合到宿主小鼠内携带TK基因的染色体片段约大于 17000个碱基。有人证明通过染色体介导的基因转移，不仅在宿主细胞的分裂过程中能稳定地传给子代，而且还能进行连续转移，如人染色体基因可以转移到小鼠细胞内，然后再使用同样的技术从小鼠细胞转移到中国仓鼠细胞内。这些实验是在染色体水平上进行基因转移的良好开端。 在高等植物方面的染色体工程，目前还仅在六倍体普通小麦与其他种、属之间做过。六倍体普通小麦的染色体组型是由野生一粒小麦AA、小斯卑特山羊草BB和汇山羊草DD三种类型的染色体组融合而成，是一种能正常繁殖的种间杂种(AABBDD)，因此，很容易容纳其他种、属染色体添加或替代。这个领域的研究目的在于改良作物品种和探究物种起源。
1.染色体的消除①单体植物，起初是利用自然发生的单倍体普通小麦制作。现在则用人工诱导花粉或未受精的子房产生的单倍体植株为材料进行。这是因为普通小麦的单倍体植株只有21条染色体，都不是成对的，因此在成熟分裂（见减数分裂）时没有联会的对象，故仍为单价染色体。这21个单价染色体能排列在赤道板上纵裂为二，在后期Ⅰ被平均分配到细胞的两极。但在第二次分裂时，这21个染色体不再纵裂，随机分开，结果产生了染色体数从0～21个的 21种类型的配子。这些配子只有具19条或20条染色体的有受精能力。因此，如果用正常植株的花 植物的染色体工程与育种
粉(n=21)给单倍体植株授粉，n=20的卵细胞以一定的比例受精，结果得到2n=41的植株。其染色体组型中有20条染色体因有同源(对应)染色体故可以配对形成二价染色体。而只有一条染色体没有配对，成为单价染色体，因此称这种类型的植物叫单体植物。例如，美国米苏里大学的E.R.西尔斯于1937～1954年共用了十七年的时间，用中国春小麦中发现的两个单倍体植物与正常花粉授粉，得到的后代中找到了 5种单体植物。其后用同样方法制作一套21种单体植物。除普通小麦外，烟草和硬粒小麦也制成了一套单体植物。②缺对植物，单体植物的体细胞染色体数为2n=41。在成熟分裂后，将形成两种配子，即n=21，n=20，这两种雌雄配子都有受精能力，而且自花授粉后也容易结实。不过两者受精率的高低有差别。因此，受精时，两种配子按一定比例进行结合。结果见表1。如果缺失型的花粉与缺失型的卵细胞结合为受精卵,由此发育成的植物，将比通常的普通小麦少一对染色体，所以叫缺对植物。E.R.西尔斯用此方法也培育出了一套普通小麦缺对植物。
2.染色体的添加①同种染色体的添加，所添加的染色体来自同种个体，添加一个的叫三体植物(2n+1)；添加一对的叫四体植物(2n+2)。三体植物和单体植物一样，可得自单倍体三倍体或缺体。它的来源很多。如普通小麦单体植物在成熟分裂时，有时会出现不分离现象（即单价染色体的二个姊妹染色单体在后期Ⅰ被同时拉到同一极，而不是各自分配到两极）。结果所形成的四分孢子，其中三个的染色体数是n=20，一个是n=22。如果多一个染色体的配子与正常花粉或卵细胞 (n=21)受精后，就成为三体植物(2n=43),比原来正常普通小麦多了一个染色体。三体植物自花授粉的后代中就有四体植物出现。因为三体植物在成熟分裂时形成两种配子(n=21,n=22)。如果让三体植物自花授粉，就会出现三种类型的子代，如表2所示。其中就有新型的四体植物，比正常植物多两条染色体。②异种染色体的添加，所添加的染色体来自别种植物。以普通小麦(W)和黑麦(R)2n=14杂交为例(图1）。由于黑麦染色体不能和普通小麦配对，在成熟分裂染色体重组时，黑麦基因不能直接转移到小麦染色体上，而只能将黑麦整个染色体组加到小麦的染色体组中，所得子一代杂种为多倍单倍体(21′W7′R),仅28个染色体。经过秋水仙素处理加倍后，成为小黑麦八倍体(21″W7″R)共有56个染色体，再与小麦回交得到七倍体(21″W7′R),共49个染色体。然后与小麦再回交一次，就可得到外加的单体植物。单体植物自交后得二体植物(44个染色体21″W1″R)。另外，还有一个外加系是加入了黑麦第Ⅱ对染色体，成为44个染色体的二体植物。这种外加系能使小麦抗锈（见染色体倍性）。
3.染色体的替代用同种或异种染色体来替代某特定染色体的技术。其目的是要把已知道的具有抗病或其他有利特性的某一染色体来替代另一个具有其他性状的染色体，以改良作物品种。染色体替代有三种方法：①用普通小麦自身的染色体来替代。例如，普通小麦的一对1A染色体被一对1B染色体替代后，就能育成缺对1A、四体 1B植物，即缺对-四体植物。这种类型的植物是由缺对1A与四体1B杂交后所得子一代再自花授粉后选育而成。②普通小麦的一个品种的染色体用别的品种的染色体来替代，叫做同种染色体替代。如果用正常普通小麦B品种的花粉，与缺对的A品种杂交，所得子一代自花授粉，则在子二代就能选育出A品种的缺对的二条染色体被B品种染色体替代的植物。③用异种植物的染色体来替代，叫异种染色体替代。例如，普通小麦的2A染色体可用黑麦的2R染色体替代。为了达到这个目的，首先要育成基本材料缺对植物(2n=42-2A)和异种染色体外加系(2n=42+2R)。这样就可把普通小麦缺对2A与小麦2R染色体外加系（具有21对小麦染色体加上一对黑麦2R染色体）杂交，子一代杂种染色体2n=42，其中20对染色体是除2A外的全部普通小麦染色体，其余二个一价染色体是2A和2R，成熟分裂时可产生四种类型配子，即：n=20+2A+2R,n=20+0,n=20+2A=21，n=20+2R=21。这最后一种是具有除2A以外的20个普通小麦染色体一个黑麦的2R染色体。因此，子一代杂种自花授粉的后代中，就能得到所期望的异种染色体替代植物。即一对黑麦的2R替代了一对小麦的2A(20″W2″R)。
现在，应用染色体工程的方法，在许多添加和替代染色体工作中，已经获得了不少有遗传学和育种学价值的品系。例如，获得了添加单个冰草染色体的小麦品系中间，有的能抗粉露菌病、秆锈和叶锈。这种抗性均呈现显性单因子遗传。将黑麦第Ⅲ对染色体加到软粒小麦对粉露菌病有抗性。用冰草的一个染色体替代软粒小麦染色体3D，使软粒小麦对秆锈有抗性。这些在生产实践上都有实用价值。 诱导增加或减少一个生物体内整套染色体组数的技术。增加同种染色体组数的叫同源多倍体；增加异种染色体组数的叫异源多倍体，异源多倍体必须经过杂交才能得到(图2)（见染色体倍性）。
染色体组工程的方法:多倍体的诱发自1937年发现了用秋水仙素诱发多倍体的方法以来，一般常用药剂（秋水仙素、富民隆等），也可用高温处理来诱发多倍体。其法是把植物的种子或幼芽浸在 0.05～0.2%的秋水仙素水溶液中，处理24～96小时即可得到很好的效果。例如四倍体西瓜、甜菜、玉米和百合等都是用此法获得的(图2）。
现在，由于原生质体分离技术的发展，也可从原生质体的融合得到多倍体。例如用聚乙二醇作诱导融合剂处理胡萝卜原生质体后，得到了频率相当高的四倍体和六倍体植株。这是来源于二个或三个原生质体融合的结果。
单倍体的诱发60年代以来，子房、花药或花粉离体培养成功，很易从大孢子、卵细胞或小孢子等得到单倍体植株。其法是将一定时期的花药或子房移植到特定的培养基上培养。待生长愈伤组织或胚状体后，再移到分化培养基上，分化出苗和根，长成完整的小植株即可移到盛有土壤的盆中继续栽培到开花。单倍体植物一般不能结实或仅结少量种子。
此外，还可用远缘杂交，X射线或紫外线照射，化学药品如马来酰肼、甲苯胺蓝、氯霉素等以及异源胞质等方法都能诱导单倍体产生。1970年有人又用大麦与球茎大麦杂交后染色体消除的方法，产生高频率的单倍体，有的可高达68.5%。在杂交后，球茎大麦的7个染色体就消除在胚中，留下的是大麦的7个染色体，成为单倍体的胚及小植株。经秋水仙素处理后，染色体加倍形成纯合二倍体。
染色体组工程的应用诱导多倍体在植物育种上的应用是有限度的。由于作物类型不同，对多倍性诱变反应也不同。原来的倍性水平、染色体组的结构、繁殖方式、多年生性、植株实用部位，所有这些都关系到育种的成败。最适宜用染色体加倍方法改良的作物应该具有：①染色体数目较少，②以收获营养体为主，③异花授粉，④多年生和营养繁殖的习性等条件。这些都是多倍体育种获得成功的先决条件。 研究真核细胞的核、质相互关系以及细胞器，胞质基因的转移等细胞拆合的技术，所以又叫细胞拆合工程。主要研究内容是细胞质的置换。过去在植物上置换的方法是进行连续回交。例如，为了研究柳叶菜属的细胞质遗传，曾连续回交了二十五代，结果还不能把全部母核替代出来。现在由于核移植和原生质体的分离方法的改进，推进了这项工程的进展。
细胞质工程的方法去核和核移植 动物细胞核的移植一般都用显微操作器进行。50年代初期，美国生物学家R.布里格斯和T.金首先成功地把豹蛙囊胚期细胞的细胞核移植到去核的蛙卵，并能正常发育。后来，英国J.B.格登把爪蟾蝌蚪肠上皮细胞核移植到去核卵内，能发育到有生殖能力的成体。中国童第周等还成功地进行金鱼类异种、异属之间的核移植实验(见细胞分化)。70年代以来，体外培养的动物细胞的去核，是先用细胞松弛素B处理细胞，再高速离心使细胞核与细胞质分开。分离出来的核，带有少量胞质并围有质膜，称为“核体”或“小型细胞”。核体能重新再生其胞质部分，继续生长、分裂。去核后的胞质部分，仍由膜所包围，即为“胞质体”或“去核细胞”(图3）。秋水仙素及其衍生物和长春新碱等也能诱发某些哺乳类细胞排核。目前制备胞质体和核体的方法目臻完善，纯度可达99%左右。胞质体约可存活18～36小时。
植物细胞核的移植，在低等植物如单细胞伞藻，可把新鲜材料的假根切下，放在玻片上用玻棒挤压，使细胞的内含物压出在一滴适合的培养液中，反复冲洗几次，然后在显微镜下观察，一直到核周围无细胞质为止。离心分离后待用。高等植物如矮牵牛、天仙子、烟草、番茄等原生质体核的分离，可先在悬浮的原生质体中用蒸馏水将悬液冲淡一半，约30分钟后，原生质体破裂，放出细胞核与叶绿体，就可在0.6M蔗糖液中离心和收集核，然后存放在一定的培养液中待用。1978年以来又借用动物细胞去核的药剂细胞松弛素B来处理原生质体，加上高速离心，使原生质体分离成二部分，即：无核原生质体和小原生质体。开辟了去植物细胞核甚至去部分染色体的新途径。
细胞重组已经分离的核体（小细胞）与胞质体在融合因子的介导下重新融合，构成“重组细胞”，这一技术即称为细胞重组，胞质体与另一完整细胞融合，即产生“胞质杂种”细胞。这两种细胞产生的效果是不同的，现在有方法把它们鉴别开。以大鼠二种成肌细胞为材料，一种是正常的具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖基转移酶(HGPRT+)基因， 另一种是突变体缺少这种基因(HGPRT-)，因此，前者细胞中有转移酶能被氚-次黄嘌呤标记，而后者没有这种酶，便不能标记。在两者的细胞质中让HGPRT+摄取小乳胶颗粒，让HGPRT-摄取大乳胶颗粒，以颗粒的大小来作标记。当核体（小型细胞）与胞质体融合后，在重组细胞中可看到核被氚-次黄嘌呤所标记，在细胞质中有大量大乳胶颗粒和极少数小乳胶颗粒。当胞质体与另一个HGPRT+完整细胞融合后的胞质杂种细胞的细胞质中，则同时出现有大量的大、小乳胶颗粒。如图4所示。应用这种方法很容易把两类细胞鉴别出来。
在植物中，原生质体与核的融合以烟草、矮牵牛的核移植为例，其步骤是：①先使矮牵牛游离核与烟草原生质体各自悬浮并沉淀在0.25M硝酸钙溶液中，pH6；②去掉上清液，再把它们悬浮起来，以适当比例使核与原生质体在试管中混合、离心，随后加入45%聚乙二醇溶液1毫升使之聚合：③30分钟后，徐徐加入4毫升0.2M硝酸钙(被pH9的甘氨酸氢氧化钠所缓冲)以诱导融合摄取核；④15分钟后加0.2M硝酸钙(pH6);⑤再过20分钟，原生质体用培养液冲洗；⑥镜检后，将具有双核的（其中一个是矮牵牛的核）烟草原生质体进行培养。
细胞质工程的应用动物方面1974年有人用两种小鼠成纤维细胞，其一用L细胞的完整细胞，它的核内具有对5-溴脱氧尿苷抗性的核基因BUd(RR),但细胞质内没有抗氯霉素的胞质基因，用的另一个细胞的线粒体上带有抗氯霉素的胞质基因CA(PR)，而细胞核内带有硫代鸟嘌呤敏感核基因(TGS),把后者去核细胞与前者融合（图5），则融合后的胞质杂种细胞既能抗5-溴脱氧尿苷（BUdR），又能抗氯霉素(CAP)。但如果把亲体细胞 (BUdRR和TGS)同时培养在含有这两种药物的培养基上，则都将死去。因为这两种细胞一个对CAP敏感，另一个不抗BUdR,而胞质杂种细胞则两者都能抗，不但能存活而且还能增殖。
植物方面用等渗密度梯度高速离心后，也可得到两种亚原生质体，①在低密度范围内可得到胞质体（去核原生质体）；②在高密度中，可得到小原生质体（核质体）。现在已能自玉米、烟草和胡萝卜细胞得到这两种亚原生质体。生化实验证明：去核原生质体代谢作用很低，而小原生质体由于减少了表面积和体积（仅及原生质体的10～15%），因此，摄取物质快，合成蛋白质也快，培养时发育迅速，是一种研究核质关系的好材料。由于这项工作才开始，迄今尚无明显结果。 细胞融合是指用自然或人工的方法，使两个或几个不同的细胞融合成一个细胞的过程。细胞融合的结果，一个细胞中含有两个不同的细胞核，则称为异核体；随后的有丝分裂中，来自不同细胞核的染色体可能合并到一个结合核内。因此，又称为体细胞杂交。细胞融合的范围很广，从种内、种间、属间、科间一直到动、植物两界之间都进行了尝试。在植物方面，由于各类细胞具有全能性，在烟草、矮牵牛、胡萝卜等种间杂种，马铃薯和番茄、曼陀罗和颠茄、烟草和矮牵牛等属间杂种都已获得了再生植株。在动物方面人和鼠体细胞杂交，虽然不能长成一个新个体，但能作基因定位的材料。因此，这项新技术，在理论研究和工、农、医方面的应用，均有广阔的前景。细胞融合技术的发展，历史很短。自1960年在体外培养中发现杂种细胞以来，仅20多年。1965年冈田善雄等和H.哈里斯等各自用灭活的仙台病毒诱导产生了第一个种间异核体。1970年已应用人与鼠的细胞杂交系统地进行了人类染色体基因的定位工作。在植物方面，1960年E.C.科金首先使用纤维素酶分离番茄幼根的原生质体获得成功。1970年他们又成功地使种间原生质体融合在一起。1972年P.S.卡尔森等又从融合的原生质体获得了第一株种间细胞杂种。到1980年为止，种间融合的再生植株已有16种之多。
细胞融合的方法动物细胞杂交或细胞融合 将两个不同种的亲本细胞A和B，以灭活的仙台病毒或聚乙二醇(PEG)为融合诱导剂，使A和B两细胞融合成为一个具两个遗传性不同核的异核体（如遗传性相同的核融合在一起叫同核体）。随后异核体经有丝分裂成为两个具有A和B两亲本的杂种融合核。AB杂种经多次分裂，B亲本的染色体会逐渐减少到一个或完全消失(图6)。
植物体细胞杂交①原生质体的分离。植物细胞之间有果胶质粘连，每个细胞之外还有一层纤维素组成的壁，因此，在分离原生质体时，首先要在一定浓度的酶液(果胶酶与纤维素酶)中保温，消去果胶质与纤维素后才能使原生质体分离出来。②原生质体的融合。不同种之间原生质体的融合，须选用一种融合诱导剂(聚乙二醇，或高钙CaCl2.2啹O,0.05M溶于甘露醇 0.4M和pH10.5)诱导融合。它们的诱导率可达20～50%。③杂种细胞的选择与培养。细胞融合后要把杂种细胞选择出来。一般都利用各种生化指标和遗传标记来选择和鉴定。例如，使用天然的或人工诱变的突变体，如白化苗、营养缺陷型、抗药性突变体等，或根据不同材料对激素敏感性不同，生长差异等，来设计适合的选择系统。如果融合的原生质体一个是白化，另一个具叶绿体,就可用机械的方法，把融合的细胞在倒置显微镜下把它们挑选出来进行培养。这些细胞培养到各个发育阶段，如愈伤组织、分化苗和根，都需要更换培养基，才能使它们顺利地再生成植株。