结核病的检疫常用的实验方法

1. 肺结核的检查方法是什么

胸透不清楚，拍个x光吧，又经验的医生一眼就能看出来。
结核病的典型的症状是：咳嗽，胸闷，发热。你有这些症状吗？
如果有的话，建议化验一下血沉吧，结合病人的血沉高。

2. 简述结核菌素试验的原理、方法和结果分析

本试验是用结核菌素进行的皮肤IV型过敏变态反应试验，用以判断机体是否受到结核菌感染进行结核病流行病学调查，发现病人，协助诊断和鉴别诊断，选择卡介苗（BCG）接种对象并考核其接种效果，借以判断机体细胞免疫状态的一种常用试验。 “抗原”有两种即旧结核菌素简称旧结素（old tuberculin，OT）和结核菌纯蛋白洐化物（purified protein derivative，PPD）。OT为人型结核杆菌培养二个月后，加热杀死结核菌，将滤去死菌后含菌体自溶及培养基成分的剩余部分浓缩至原量1/10的棕色透明液体，1952年WHO将其标准化，每ml含1000mg相当10万TU（结素单位）。PPD是用化学方法从结核菌培养液中提取的结核菌蛋白，较OT更精纯，用后不产生非特异性反应（表7-2）。“方法”有皮上、皮肤划痕或点刺与皮内注射法，以后者应用最为广泛，效果准确。1、 部位，选左臂屈侧中部皮肤无瘢痕部位，如近期（2周内）已作过试验，则第2次皮试应选在第一次注射部位斜上方3~4cm处，或取右前臂。2、 局部75％酒精消毒，用1.0ml注射器、4.5号针头（针头斜面不宜太长），吸取稀释液0.1ml （5TU）皮内注射，使成6~8mm大小圆形皮丘。3、 注后48小时观察一次，72小时判读结果，测量注射局部红肿处的硬结横与纵径，取其均值为硬结直径。＜5mm为阳性，5~9mm为弱阳性（+），10~19mm为阳性（+ +），≥20mm或局部出现水泡、坏死或有淋巴炎，均为强阳性（+ + +）。“意义”阳性：①示机体受到结核杆菌感染，且已产生变态反应；②城市居民，成人绝大多数为阳性，一般意义不大；如用高倍稀释液（1/10000）1TU皮试呈强阳性，提示体内有活动性结核病灶；③3岁以下儿童，呈阳性反应（+ +），不论有无临床症状，均现为有新近感染的活动性结核，应予治疗。阳性：提示①机体未受到结核菌感染，或虽已感染但机体变态反应尚未建立（4~8周内）；如一周后，再用5TU重新皮试，利用结素的复强作用，若仍为阳性，则可除外结核菌感染。此外见于：②高龄，一般60岁以上20％、70岁以上30％、80岁以上50％为阴性；③儿童患麻疹、百日咳后，变态反应被抑制，大约3周后可渐恢复；④重症结核病，当经过治疗随病情好转，结素反应可复阳；⑤结节病（阳性率仅10％，且多为弱阳性）、淋巴瘤与其他恶性肿瘤患者；⑥接受糖皮质激素或免疫抑制剂治疗者；⑦营养不良和AIDS（acquired immune deficiency syndrome）患者。“注意事项”1、 已配制稀释液置有色瓶内。避免日光直射、4℃可保存2周。2、 玻璃及塑料对结素有明显吸附作用，抽取后务于1小时内用完，否则效价降低影响效果。3、 结素试验后可能会出现一些异常反应，应予妥善处理。局部：出现水泡、溃疡，应保持清洁，涂2％甲紫，必要时可用注射器将水泡液抽除。全身：①发热，多属热原反应与器具消毒不严有关，一般于数小时内可恢复；②厥与休克，多与精神紧张、恐惧有关，可嘱其平卧、保温，必要时皮下注射0.1％肾上腺素0.5~1.0ml；③病灶反应，注后数小时肺部病灶周围毛细血管扩张，通透性增加，侵润渗出，形成变态反应性病灶周围炎，一般不必特殊处理，2~5天可自行消退。4、有下列情况暂不宜作结素试验 发热，体温37.5℃以上；传染病恢复期，器质性心脏病、肝肾血管疾病、精神病、癫痫、细胞免疫功能缺陷、丙种球蛋白缺乏和月经期。

3. 肺结核的诊断方法有哪些

1．病史和症状体征

（1）症状体征情况：肺结核患者的症状一般没有特异性，但明确症状的发展过程对结核病诊断有重要参考意义。体征对肺结核的诊断意义有限。

（2）诊断治疗过程：确定患者是新发现还是已发现病例。不少肺结核患者首次就诊多在综合医院，且接受治疗，应记录首次诊断情况特别是痰排菌情况、用药品种、用药量和时间、坚持规律用药情况等，这对将来确定治疗方案有重要价值。如果是复发患者，治疗史对判断耐药情况有参考意义。

（3）肺结核接触史：主要是家庭内部接触史，对邻居、同事、宿舍等有无肺结核患者也应了解。记录接触患者的病情、排菌情况、治疗方案和用药规律情况、接触时间、接触密切程度等。

2．影像学诊断

胸部X 线检查是诊断肺结核的重要方法，可以发现早期轻微的结核病变，确定病变范围、部位、形态、密度、与周围组织的关系、病变阴影的伴随影像；判断病变性质、有无活动性、有无空洞、空洞大小和洞壁特点等。肺结核病影像特点是病变多发生在上叶的尖后段和下叶的背段，密度不均匀、边缘较清楚和变化较慢，易形成空洞和播散病灶。诊断最常用的摄影方法是正、侧位胸片，常能将心影、肺门、血管、纵隔等遮掩的病变以及中叶和舌叶的病变显示清晰。

CT 能提供横断面的图像，减少重叠影像，易发现隐蔽的病变而减少微小病变的漏诊；比普通胸片更早期显示微小的粟粒结节；能清晰显示各型肺结核病变特点和性质，与支气管关系，有无空洞，以及进展恶化和吸收好转的变化；能准确显示纵隔淋巴结有无肿大。

常用于对肺结核的诊断以及与其他胸部疾病的鉴别诊断，也可用于引导穿刺、引流和介入性治疗等。

3．痰结核分枝杆菌检查

确诊肺结核病的主要方法，也是制订化疗方案和考核治疗效果的主要依据。每一个有肺结核可疑症状或肺部有异常阴影的患者都必须查痰。

（1）痰标本的收集：肺结核患者的排菌具有间断性和不均匀性的特点，传染性患者查一次痰也许查不出，所以要多次查痰。菌阳患者1 个痰标本涂片检查约80% 阳性，2 个痰标本涂片检查约90%阳性，3 个痰标本涂片检查约95% 阳性。通常初诊患者要送三份痰标本，包括清晨痰、夜间痰和即时痰，如无夜间痰，宜在留清晨痰后2 ～ 3 小时再留一份痰标本。复诊患者每次送两份痰标本。无痰患者可采用痰诱导技术获取痰标本。

（2）痰涂片检查：简单、快速、易行和可靠的方法，但欠敏感。

每毫升痰中至少含5000 ～ 10000 个细菌时可呈阳性结果。常采用的是齐－尼氏染色法。痰涂片检查阳性只能说明痰中含有抗酸杆菌，不能区分是结核分枝杆菌还是非结核性分枝杆菌，由于非结核性分枝杆菌少，故痰中检出抗酸杆菌有极重要的意义。

（3）培养法：结核分枝杆菌培养为痰结核分枝杆菌检查提供准确可靠的结果，常作为结核病诊断的金标准。同时也为药物敏感性测定和菌种鉴定提供菌株。结核分枝杆菌培养费时较长，一般为2 ～ 6周，阳性结果随时报告，培养至8 周仍未生长者报告阴性。常用的培养方法为改良罗氏法和小川法。近期采用测定细菌代谢产物的BACTEC TB460 或BACTEC MGIT 960 法，约2 周左右可获得结果。

（4）药物敏感性测定：主要为临床耐药病例的诊断、制定合理的化疗方案以及流行病学监测提供依据。

（5）其他检测技术：如聚合酶链式反应（PCR）、核酸探针检测特异性DNA 片段、色谱技术检测结核硬脂酸和分枝菌酸等菌体特异成分以及采用免疫学方法检测特异性抗原和抗体等，使结核病快速诊断取得一些进展，但这些方法仍在研究阶段，尚需改进和完善。

4．纤维支气管镜检查

纤维支气管镜检查常应用于支气管结核和淋巴结支气管炎的诊断，支气管结核表现为黏膜充血、溃疡、糜烂、组织增生、形成瘢痕和支气管狭窄，可以在病灶部位钳取活体组织进行病理学检查、结核分枝杆菌培养。对于肺内结核病灶，可以采集分泌物或冲洗液标本做病原体检查，也可以经支气管肺活检获取标本检查。

5．结核菌素试验

广泛应用于检出结核分枝杆菌的感染，而非检出结核病。结核菌素试验对儿童、少年和青年的结核病诊断有参考意义。由于许多国家和地区广泛推行卡介苗接种，结核菌素试验阳性不能区分是结核分枝杆菌的自然感染还是卡介苗接种的免疫反应。因此，在卡介苗普遍接种的地区，结核菌素试验对检出结核分枝杆菌感染受到很大限制。目前世界卫生组织和国际防痨和肺病联合会推荐使用的结核菌素为纯蛋白衍化物（purified protein derivative，PPD）PPDRT23，以便于国际结核感染率的比较。

结核菌素试验选择左侧前臂曲侧中上部l/3 处，0.lml（5IU）皮内注射，试验后48 ～ 72 小时观察和记录结果，手指轻摸硬结边缘，测量硬结的横径和纵径，得出平均直径=（横径＋纵径）/2，而不是测量红晕直径，硬结为特异性变态反应，而红晕为非特异性反应。

硬结直径≤ 4mm 为阴性，5 ～ 9mm 为弱阳性，10 ～ 19mm 为阳性，≥ 20 或虽＜ 20mm 但局部出现水泡和淋巴管炎为强阳性反应。结核菌素试验反应愈强，对结核病的诊断，特别是对婴幼儿的结核病诊断愈重要。凡是阴性反应结果的儿童，一般来说，表明没有受过结核分枝杆菌的感染，可以排除结核病。但在某些情况下，也不能完全排除结核病，因为结核菌素试验可受许多因素影响，结核分枝杆菌感染后需4 ～ 8 周才建立充分变态反应，在此之前，结核菌素试验可呈阴性；营养不良、HIV 感染、麻疹、水痘、癌症、严重的细菌感染包括重症结核病如粟粒性结核病和结核性脑膜炎等，结核菌素试验结果则多为阴性和弱阳性。

4. 结核病的实验室检查具体有什么呢

结核病的实验室检查有这些：

（1）结核菌细菌学检查痰涂片查抗酸杆菌是WHO推荐的肺 结核诊断方法，是全世界的结核病实验室都在使用的最基本的细菌学检 查方法。痰涂片检查不仅可以明确结核病传染源，而且十分经济，符合 我国国情。涂片的优点是简便、快速、价廉。涂片的缺点是阳性率低。 结核菌培养仍是目前诊断支气管结核病（MTB)的金标准，缺点是培养 时间长，特异性差。(2) 免疫学检测技术

① 皮肤变态反应：结核菌素或PPD实验，临床意义同前。

② 结核抗体测定：目前常用的检测方法主要有ELISA、免疫层析试 验、免疫印迹试验和蛋白芯片技术等检测血清抗体方法。

③ 结核抗原测定和循环免疫复合物（CIC)测定。

(3) 干扰素分析为体外测定结核菌抗原刺激诱发的T淋巴细胞分 泌y干扰素（IFN-y)的方法。(4) 分子生物学方法检测核酸杂交、聚合酶链式反应（PCR)可 检测样本中的结核杆菌核酸，并能鉴别耐药株。

(5) 血沉多增快，结合临床表现及X线检查可协助判断结核病的 活动性。

5. 早期肺结核的检查方法

肺结核应该做哪些检查？ 一结核菌检查 是确诊肺结核最特异性的方法痰中找到结核菌是确诊肺结核的主要依据涂片抗酸染色镜检快速简便在我国非典型分枝杆菌尚属少见故抗酸杆菌阳性肺结核诊断基本即可成立直接厚涂片阳性率优于薄涂片为目前普遍采用荧光显微镜检查适合于大量标本快速检查无痰或儿童不会咳嗽可采用清晨的胃洗液找结核菌成人亦可通过纤支镜检查或从其涮洗液中查找结核菌痰菌阳性表明其病灶是开放性的具有传染性若排菌量多(每毫升10万个以上)直接涂片易呈阳性为社会传染源痰菌量较少(每毫升1万个以下)可用集菌法 培养法更为精确除能了解结核菌有无生长繁殖能力外且可作药物敏感试验与菌型鉴定结核菌生长缓慢使用改良罗氏培养基通常需4～8周才能报告培养虽较费时但精确可靠特异性高若涂片阴性或诊断有疑问时培养尤其重要培养菌株进一步作药物敏感性测定可为治疗特别是复治时提供参考 将标本在体外用聚合酶链反应(PCR)法使所含微量结核菌DNA得到扩增用电泳法检出1个结核菌约含1fgDNA40个结核菌即可有阳性结果该法不必体外预培养特异性强2天即可出报告快速简便并可鉴定菌型不足之处是可能出现假阳性或假阴性 二影像学检查 胸部X线检查可以发现肺内病变的部位范围有无空洞或空洞大小洞壁厚薄等X线对各类结核病变的透过度不同通过X线检查大致能估计结核病灶的病理性质并能早期发现肺结核以及判断病情发展及治疗效果有助于决定治疗方案必须指出不同病因引起的肺内病变可能呈现相似的X线影像故亦不能仅凭X线检查轻易确定肺结核的诊断 X线摄片结合透视有助于提高诊断的准确性可发现肋骨纵隔膈肌或被心脏遮盖的细小病灶并能观察心肺膈肌的动态 肺结核的常见X线表现包括：纤维钙化的硬结病灶表现为密度较高边缘清晰的斑点条索或结节;浸润性病灶表现为密度较淡边缘模糊的云雾状阴影;干酪样病灶表现为密度较高浓淡不一有环形边界透光区的空洞等肺结核病灶通常在肺上部单侧或双侧存在时间较长且有多种不同性质的病灶混合存在及肺内播散迹象 凡X线胸片上显示渗出性或渗出增殖性病灶干酪样肺炎干酪样病灶空洞(除净化空洞外)远均提示为活动性病变;增殖性病变纤维包囊紧密的干酪硬结灶及纤维钙化灶等均属非活动性病变活动性病灶的痰中仍可找到结核菌由于肺结核病变多为混合性在未达到完全增殖或纤维钙化时均仍应考虑为活动性 胸部CT检查对于发现微小或隐蔽性病变了解病变范围及肺病变鉴别等方面均有帮助 三结核菌素(简称结素)试验 是诊断结核感染的参考指标 旧结素(old tuberculin,OT)是结核菌的代谢产物由液体培养长出的结核菌提炼而成主要含有结核蛋白OT抗原不纯可能引起非特异性反应在人群中作普查时可用1：2000的OT稀释液0.1ml(5IU)在左前臂屈侧作皮内注射经48～72小时测量皮肤硬结直径如小于5mm为阴性5～9mm为弱阳性(提示结核菌或结核分枝杆菌感染)10～19mm为阳性反应20mm以上或局部出现水泡与坏死者为强阳性反应 结素的纯蛋白衍化物(purified protein derivative,PPD)由旧结素滤液中提取结核蛋白精制而成为纯洁素不产生非特异性反应国际上常用的PPD——RT23已经取代OT我国从人型结核菌制成的PPD(PPD-C)及从卡介苗制成BCG-PPD纯度均较好已广泛用于临床诊断皮内注射0.1ml(5IU)硬结平均直径≥5mm为阳性反应结素试验除引起局部皮肤反应外偶可引起全身反应临床诊断通常使用5IU如无反应可在一周后再用5IU(产生结素增强效应)如仍为阴性大致可除外结核感染 结素试验仍是结核病综合诊断中常用手段之一有助于判断有无结核菌感染若呈强阳性反应常表示为活动性结核病结素试验阳性反应仅表示曾有结核感染并不一定现有患病我国城市成年居民曾患结核感染率在60%以上故用5IU结素进行检查其一般阳性结果意义不大结素试验婴幼儿的诊断价值较成人为大因年龄越小自然感染率越低;3岁以下强阳性反应者应视为有新近感染的活动性结核病有必要进行治疗如果2年内结素反应从<10mm增加至10mm以上并增加6mm以上时可认为有新感染 结素试验阴性反应除表示没有结核菌感染外尚应考虑以下情况结核菌感染后需4～8周才建立充分变态反应在该变态反应产生之前结素试验可呈阴性应用糖皮质激素等免疫抑制药物或营养不良麻疹百日咳等患者结素反应亦可暂时消失严重结核病及各种重危患者对结素无反应或仅出现弱阳性与人体免疫力及变态反应暂时受抑有关待病情好转可转为阳性反应其他如淋巴细胞免疫系统缺陷(如白血病淋巴瘤结节病艾滋病等)患者或年老体衰者的结素反应亦常为阴性 四其他检查 结核病患者血像通常无改变严重病例常有继发性贫血急性粟粒型肺结核时白细胞总数减低或出现类白血病反应血沉增快常见于活动性肺结核但并无特异性诊断价值血沉正常亦不能排除活动性肺结核患者无痰或痰菌阴性而需与其他疾病鉴别时用酶联免疫吸附试验(ELISA法)检出患者血清中特异性抗体可能对肺外结核的诊断提供参考纤支镜检查对于发现支气管内膜结核了解有无肿瘤吸取分泌物解除阻塞或作病原菌及脱落细胞检查以及取活组织作病理检查等均有重要诊断价值浅表淋巴结活检有助于结核的鉴别诊断 近年来应用分子生物学及基因工程技术以非培养方法来检出与鉴定临床标本中的结核菌展示其敏感快速及特异性高等优点如核酸探针(DNA probe)染色体核酸指纹术等

6. 确诊结核的方法

痰液涂片染色找到抗酸杆菌或痰液培养出结核杆菌。

7. 结核菌素试验的实验步骤

基于Ⅳ型变态反应（见变态反应）原理的一种皮肤试验，用来检测机体有无感染过结核杆菌。凡感染过结核杆菌的机体，会产生相应的致敏淋巴细胞，具有对结核杆菌的识别能力。当再次遇到少量的结核杆菌或结核菌素时，致敏T淋巴细胞受相同抗原再次刺激会释放出多种可溶性淋巴因子，导致血管通透性增加，巨噬细胞在局部集聚，导致浸润。约在48～72小时内，局部出现红肿硬节的阳性反应。若受试者未感染过结核杆菌，则注射局部无变态反应发生。
结核菌素是结核杆菌的菌体成分，有两种，旧结核菌素（old tuberculin，OT）是柯赫（R.Koch）首先发明的。而纯蛋白衍生物（purified protein derivative，PPD）则是由塞伯尔（Seibert）首先制备的。结核菌素试验方法很多，常用的是芒图（Mantoux）氏法，即将OT或PPD用无菌生理盐水稀释成不同浓度，取0.1毫升注射于左前臂掌侧前1/3中央皮内（注意：左手），72（48h～96h）小时检查反应情况，应注意局部有无硬节，不可单独以红晕为标准。若注射部位有针眼大的红点或稍有红肿，硬节直径小于0.5厘米，则为阴性反应。若注射部位硬节直径超过0.5厘米，但在1.5厘米以下，为阳性反应。若注射部位反应较强烈或硬节直径超过1.5厘米以上，为强阳性反应。阳性反应表明机体对结核杆菌有变态反应，过去曾感染过结核，但不表示有病，因接种过卡介苗的人也呈阳性反应。强阳性反应则表明可能有活动性感染，应进一步检查是否有结核病。阴性反应表明无结核菌感染，但应考虑以下情况：如受试者处于原发感染早期，尚未产生变态反应，或正患严重结核病，机体已丧失反应能力，或受试者正患其他传染病，在此类情况下，均可暂时出现阴性反应。结核菌素试验可为接种卡介苗及测定免疫效果提供依据。若结核菌素试验阴性者应接种卡介苗，接种后若反应转为阳性，即表示接种已产生免疫效果。结核菌素试验还可作为婴幼儿结核病诊断的参考，测定肿瘤患者的非特异性细胞免疫功能及在未接触过卡介苗的人群中调查结核病的流行情况。

8. 如何用PCR技术检测结核杆菌

结核杆菌可以导致全身性疾病，特别是在发展中国家，其发病率较高，危害性极大.近几年结核杆菌的变异性较大，对抗痨药物的耐药性增加，从而使结核病的发病大幅度增高.虽然传统的涂片抗酸染色、细菌培养以及胸片检查对大部分结核能作出正确的诊断，但对某些病人亦可造成误诊或漏诊;动物接种虽特异性较高，但因时间较长，不能满足临床快速诊断的需要.近几年也出现了几种快速诊断方法，但也存在较大的缺陷，如短期培养后抗原免疫原性分析，即用放免方法或酶联免疫吸附试验(ELISA)检测BACTEC培养瓶中被培养标本所分泌的抗原，该方法可在BACTEC瓶本身鉴定出细菌之前，结合ELISA和涂片抗酸染色有效地鉴别典型和非典型分枝杆菌，敏感性较高，但存在培养时间长，重复性尚差的缺点.另一种是短期培养后核酸探针杂交法，即用特异性DNA探针与BACTEC瓶中培养的细菌染色体DNA杂交.该方法能有效地防止培养的假阴性结果，但却易发生假阳性结果，加之采用的方法较为复杂和繁琐，又有涉及同位素操作之嫌等，因而近来已较少应用.上面两种方法都要借助细菌培养来进行，虽然在时间上比传统培养大大缩短，但缺乏快速诊断的优势.近几年兴起的PCR方法基本实现了快速、灵敏、准确地诊断结核的目的，并且该方法正趋于常规化地应用于临床一般实验室.应用PCR方法检测结核杆菌的首要条件是设计一对特异性DNA引物.该引物所引导的DNA扩增序列应是结核杆菌独有的，且是结核杆菌的保守序列，这样才能保证检测结果的特异性.PCR方法的另外几个关键因素是:①DNA提取，即对有限的结核杆菌应尽量地将其DNA完整、全部地提取;②TaqDNA聚合酶的活性;③PCR产物的检测方法，即将PCR产物进行快速、灵敏、安全、准确的检测.

一、结核杆菌DNA的提取

在该技术上，目前仍无一种统一常规化的方法.现有各方法都存在着提取DNA不足的缺点，因此，敏感性受到影响.现在主要的细菌裂解方法是:①蛋白酶K加表面活性剂法;②蛋白变性剂加表面活性剂煮沸法;③反复冻融法;④超声波法;⑤溶菌酶加表面活性剂法.提取DNA的方法主要有:①酚一氯仿提取法:即用酚一氯仿抽提含有裂解菌体的溶液，然后用乙醇从抽提后的溶液中沉淀DNA.有的学者将硅酮加入酚一氯仿中，使水相和有机相的界面更牢固，这样不但能减少抑制因子混入水相，而且使DNA提取量比未加硅酮方法高20%～30%;②Chaotrop-silica法:用二氧化硅(sio2)吸附裂解菌体释放出的DNA，该二氧化硅用70%乙醇洗涤，而后干燥，最后用双蒸水洗脱(55℃).有报道认为该方法可以消除痰中的某些抑制因子.有的学者发现未预裂解的结核杆菌直接煮沸进行PCR的效果与预先处理的相仿，提示结核杆菌不预裂解也可直接进PCR.但加入的菌数应<约1000个，否则细菌蛋白会对PCR产生抑制作用.

二、引物的设计

根据不同型结核杆菌的序列，目前常在下列几种序列内进行引物设计.

(一)编码结核杆菌抗原的基因序列

1.编码65-KDa蛋白抗原的基因序列:结核杆菌65-KDa蛋白抗原为存在于所有分枝杆菌细胞壁中的热休克蛋白，也是一种交叉反应蛋白.所以依据该序列设计合成的引物，PCR能扩增出所有分枝杆菌的靶DNA片段，没有属内特异性.这种PCR较适用于结核病高发区大规模筛选和流行病普查.另外，对65-KDa蛋白基因的PCR扩增产物进行限制性酶切分析(RFLP)，也可以准确地检测出结核杆菌的属内归属.

2.编码MPB64蛋白的基因序列：MPB64蛋白为结核杆菌复合群(MTBC，包括人型结核杆菌、牛型结核杆菌、BCG、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌)所特有.根据该蛋白的基因序列设计的引物进行PCR，对MTBC模板DNA显示出高的特异性.

3.编码38-KDa蛋白抗原b(Pab)的DNA序列:该序列仅存在于人型和牛型结核杆菌.采用在此基因内设计合成的引物和探针进行PCR，只能扩增人型和牛型结杆菌的DNA序列，能检出少至10个结核杆菌的纯化DNA.

4.编码32-KDa蛋白的基因序列:32-KDa是蛋白分枝杆菌的一种分泌蛋白，由它的基因序列设计的引物和探针进行PCR，可以特异地检测出分枝杆菌的DNA片段，能检测出50fg的纯化DNA，相当于10个结核杆菌.

5.编码MPB70抗原的基因序列:MPB70为牛型结核杆菌所特有，由该基因序列设计的引物进行PCR，对牛型结核杆菌的检测具有高度的特异性和敏感性.

(二)结核杆菌基因组重复序列

1.克隆DNA序列:目前所应用的DNA序列都是MTBC所特有，拷贝数在10个以上，包括亚克隆重组质粒pPH7301和克隆质粒PMTb4，分别含KpnI-SmaI插入片段和EcoRI-BamHI插入片段.根据这些基因序列设计的引物，其检出限在20个结核杆菌以下.

2.插入序列:结核杆菌的插入序列主要有IS6110和IS986，它们仅见于MTBC.这两种插入序列在基因组中的拷贝数为1--20个，选择插入序列作为扩增的靶序列，可以得到较高的敏感性和特异性.尤其是IS6110，是目前进行临床PCR检测的首选区段.

(三)人型结核杆菌特异序列

mtp40是人型结核杆菌特异性DNA片段，Portillo等选择mtp40作为靶序列，用PCR检测结核杆菌，结果只能扩增人型结核杆菌DNA，敏感性达到10fg纯化DNA量.

(四)分枝杆菌dnaJ基因

该基因为分枝杆菌共有，但种间又存在差别，在该基因序列内设计合成的引物和探针用于PCR检测，能检出50fg的纯化分枝杆菌DNA，相当于10个结核杆菌.并可用于区分结核杆菌和非典型结核杆菌的鉴别诊断.

(五)rRNA序列

用“通用”引物在逆转录酶作用下，将16SRNA逆转录合成cDNA，然后对cDNA进行PCR扩增，检出限达0.1fg化的结核杆菌rRNA.临床标本中少至10个结核杆菌亦可被检出，该方法由于加了一步反转录过程相对增加了难度，临床一般少用.

三、PCR产物的检测方法

通常PCR产物的检测方法是经琼脂糖电泳后，用溴化乙锭染色，然后在紫外灯下观察或进一步采用标记的DNA探针杂交.为了进一步提高检测的灵敏度，现多在引物和探针的标记上进行改进.由于放射性标记物的危害性，现多采用非放射性标记，如生物素、荧光素、酶及化学发光剂.Wilson等在巢式PCR的内侧引物上分别掺入生物素和地高辛配基，这样PCR产物两端就分别带有生物素和地高辛配基.PCR产物上的生物素和附着在微型滴定板表面的生物素蛋白结合，使PCR产物附着在滴定板上，另一端的地高辛配基和加入的抗地高辛配基碱性磷酸脂酶结合形成抗地高辛配基碱性磷酸脂酶偶合物，利用该偶合物405nm的吸收峰做光密度(OD)测定.另外，还可用吖啶酯标记探针进行杂交，用硼酸钠将未杂交的探针分解，然后加入H2O2溶液和NaOH溶液使吖啶酯水解，最后测量吖啶的光通量.虽然这些方法安全、快速、但其敏感性还需进一步提高，操作还需进一步简化.

四、PCR检测结核杆菌的敏感性和特异性

(一)PCR的特异性

PCR特异性的关键首先取决于所选靶序列的特异性.现在常用的靶序列有:①分枝杆菌共有的靶序列，如65-KDa蛋白基因序列;②MTBC特有的靶序列，如MpB64蛋白基因序列、IS6110序列.③人型结核杆菌特异的靶序列，如mpt40序列.引物设计对PCR的特异性也至关重要.引物序列在靶DNA上的专一性、以及引物的特异性和保守性，以及引物本身的许多特性，如G+C含量引物3'未端序列的特异性和保守性及引物长度等都影响PCR的特异性，另外在设计引物时也要防止出现引物间的过多配对，以免形成过多的引物聚合体，造成非特异性扩增.

PCR扩增TB的特异性除上述先决条件外，也与PCR反应本身有极重要的关系.其中退火温度是一个重要因素，退火温度过低时，引物易发生非特异性结合，造成非特异性扩增.由于结核杆DNA中G+C含量高，因此可以适当提高退火温度，以获得更高的特异性.

另外，PCR缓冲液的组成，尤其是Mg2+浓度对PCR的特异性也有较大影响，Mg2+浓度过高，会提高PCR产物的产量，但同时也会增加非特异性扩增.

(二)PCR的敏感性

PCR的敏感性很高，一般可以检测出1～100fg纯化的结核杆菌DNA，相当于1～20个结核杆菌，这种敏感性明显高于涂片法和培养法.PCR还可以检出培养法易发生失败的病例，从而大大提高菌阴结核病的诊断.另外PCR检测TBDNA不受抗痨治疗的影响，可以准确观察抗痨治疗的效果，防止血清学方法所带来的假阴性结果.PCR敏感性受下列因素影响:①扩增靶序列的拷贝数.一般认为，结核杆菌染色体中含靶序列拷贝数越多，PCR敏感性越高，如38-KDa蛋白的基因序列在结核杆菌染色体中只有一个，而IS6110序列的拷贝数却有10～12个，结果PCR敏感性后者比前者高100倍;②PCR的循环次数.在一定程度上，PCR循环次数越多，其敏感性就越高，但要合适.因为，循环次数过多会增加非特异性问题，造成结果判断上的失误，产生假阳性结果;③结核杆菌DNA的提取技术.处理标本时首先要富集(如离心)标本中的TB，使单位体积内TB含量变高，从而增加了起始模板数，有利于提高PCR的灵敏性.同时提取过程要尽可能减少抑制成份，并提高DNA的提取率.④PCR产物的检测方法.虽然DNA探针杂交要比直接电泳法敏感性高得多，但步骤繁琐，这也是影响PCR临床应用的原因之一.但一般情况下，直接电泳法的敏感性完全能够达到检测的需要.

五.PCR在结核病临床诊断中的应用

PCR检测结核杆菌的优点决定了它在临床上的应用价值和范围，PCR检测TB的优点主要表现如下:

1.能早期诊断TB菌血症:在TB感染的早期，特别是在TB病灶通过血源性外传播时、及在外周血中存在极少量的TB时，PCR就能给于扩增并确诊.此外，由于外周血中TB的含量甚微，又没有新的病灶形成，因而血清学方法和物理方法均难以达到确诊的目的，而对这类病灶的早期诊断在临床治疗上具有指导意义，因为早期菌血症是较易控制的，并可以防止继发性TB病灶的形成.

2.时间短;PCR检测TB仅需2-4h对于某些培养法难以实施的病例，PCR法则行之有效，同时提高了敏感性和特异性，可以检测到1个TB菌.

3.有利于鉴别诊断:对于肺结核来说，其中的结核球和成人型原发性结核等，经常易于同肺癌的诊断相混淆.病灶中心部位经常出现既未见TB又未见癌细胞的坏死区.此时涂片检测常是阴性的.在这种情况下，PCR检测就显得特别有效.它不但可以扩增能着色的活菌，还可以扩增已死亡的，但DNA尚未降解的死菌，从而确定这样的病灶是恶性还是良性.在许多情况下，TB可以导致脑膜炎、胸膜炎、腹膜炎等.涂片法尽管在诊断上具有直接、简便的优点，但敏感性差就局限了它的诊断范围和实用价值.PCR检测这类标本，可以说极其有效.其极高的特异性和敏感性可以很容易地确定TB性脑膜炎及TB性胸腹水.另外，对于肾结核、泌尿生殖系统结核的诊断，PCR都可以予以完成.

4.抗痨治疗的评价:对于抗痨治疗效果的评价，以前的方法显得软弱无力.而PCR法则可以通过定期检测，采用定量PCR法确切地评价抗痨药物的疗效及残存菌的数量和活性度.在体内一般情况下，细菌死后，其蛋白系统很快崩溃，而DNA则能相对较长时间地保存下来.这些DNA在某种情况下又会复活.所以，细胞的死亡最可靠的评价指标是其基因DNA的完全降解.特别是在许多问题未搞清楚以前，更应该以DNA的降解来判定病原体的死与活.从理论上讲，PCR扩增结果将是最可靠的疗效评价指标.

5.修正以往所谓“正确”的观念:致病菌与机体的防御系统是一对激烈的矛盾，致病菌可以以任何方式和通路打击人体的防御系统，以便其生存和繁殖.在健康人群和周围环境中都携带或存在有大量的TB，但何时何地才会造成机体致病呢?以往认为TB很少存在于外周血，这主要是因为外周血中查不到TB，或TB已被局限在肺组织中.但很难让人相信的是，肺部血管极其丰富，淋巴组织和血管网共同构成人体的细胞外液贮存和交换的场所.所以，二者之间的交换是经常的.这种交换就包括能透过毛细血管壁的致病菌.当然，对于TB来讲，大多数细菌将被机体的免疫器官禁固起来.但仍有不少“漏网之鱼”，只是以前所用的方法敏感性及特异性均不够.但在某些情况下，如情绪低落、过度劳累、感冒等情况下，机体防御系统功能减弱，就会造成致病菌的攻击发生疾病.所以PCR技术对于评估临床疗效、疫情的检控、发病机理的探讨均有十分重要的意义.

六、PCR在检测TB中的注意事项

PCR如操作不严格会出现假阳性和假阴性结果.

发生假阳性最常见的原因是:样品间的污染和扩增产物的污染.样品间的交叉污染最易发生在样品的处理过程之中.如大家共用一个加样器、剪刀、位置等，因此在处理活检标本时，用剪刀剪碎组织块，每个标本用后，剪刀应在火上烧数分钟，以彻底清除污染在剪刀上的DNA.对于液态标本的处理，尽可能在同一管子内处理.用具应为一次性的.要解决好扩增物的污染，最佳的方式是减少操作的时间，简化操作手续并使用一次性离心管及接头.因为扩增产物的量一般很高，易于污染实验室任何地方.所以减少打开反应管的次数会降低假阳性的发生率.

9. 试述结核菌素实验的方法，结果及意义

原理：
结核菌素皮肤反应是迟发型细胞超敏反应。它是抗原（结核菌或卡介苗）进入机体使机体的免疫T淋巴细胞致敏，并大量分化增殖。
当已致敏的机体再次遭受到抗原入侵时，致敏淋巴细胞就会与之结合，引起变态反应性炎症。表现在结核菌素注射部位形成硬结甚至发生水泡、坏死。
结素试验阳性表明机体曾经受到结核菌感染或接种过卡介苗，也表示机体对结核菌有一定免疫力。但也有少数免疫力低下的人（约5%）呈阴性或因技术原因而呈现假阴性。通常接种卡介苗后，若PPD皮试阴性，说明接种失败。
结核的免疫特点为“免疫、感染、超敏反应”共存。
判断：
通常在前臂掌侧皮内注射5IU的PPD，经48-72小时检查局部反应，凡硬结直径平均〉5㎜为阳性；6-10㎜为+；11-20㎜为++；＞20㎜为+++；局部发生水泡为++++。
意义：
（一）阴性反应
未受结核杆菌感染，或免疫反应窗口期。
（二）阳性反应
说明已受结核杆菌感染，可能有以下几种情况：
1、结核病患者，但不能作为确诊依据；
2、卡介苗接种后，免疫反应已建立；
3、3岁以内未种卡介苗者，提示体内存在结核病灶；
4、非结核分枝杆菌交叉反应。
（三）强阳性反应
1、有助于确诊结核病；
2、已感染，未发病者；
3、强阳性人群结核病发病率高，在未找到病变时，可以实施预防性治疗；
4、强阳性伴有肺部病灶时，则有利于结核病的诊断。但肺部无病灶时，说明机体处于结核菌敏感状态。

10. 牛如何检测结核病

诊断牛结核的有效方法是用牛型结核菌素对牛实施皮内注射法和点眼法检疫，每次检疫各做两回，任何一种方法是阳性反应，即为牛结核菌素反应阳性牛。
（1）皮内注射法。不足3月龄的小牛于肩胛处，其他牛于颈部上中1/3部交界处皮内注射结核菌素，具体剂量，3月龄以下牛0.1毫升，3月龄至1岁的牛0.15毫升，1岁以上的牛0.2毫升。注射后经48～72小时观察注射部位的反应。如果注射局部肿胀面积达35毫米×45毫米以上，或注射前的皮厚差在8毫米以上，判为结核菌素阳性反应。
（2）点眼法。将结核菌素点入牛眼内3～5滴，约0.2～0.3毫升，于3、6、9和24小时观察反应。点眼后出现脓性眼眵，均为结核菌素阳性反应。