絮状免疫沉淀实验常用操作方法

⑴ 沉淀反应的介绍

免疫沉淀反应(Immunoprecipitation)主要用于抗原或者抗体的定性检测。其原理是指可溶性抗原与相应抗体在有电解质存在的情况下，按适当比例所形成的可见沉淀物现象。据此现象设计的沉淀实验主要包括絮状沉淀试验，环状沉淀试验和凝胶内的沉淀试验。凝胶内的沉淀试验依所用的实验方法又可分为免疫扩散实验和免疫电泳技术2类。

⑵ 免疫沉淀法(IP)的原理及方法步骤

原理就是溶液中的离子强度不同时，不同蛋白质的溶解度不同，步骤就是不断加硫酸铵…以血浆为例：加到盐浓度20~30%时纤维蛋白原沉淀，再加到浓度50%时球蛋白沉淀，饱和时清蛋白沉淀…

⑶ 免疫沉淀的实验步骤

（1）收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上或者4℃裂解30min,
12,000g离心30
min后取上清；
（2）
取少量裂解液以备Western
blot分析，剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50
μl
protein
A/G-beads加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；
（3）免疫沉淀反应后，在4°C
以3,000
g速度离心5
min,将protein
A/G-beads离心至管底；将上清小心吸去，protein
A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3-4次；最后加入15μl的2×SDS
加样缓冲液，沸水煮10分钟；
（4）SDS-PAGE,
Western
blotting或进行质谱分析。

⑷ 常用蛋白质沉淀方法有哪些有哪些应用实例

1、盐析法：此方法并未破坏蛋白质天然状态，沉淀出的蛋白质可不变性，所以盐析法是分离制备蛋白质或蛋白类生物制剂的常用方法2、有机溶剂沉淀法：通过破坏蛋白质的水化膜而使蛋白质沉淀，此方法在常温下可使蛋白质变性，低温下可使变性速度减慢3、重金属盐沉淀法：可与蛋白质结合形成不溶于水的蛋白质沉淀，引起蛋白质变性。

⑸ 染色质免疫共沉淀的一般流程

ChIP 的一般流程：
甲醛处理细胞---收集细胞，超声破碎---加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合---加入ProteinA，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀---对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合---洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物---解交联，纯化富集的DNA-片断---PCR分析。
在PCR分析这一块，比较传统的做法是半定量-PCR。但是现在随着荧光定量PCR的普及，大家也越来越倾向于Q-PCR了。此外还有一些由ChIP衍生出来的方法。例如RIP（其实就是用ChIP的方法研究细胞内蛋白与RNA的相互结合，具体方法和ChIP差不多，只是实验过程中要注意防止RNase，最后分析的时候需要先将RNA逆转录成为cDNA）；还有ChIP-chip（其实就是ChIP富集得到的DNA-片段，拿去做芯片分析，做法在ChIP的基础上有所改变，不同的公司有不同的做法，要根据公司的要求来准备样品）。
具体操作流程：
第一天：
（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎。
1、取出1平皿细胞（10cm平皿），加入243 ul 37%甲醛，使得甲醛的终浓度为1%（培养基共有9ml）。
2、37摄氏度孵育10min。
3、终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125M。450 ul 2.5M甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置5min即可。
4、吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。
5、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中（PBS依次为5ml，3ml和3ml）。预冷后2000rpm 5min收集细胞。
6、倒去上清。按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。这样每100ul溶液含1×106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设MCF7长满板为5×106个细胞。本次细胞长得约为80%。即为4×106个细胞。因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。将2管混在一起，共800ul。
7、超声破碎：VCX750，25%功率，4.5S冲击，9S间隙。共14次。
（二）、除杂及抗体哺育。
8、超声破碎结束后，10000g 4℃离心10min。去除不溶物质。
留取300ul做实验，其余保存于-80℃。
300ul中，100ul加抗体做为实验组；100ul不加抗体做为对照组；100ul加入4ul5MNaCl（NaCl终浓度为0.2M），65℃处理3h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。
9、在100ul的超声破碎产物中，加入900ul ChIP Dilution Buffer和20ul的50×PIC。
再各加入60ul ProteinA Agarose/Salmon Sperm DNA。4℃颠转混匀1h。
10、1h后，在4℃静置10min沉淀，700rpm离心1min。
11、取上清。各留取20ul做为input。一管中加入1ul抗体，另一管中则不加抗体。4℃颠转过夜。
（三）、检验超声破碎的效果。
取100ul超声破碎后产物，加入4ul 5M NaCl，65℃处理2h解交联。分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。
第二天：
（一）、免疫复合物的沉淀及清洗。
12、孵育过夜后，每管中加入60ul ProteinA Agarose/Salmon Sperm DNA。4℃颠转2h。
13、4℃静置10min后，700rpm离心1min。除去上清。
14、依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤：加入溶液，在4℃颠转10min，4℃静置10min沉淀，700rpm离心1min，除去上清。
洗涤溶液：a.low salt wash buffer-one wash
b.highsalt wash buffer-one wash
c.LiCl wash buffer-one wash
d.TE buffer-two wash
15、清洗完毕后，开始洗脱。洗脱液的配方：100ul10%SDS，100ul 1MNaHCO3，800ul ddH2O，共1ml。
每管加入250ul洗脱buffer，室温下颠转15min，静置离心后，收集上清。重复洗涤一次。最终的洗脱液为每管500ul。
16、解交联：每管中加入20ul 5M NaCl（NaCl终浓度为0.2M）。
混匀，65℃解交联过夜。
第三天：
（一）、DNA样品的回收
17、解交联结束后，每管加入1ul RNaseA（MBI），37℃孵育1h。
18、每管加入10ul 0.5MEDTA，20ul 1MTris.HCl（PH6.5），2ul 10mg/ml蛋白酶K。
45℃处理2h。
19、DNA片段的回收----omega胶回收试剂盒。最终的样品溶于100ul ddH2O。
（二）、PCR分析

⑹ Ascoli沉淀实验是怎样的

vAscoli试验（炭疽热沉淀反应）：
炭疽杆菌菌体多糖抗原能耐热、耐腐败，对于不适合进行炭疽芽胞杆菌培养的陈旧标本或已腐败的尸体脏器标本，经长时间煮沸，仍可与相应免疫血清(抗体)发生沉淀反应。
常用于皮革检疫。