peg方法融合细胞常用浓度

⑴ 细胞融合的融合方法

同种细胞在培养时2个靠在一起的细胞自发合并，称自发融合；异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合，称诱发融合。
仙台病毒法融合
①两种细胞在一起培养，加入病毒，在4℃条件下病毒附着在细胞
膜上。并使两细胞相互凝聚；
②在37℃中，病毒与细胞膜发生反应，细胞膜受到破环，此时需
要Ca2+和Mg2+，最适PH为8.0一8.2；
②细胞膜连接部穿通，周边连接部修复，此时需Ca2+和ATP；
④融合成巨大细胞，仍需ATP。
聚乙二醇（PEG）法
聚乙二醇（PEG）结构为：HOH2C（CH20CH2)nCH2OH，分子量大于200小于6000者均可用作细胞融合剂。PEG经高压灭菌后，与温热的Engle氏液混合。一般选用分子量为4,000，常用浓度为50%，pH8.0～pH8.2（用10%NaHCO3调整），分子量小的PEG，融合效应差，又有毒性，分子量过大，则粘性太大，不易操作。
电融合法
在直流电脉冲的诱导下，细胞膜表面的氧化还原电位发生改变，使异种细胞粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜，形成融合体。
优点：融合率高、重复性强、对细胞伤害小；
装置精巧、方法简单、可在显微镜下观察或录像观察融合过程；
免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控性强。
离心振动
物理方法之一，使用离心机等机器实现细胞之间的融合。

⑵ peg介导的细胞融合率受哪些因素影响

细胞膜有内外两层，细胞融合首先发生在外层，然后再到内层，由此就出现了两种融合通道，细胞体内物质通过这两种通道转移。病毒膜与目标细胞融合时，只出现一种融合通道，即导致融合的基因只能在病毒中找到，而在目标细胞中却找不到。

通过EFF-1发生的细胞融合则是一个双向融合过程，需要EFF-1出现在两个相互融合的细胞中。

理论上说任何细胞，都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。这对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间的遗传物质交换提供了有效途径。

体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体DNA亦可发生重组，从而产生新的核外遗传系统。淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备。

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有性繁殖时发生的精卵结合是正常的细胞融合，即由两个配子融合形成一个新的二倍体。而细胞融合为在自然条件下或用人工方法（生物的、物理的、化学的）使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的过程。

其中人工诱导的细胞融合，在六十年代作为一门新兴技术而发展起来。由于它不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合，因此细胞融合技术目前被广泛应用于细胞生物学和医学研究的各个领域。

自发条件下或人工诱导下，两个不同基因型的细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞。基本过程包括细胞融合导致异核体的形成，异核体通过细胞有丝分裂导致核的融合，形成单核的杂种细胞。有性生殖时发生正常的细胞融合，即由两个配子融合成一个合子。

⑶ 聚乙二醇融合法

具体操作过程如下：取等量、密度相近的两种不同原生质体悬浮液，在玻璃容器内混合均匀，取150μL左右的原生质体悬浮液滴在盖玻片上，缓慢加入450μL左右的PEG溶液，放在2030摄氏度条件保温培养0.51h，然后用原生质体培养介质将原生质体漂洗几遍以除去PEG，再将原生质体样品重新悬浮在培养介质中。
聚乙二醇法（PEG）为我国学者高国楠首创，是最成功的原生质体融合技术。PEG作为一种高分子化合物，由于PEG分子中醚键的存在使其分子末端带有微弱负电荷，能与水、蛋白质、糖等极性物质的正极形成氢键。当PEG分子足够长时，可作为邻近原生质表面之间的分子桥而使之粘连。PEG也能连接Casuperscript2+superscript等阳离子，Casuperscript2+superscript可在一些负极化基团和PEG之间形成桥，因而促进粘连。
在洗涤过程中，连接在原生质体膜上的PEG分子可被洗脱，这样将引起电荷的紊乱和再分布或使膜表面局部脱水，或改变构型使原生质类脂“液态”化而引起融合。PEG法已经广泛地用于原生质体融合，因为它能得到较高的异核体产率，对大多数细胞的毒性都很低，利于形成双核异核体。
PEG促融合是非特异的，因此对种间融合、基因间融合都是有用的。PEG法的缺点是对原生质体有一定毒害，而且融合率一般较低，不超过1%。

⑷ 细胞融合的方法有哪些

一、细胞融合的方法有三种：生物方法、化学方法、物理方法。
二、细胞融合也称细胞杂交 , 是指细胞通过介导和培养, 在离体条件下用人工方法将不同种的细胞通过无性方式融合( 合并) 成一个核或多核的杂合细胞的过程。体细胞融合后可形成四倍体或多倍体细胞，由此形成的杂交细胞，其特性会有很大的变化。
三、化学诱导融合1.盐类融合法。此法是应用最早的诱导原生质体融合的方法。盐类融合剂对原生质体的破坏小。今后研究应提高其融合率 ,使其对液泡化发达的原生质体能够诱发融合。2高钙和高pH值融合法。高 Ca2+和高pH值可以诱发融合。提高该方法的使用范围是亟待解决的问题。3、聚乙二醇融合法(PEG法) 。1974年发现的聚乙二醇(PEG)使不同科属的植物原生质体之间都可以融合，融合率可达30%。聚乙二醇是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子量的多聚体。PEG可与水分子借氢键结合，导致细胞脱水而发生质膜结构的变化，从而引起细胞融合。为了发挥PEG促进细胞融合的效力，必须采用较高的浓度(40%～50%，分子量为6000)，但PEG在高浓度下，细胞可能因脱水而受到显着的破坏。因此，选择合适的分子量、浓度及作用时间是PEG融合技术的关键。影响原生质体融合的因素很多。特别是环境中的阳离子存在，融合时的pH 也对原生质体融合有较明显的影响。一般来讲钙、镁离子有助于融合。如有钙离子存在时，可得到较高的融合率。但在缺乏钙离子时，若pH 较低，融合频率也较高。这是因为钙离子和带负电荷的PEG与细胞膜表面分子相互作用，使原生质体带电，彼此易于附着发生凝集所致。PEG诱导细胞融合由于具有容易制备和控制、活性稳定、使用方便等特点，在细胞融合领域取得了可喜的成绩，大量的研究仍采用此法。虽然PEG作为融合剂有很多成功的报道，但存在着对细胞损伤大、残存有毒性、融合率较底及经验性大等缺陷。
四、 物理诱导融合1。细胞电融合技术细胞电融合是以脂质膜和脂质一蛋白质膜的电学性质为基础的，以双向电泳和电子击穿细胞质膜的联合作用为手段，和细胞电注射构成一对互补技术。在短时间强电场的作用下，细胞膜发生可逆性电击穿(Reverisb leb reakdown)，瞬时失去其高电阻和低通透特性，然后在数分钟后恢复原状。当可逆电击穿发生在两个相邻细胞的接触区时，即可诱导他们的膜相互融合，从而导致细胞融合。细胞融合分为两步：第一步是建立细胞间接触(cell-to-cell contact) ； 第二步，接受区膜结构受扰动而紊乱，然后恢复并融合。根据其诱导细胞接触的性质，分为特异性和非特异性两大类。非特异性细胞电融合法是指在进行细胞电融合时，无法排除亲本细胞的自体融合而只进行双亲本间的细胞杂交融合。主要原因是细胞间的相互接触是无选择性的，是非特异性细胞聚集。非特异性电融合技术包括细胞物理聚集电融合法和细胞化学聚集电融合法。细胞融合所必需的两个步骤为：①细胞间接触；②接触区的膜结构受到瞬间扰动而导致融合。只要其中的任意一步有特异性，就能形成特异性的细胞融合。 2.激光诱导法。激光诱导细胞融合术是利用激光微束对相邻细胞接触区的细胞膜进行破坏(或扰动)，可将两个不同特性、不同大小的细胞在显微镜下实现融合。即利用光镊捕捉并拖动一个细胞使之靠近另一个细胞并紧密接触，然后对接触处进行脉冲激光束处理，使质膜发生光击穿，产生微米级的微孔。这样，由于质膜上微孔的可逆性，细胞开始变形融合，最终成为一个细胞。使用此技术时，使细胞接触的方法可用①光俘虏法；②用低浓度的融合剂PEG (5% )使细胞聚法。目前，最新颖的方法是利用激光光阱建立两细胞间接触，即光镊利用激光高斯光束光场的梯度力把细胞从光束边缘拉向光束中间，在光斑直径与光波波长尺度相比拟时，指向束腰的轴向梯度力要大于沿光束方向的散射力，该梯度力把细胞竖直地拉到激光束腰下方处，从而实现对细胞的操作。 

⑸ 促进动物细胞融合常用的化学诱导剂是什么

聚乙二醇（PEG）法

聚乙二醇（PEG）结构为：HOH2C（CH20CH2)nCH2OH，分子量大于200小于6000者均可用作细胞融合剂。PEG经高压灭菌后，与温热的Engle氏液混合。

一般选用分子量为4,000，常用浓度为50%，pH8.0～pH8.2（用10%NaHCO3调整），分子量小的PEG，融合效应差，又有毒性，分子量过大，则粘性太大，不易操作。

(5)peg方法融合细胞常用浓度扩展阅读：

在一般条件下，聚乙二醇是很稳定的，但在120℃或更高的温度下它能与空气中的氧发生作用。在惰性气氛中(如氮和二氧化碳)，它即使被加热至200～240℃也不会发生变化，当温度升至300℃会发生热裂解。加入抗氧化剂，如质量分数为0.25%～0.5%的吩噻嗪，可提高它的化学稳定性。它的任何分解产物都是挥发性的，不会生成硬壳或粘泥状的沉淀物。

⑹ 植物细胞的诱导融合，物理法是什么 化学法一般是用（），简写为（）做诱导剂

聚乙二醇（PEG）法
聚乙二醇（PEG）结构为：HOH2C（CH20CH2)nCH2OH,分子量大于200小于6000者均可用作细胞融合剂.PEG经高压灭菌后,与温热的Engle氏液混合.一般选用分子量为4,000,常用浓度为50%,pH8.pH8.2（用10%NaHCO3调整）,分子量小的PEG,融合效应差,又有毒性,分子量过大,则粘性太大,不易操作.

⑺ 原生质体融合的步骤

原生质体融合的程序包括：①标记菌株的筛选；②原生质体的制备和再生（过程见8.1.1）；③原生质体的融合；④融合子遗传标记的筛选；⑤融合子的鉴定。

8.2.2.1 标记菌株的筛选

进行原生质体融合的亲本需要携带遗传标记，以便于融合后重组子的筛选。常用营养缺陷型和抗性作为遗传标记，也可以采用热致死、孢子颜色、菌落形态作为遗传标记。遗传标记的选择要根据实际实验目的来确定。如果原生质体融合的目的是进行遗传分析，那么应该采用带有隐性基因的营养缺陷型或抗性菌株；如果从育种角度进行原生质体融合，由于大多数营养缺陷型菌株都会影响代谢产物的产量，所以在选择营养缺陷型标记时，应尽量避免采用对正常代谢有影响的缺陷型菌株。

8.2.2.2 原生质体的融合

原生质体融合就是把亲株的原生质体在高渗条件下进行混合。在原生质体融合中，诱导融合的方法主要有化学法（PEG促融法）、物理法（包括电融合和激光诱导融合法等）。

仅仅将原生质体等量地混合在一起融合频率通常是很低的，只有通过加入融合剂例如表面活性剂聚乙二醇（PEG）或特定物理措施例如电击和激光诱导等，融合频率才会提高。

（1）PEG促融法：其诱导融合的可能机制是PEG带有负电荷的醚键，与带负电荷的原生质体相遇后，在Ca²⁺等阳离子作用下形成共同的静电荷，从而促进异源原生质体的黏着和接合，常用的PEG是相对分子量为4000和6000的两种。在有钙离子存在的条件下融合时为碱性能刺激产生最大的融合频率，这是因为pH值能够改变体系的电性状态，从而影响原生质体的融合。PEG既是融合剂又是渗透压稳定剂，浓度低于20%会使原生质体破裂而失去稳定性，浓度过高又会引起原生质体收缩而降低融合频率，因此，融合时PEG的最终浓度常采用30%～40%。由于PEG的加入，原生质体间的黏着强烈地发生，融合就能较长时间有效地进行，所以PEG的处理时间不得太长。此外，PEG在高浓度下有毒，因此也要求融合时间不宜过长。

（2）电融合法：其原理是在短时间强电场的作用下，当原生质体被置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体，使原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串，原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲，细胞膜发生可逆性电击穿，瞬时失去其高电阻和低通透性，然后在数分钟内恢复原状。当可逆电击穿发生在两个相邻细胞的接触区时，即可诱导它们的膜相互融合，从而导致细胞融合。电融合是以空间定向，时间同步的可控方式来实现原生质体的融合，从而改变了PEG融合的随机过程。该法的优点是融合频率高，无化学毒性，操作简便，可在显微镜下进行，具有极强的可操控性。

（3）激光融合法：其原理是先让细胞或原生质体紧密贴在一起，再用高峰值功率密度激光照射接触处，从而使质膜击穿或产生微米级的微孔，质膜上产生微孔是一个可逆的过程，质膜恢复的过程中细胞连接微孔的表面曲率很高，使细胞处于高张力状态，此时细胞由哑铃形逐渐变为圆球状，进而细胞发生融合。该法的优点是毒性小，损伤小，具高度选择性；缺点是操作技术难度大，所需设备昂贵复杂，因此很难被推广应用。

8.2.2.3 融合子遗传标记的筛选

原生质体融合后，融合子的选择方法是使原生质体融合技术得以应用的关键。以A和B细胞融合来说，可能会形成AA，AB及BB 三种融合形式。而要筛选出的是AB，即具有A细胞核B细胞的两个遗传标记就可以确定其为融合子。因此，就可以通过A和B细胞所分别具有的选择性遗传标记，在选择培养基上挑出融合子。但是，由于原生质体融合后会产生两种情况，一种是真正的融合，即产生杂合二倍体或单倍重组体；另一种是暂时的融合，形成异核体。两者均可以在选择培养基上生长，一般前者较稳定，而后者则是不稳定的，会分离成亲本类型，有的甚至可以以异核状态转接几代。因此，要获得真正的融合子，必须在融合原生质体再生后，进行几代自然分离、选择，才能加以确定。融合子的筛选是融合过程的关键。下面列举几种常见的筛选方法。营养缺陷型标记筛选融合子、抗药性标记筛选融合子、荧光色素标记筛选融合子、灭活原生质体标记筛选融合子、利用双亲对碳源利用不同而筛选融合子和利用某些特殊生理特征作为标记筛选融合子等方法筛选。

8.2.2.4 融合子的鉴定

融合子筛选出后，还要对其进行鉴定。常用的鉴定方法有菌体或孢子形态、大小的比较，同工酶电泳谱带的比较，酶活性的测定，DNA含量的比较，对结构蛋白及非基因直接编码的次生代谢产物的分析，对染色体稳定性的研究等。刘玲等（2007）采用酯酶同工酶电泳对f1和f2融合子进行鉴定，融合子有不同于亲本的新酶带出现，融合子菌落呈现新的性状，菌落形态、颜色、菌丝形状都与亲本部分性状相似，又存在差异，并且菌株生长速度也不同于双亲本，在生理生化性状上与亲本存在明显的差异，这说明融合子f1、f2是融合双亲性状的新菌株。

⑻ 影响PEG融合的因素

答：1. PEG的分子量与浓度: 细胞融合效果与PEG的分子量及其浓度成正比；但PEG的分子量越大、浓度越高, 对细胞的毒性也就越大。为了兼顾二者，在实验时常常采用的PEG分子量一般为1000~4000，浓度一般为40~60%。2. PEG的pH值: 经验证，PEG的pH值在8.0~8.2之间融合效果最好。3. PEG的处理时间: 处理时间越长，融合效果越好, 但对细胞的毒害也就越大。故一般将处理时间限制在1分钟之内。本实验中细胞融合后无需继续培养, 故处理时间可适当放宽至数分钟。4. 融合时的温度: 由于生物膜膜的流动性与温度成正比，故细胞的融合效果也与温度成正比。因此，为了获得更好的融合效果, 在细胞可能承受的温度范围内可适当提高处理的温度。对于哺乳动物的细, 一般采用的温度为38~40℃。