常用重组质粒转染的方法有

① 重组质粒是如何导入受体细胞的

各种方法。
一般大肠杆菌用CaCl2转染法。
动物或植物可以采用脂质载体，基因枪，电击，显微注射，花粉管通道，病毒转染等方法

② 重组dna技术包括哪些主要步骤

重组DNA技术主要包括四个步骤：提取目的基因、目的基因与运载体结合、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测和表达。

1、提取目的基因

获取目的基因主要有两条途径：一条是从供体细胞的DNA中直接分离基因；另一条是人工合成基因。直接分离基因最常用的方法是“鸟枪法”，又叫“散弹射击法”。

2、目的基因与运载体结合

目的基因与运载体结合的过程实际上是不同来源的DNA重新组合的过程，是基因工程的核心。

3、将目的基因导入受体细胞

用人工方法使体外重组的DNA分子转移到受体细胞，主要是借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。目的基因导入受体细胞后，就可以随着受体细胞的繁殖而复制，由于细菌的繁殖速度非常快，在很短的时间内就能够获得大量的目的基因。

4、目的基因的检测和表达

目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达过程。

(2)常用重组质粒转染的方法有扩展阅读

重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。

重组DNA技术使用的酶有限制性核酸内切酶、DNA连接酶。常用的载体有质粒载体、噬菌体载体、Ti质粒、人工染色体。

③ 重组质粒导入兔的成纤维细胞的方法

重组质粒导入兔的成纤维细胞的方法是显微注射法。迄今为止，显微注射技术是转基因动物中采用最多，也是最为有效的一种将目的基因导入动物细胞的方法。

④ 质粒的转换的方法有哪些质粒转化后如何筛选

转化的方法：最常用的是感受态法，包括热激和电转化等，转染不是转化，这是不同的概念。

转化后，可以根据质粒上带有的某种特殊基因的表达来鉴定菌落，最常用的有：抗药性基因的表达，比如质粒带有氨苄抗性基因，能在AMP平板上长的一般可以初步判断为转化成功的菌；还有就是显色筛选，比如质粒上的LacZ基因表达，间接促使添加了X-gal的培养基变蓝，绿色荧光蛋白基因表达后菌落发荧光等。

⑤ 将重组DNA导入细胞内有哪些方法它们的原理是什么

(1)将重组质粒导入原核细胞称转化，通常用氯化钙法使大肠杆菌细胞处于感受态，从而将外源DNA导入细胞。另一个常用方法是用脉冲高压电瞬间处理，使外源DNA高效导入细胞，称为电穿孔法。
(2)将重组体DNA包装成噬菌体，使外源基因导入宿主细胞称转导，在适宜条件下使转化率提高。
(3)将外源基因导入动物细胞常用方法有磷酸钙转染技术，电穿孔转染技术，脂质体载体法，DEAE-葡聚糖转染技术，显微注射法等。将外源基因导入植物细胞常用方法是用Ti质粒将外源基因导入植物的外植体，也可将植物细胞的细胞壁消化，再用将外源基因导入动物细胞常用方法将外源基因导入原生质体，再诱导产生细胞壁。还有一个方法，是用基因枪将外源DNA射入植物组织或细胞。

⑥ 质粒转化步骤

质粒的转化，满满干货
原理：在受体细胞经过化学试剂或者电击处理等方法处理后，受体细胞的膜通透性发生改变，质粒DNA或者以其为载体的重组DNA分子，进入到细菌体内而实现扩增。

感受态细胞：是指细胞自然或者经过诱导处于容易吸收外源DNA的一种生理状态。在基因工程中，用于转化的受体菌（Restriction-Modification 缺陷变异株，以防止对导入外源DNA进行切割）一般通过诱导的方式实现。主要原理就是通过处理使细胞的通透性变大，直观的说，使得细胞膜表面出现一些孔洞，便于外源基因或载体进入感受态细胞。由于细胞膜的流动性，这种孔洞会被细胞自身所修复。

质粒的转化主要包含

Ⅰ感受态细胞制备

Ⅱ质粒DNA转化

Ⅲ质粒DNA的提取

（Ⅰ）感受态细胞制备

1）从新活化的大肠杆菌（常用DH5a）平板上挑取一个单菌落，接种于3ml LB培养基的试管中，37℃振荡培养过夜。

2）将该菌悬液按照1:100转接到液体培养基中，100ml，37℃振荡扩大培养，2~3h。当培养液开始浑浊时，间段性测试OD600，在数值为0.3-0.5时停止培养。

3）培养好的菌液转移到离心管中，冰上放置20min，0℃-4℃离心10min（4000r/min）。

4）弃掉上清，管口倒置以便培养液弃除干净。

5）加入0.1mol/L冰冷的氯化钙溶液30ml，小心悬浮沉淀细胞，冰浴30min。（氯化钙的浓度和纯度非常重要，不同批次不同厂家的产品均可影响感受态转化率）

6）4℃离心10min（4000r/min）。

7）弃掉上清，用0.1mol/L氯化钙2ml冰浴悬浮细胞（冰上放置）片刻，感受态细胞制成。

8）可直接用于实验，4℃保存。也可分装长期保存，加入总体积15%的灭菌甘油，-70℃条件下保存。

（Ⅱ）质粒DNA的转化

1）取100ul新鲜制备的感受态细胞，加入质粒1ul DNA混匀,同时设置对照组（未加质粒，未加受体菌，已知具有转化活性的DNA）。

冷冻的感受态细胞要在冰上解冻，待管中最后一点冰融化后，迅即加入DNA. 解冻感受态细胞温度高于0℃，会降低转化效率。

2）冰浴30min，离心管放到42℃保温90s（不要摇动离心管）。冰浴时间短于30min ,可能影响转化率。然后迅速冰浴2min。

3）向离心管加800ulLB液体培养基，37℃振荡培养1h（150r/min）。37℃生长1小时能够对于细胞恢复和抗生素抗药性表达具有最佳效果。

4）取适当（50ul）的复苏细胞培养液，涂布在含抗性的选择性培养基上，将培养皿放置在37℃恒温培养箱中，正置30min。等菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，在37℃恒温培养箱中，培养12~16h，出现菌落。

5）菌落结果：

① 无菌落

失败或者培养条件不充分

② 布满菌落,

呈苔样，失败。可能是抗生素浓度不够或失败。出现大菌斑，大多是由于霉菌污染所致

③ 布满菌落

浓度太高，失败

④ 出现菌落

符合要求

Ⅲ）质粒DNA的提取

质粒DNA的提取，由于其本身分子量小，一般采用碱裂解法提取。目前已研发出多种质粒提取试剂盒，实验操作简单，只需按照产品操作说明操作即可。不过对于其中主要试剂和作用的理解，能够避免实验过程中的一些问题，或者能够更好的解决问题。

各厂家提供的试剂盒中试剂不尽相同，一般的提取纯化试剂盒，主要包括以下试剂：

A. 细胞悬浮试剂: 主要作用是将菌体细胞悬浮起来。菌体悬浮不完全会导致裂解不完全，质粒的提取纯度和得率都会下降。通常需要在里面加入RNA酶（RNase A），RNA酶的作用很清楚，降解掉溶液中的RNA。通常选用Tris-HCl作为体系中pH稳定缓冲液。EDTA，金属离子螯合剂可以和细菌体内的金属离子结合而DNase的活性受到抑制。有的会有葡萄糖，可用来增加溶液粘度，保证菌体悬浮，延缓菌体沉淀时间。

B. 细胞裂解试剂：主要作用是裂解细胞，通过碱溶液的作用破坏细胞膜结构，使其双层膜结构改变，而导致细胞裂解。一般由一定浓度的NaOH和SDS组成。SDS的作用与后期中和过程中清除掉蛋白质等细胞杂质有关系。此步骤中需要注意的是，碱溶液的作用时间不能太长，也不可剧烈离心管，反之会导致碱破坏基因组DNA，导致同等大小的基因组DNA被提纯，造成污染。

C. 中和试剂：主要作用使中和掉细胞裂解试剂中的碱性物质，并去除掉其中的蛋白等杂质物质。组份有醋酸钾和醋酸，或者乙酸钾和冰乙酸。

D. 清洗Buffer: 主要是清洗掉多余的盐离子。DNA被试剂盒中的提取柱吸附之后，需要用wash buffer 洗脱掉多余的盐离子。主要成分有Tris-HCl和乙醇。需要注意的使乙醇对后续酶切和测序反应会有影响，因此在后续洗脱DNA前，必须完全清除柱子中的乙醇。

E. 洗脱Buffer: 主要作用就是洗脱硅胶柱上的DNA样品。

1.柱平衡：在柱中加入2ml的平衡buffer，通过重力的作用，使平衡buffer都流出。

2.细胞收获：对于高拷贝质粒（培养液中，>2µg DNA/mL)，吸取1-3ml培养液,离心去上清；对于低拷贝质粒（培养液中，<2µg DNA/mL)，吸取10-15ml培养液，离心去上清。

3. 细胞悬浮：加0.4mL的细胞悬浮液(containing RNase A)悬浮细胞，并使其混匀。

4. 细胞裂解：加入0.4mL细胞裂解液，通过上下颠倒带盖子管子5次使其轻轻混匀，不要涡旋，之后在室温下放置5min.

5. 中和：加入0.4mL的中和试剂，立即混合均匀。当大的细胞颗粒被处理后，可能会进行更剧烈的摇动。但是，不要涡旋！~12,000xg离心混合物10min. 如果是采用的4°离心，上清液需要恢复到室温，再加入到柱子中。

6. 装柱：吸取步骤5中的上清液到平衡柱中。让混合液通过重力的作用流出，弃掉流出液。

7. 柱子清洗：2.5 mL的Wash Buffer洗脱柱子量次。每次清洗让清洗液通过重力的作用流出，弃掉流出液

8. 质粒DNA洗脱：加入0.9mL的Elution Buffer。让Elution Buffer通过重力的作用流出。不要强行弄出里面的液体。

9. 质粒DNA沉淀：加入0.63mL异丙醇去析出，混匀，~12,000xg at/4°C离心30min。小心的去掉上清，之后风干10分钟

10. DNA纯化：将管子中的DNA溶解到TE buffer中。将这些溶液转移到新管中。

重组质粒鉴定的方法：

① 双酶切后跑电泳；直接DNA电泳可判断整个DNA重组质粒是否正确。② PCR(插入片段在2kb以下时)，然后电泳。

③ 送公司测序（最为准确的鉴定方式）。

影响转化效率的因素：

① 细胞状态和细胞密度: 培养菌最好选用传代次数少，且保存于-70℃或者-20℃。不要使用经过多次转接或者保存于4℃环境中培养菌。细胞生长密度以刚进入对数其为最好，可通过检测培养液的OD600值来判断，密度过高或者不足，都会影响转化效率。通常DH5α菌株在OD600的值为0.5左右，细胞密度在5*107个/ml左右比较合适。密度过高或者不足均会影响转化效率。

② 质粒的质量和浓度：转化的质粒DNA中，超螺旋状态的质粒，转化效率最好。在一定浓度范围内，转化的效率与添加质粒的浓度成正比。不过在添加的质粒的量和体积过大的时候，转化效率也会降低。质粒的分子量越大，通常来说转化率也会降低。

③试剂的质量：转化过程中所用的试剂，如氯化钙的浓度和纯度非常重要，不同批次不同厂家的产品均可影响感受态转化率。

④防止杂菌和DNA污染：实验需要在无菌条件下进行，所用的仪器和试剂均需要灭菌处理，并防止在实验过程中引入其他污染。

⑤培养过程的条件：培养瓶中培养基的量关乎到菌体生长过程中的能量代谢。通常来说厌氧环境做出来的感受态的转化效率较低。建议500ml三角瓶液体培养基量不超过100ml, 250ml三角瓶液体培养基量不超过50ml. 培养基的pH值要适宜，接种前一般pH值在6.8-7.2，等培养结束后可以再测一下pH值最好在6.5以上（不低于6.0），表示菌体的代谢为有氧代谢，生长状态良好。培养基中的各种离子和温度，也对形成好的感受态有关系。

几种扩增常用感受态细胞：

① 普通骨架载体cDNA产品

DH5α：常用于质粒克隆，可用于蓝白斑筛选

TOP10：适用于高效的DNA克隆和质粒扩增，能够保证高拷贝质粒的稳定遗传。

TG1: 生长速度快，常用于噬菌体的制备，同时也可用于普通质粒的构建。

CopyCutter：适用于有毒克隆。

② 慢病毒载体质粒：

Stbl3: 是慢病毒载体系统推荐使用的菌株，可有效抑制长片段末端重复区的重组，降低错误重组的概率

Stable（NEB）：可用于逆转录病毒/慢病毒载体系统扩增。

⑦ 细菌基因转移与重组的方式有哪些

细菌基因的转移与重组的方式有转化、转导、溶原性转换、接合。

1、转化：受体菌直接摄取供体菌游离的DNA段，从而获得新的遗传性状。

2、转导：以温和噬菌体为载体，将供体菌的遗传物质转移到受体菌中去，使受体菌获得新的遗传性状。

3、接合：是指细菌通过性菌毛将遗传物质（主要为质粒）从供体菌转移给受体菌，使受体菌获得新的遗传性状。

4、溶原性转换：是由于温和噬菌体的DNA（前噬菌体）整合到宿主菌的染色体DNA后，使细菌的基因型发生改变，从而获得新的遗传性状。

(7)常用重组质粒转染的方法有扩展阅读：

细菌基因的转移与重组属于细菌变异。细菌从外源取得DNA，并与自身染色体DNA进行重组，引起细菌原有基因组的改变，导致细菌遗传性状的改变。

细菌变异现象在临床上的实际意义:

1、诊断：应注意细菌的变异株，以免误诊，漏诊。

2、治疗：为提高抗菌药物疗效，防止耐药菌株的出现与扩散，在治疗前应先做药敏实验。

3、预防：用人工方法使病原出产生变异，减低毒力，保存免疫原性，制备减霉活疫苗，预防传染病。

⑧ 将重组质粒导入细菌的最常用方法是

不是 用氯化钙处理细胞壁（增强通透性）后可直接导入，过程非常简单。
显微注射最常用于用于动物细胞，植物可用农杆菌。