食用菌菌种分离方法特点

‘壹’ 细菌分离培养的基本要领和常用方法有哪些

一、基本要领

菌种分离主要在培养皿上进行，常用的方法是稀释法和划线法。

菌种分离的目的是是微生物的一个个体通过繁殖，在固体培养基上长出肉眼能见的群体，然后根据培养特征，用接种针调取所需菌种并在显微镜下检查，证明为单一形状的菌体。

改变培养基条件也有助于菌种分离。没有一种培养基或一种培养条件能够满足一切微生物生长的需要，在一定程度上所有的培养基都是选择性的。

如果某种微生物的生长需要是已知的，也可以设计特定环境使之适合这种微生物的生长，因而能够从混杂的微生物群体中把这种微生物选择培养出来，尽管在混杂的微生物群体中这种微生物可能只占少数。

二、方法

1、稀释倒平板法

首先把微生物悬液作一系列的稀释（如1:10、1:100、1:1000、1:10000），然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。

如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。

2、涂布平板法

因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。

其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的微生物悬液滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，经培养后挑取单个菌落。

3、平板划线法

最简单的分离微生物的方法是平板划线法，即用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。

有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。

4、 稀释摇管法

用固体培养基分离严格厌氧菌有特殊性，如果该微生物暴露于空气中不立即死亡，可以采用通常的方法制备平板，然后置放在封闭的容器中培养，容器中的氧气可采用化学、物理或生物的方法清除。

对于那些对氧气更为敏感的厌氧性微生物，纯培养的分离则可采用稀释摇管培养法进行，它是稀释倒平板法的一种变通形式。

先将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热使琼脂熔化后冷却并保持在50℃左右，将待分离的材料用这些试管进行梯度稀释，试管迅速摇动均匀，冷凝后，在琼脂柱表面倾倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物，将培养基和空气隔开。

培养后，菌落形成在琼脂柱的中间。进行单菌落的挑取和移植，需先用一只灭菌针将液体石蜡--石蜡盖取出，再用一只毛细管插入琼脂和管壁之间，吹入无菌无氧气体，将琼脂柱吸出，置放在培养皿中，用无菌刀将琼脂柱切成薄片进行观察和菌落的移植。

(1)食用菌菌种分离方法特点扩展阅读

在以上介绍的几种方法中，平板分离法普遍用于实验室微生物的分离与纯化，稀释法是液体培养基分离纯化常用的方法。

一般情况下可以通过适当改善培养基的条件来培养特点菌种。

如为了得到嗜热微生物，可在50℃~60℃下进行培养。有时投加相应的抑制剂也能提高菌种分离效果，如在土壤样品的悬浮液中投加10%的苯酚数滴，可以抑制霉菌和细菌的生长，而有利于放线菌的分离。在培养基中投加一定量的青霉素或链霉素能抑制细菌的生长，而有利于霉菌的分离。

‘贰’ 香菇菌种怎样培养出来的

自然界里，食用菌都不是单独存在的，而是和许多细菌、放射菌、霉菌等生活在一起的。所谓菌种分离，就是把这些和食用菌一起生活的杂菌分离出来，通过培养，获得纯的优良菌种。菌种分母种、原种、栽培种。
(一)母种的分离培养
食用菌母种的分离，可分为孢子分离法、组织分离法以及基内菌丝分离等。
1.孢子分离法
孢子分离法，是用食用菌的有性孢子或无性孢子萌发成菌丝，培养成菌种的方法。这种菌种生活力较强，但孢子个体之间有差异，且自然分化现象较严重，变异大，需经出菇试验才能在生产上应用。
(l)单孢分离法：是每次或每支试管只取一个担孢子，
让它萌发成菌丝体来获得纯菌种的方法。蘑菇和草菇用单孢分离得到的菌丝，有结实能力，可采用此法分离生产纯菌种。单孢分离生产上较少采用，而且技术复杂，一般采用多孢分离法。
(2)多孢分离法：就是把许多孢子接种在同一培养基上，让它们萌发、自由交配来获得食用菌纯菌种的一种方法。具体操作方法，有以下几种：
①种菇孢子弹射法：选择个体健壮、朵形圆正，无病虫害、出菇均匀、高产稳产，适应性强的八九分成熟的种菇，切去大部分，菌柄用无菌水冲洗数遍后再用已灭菌的纱布或脱脂棉、滤纸吸干表面水分。在接种箱或无菌室内，把种菇的菌褶朝下用铁丝倒挂在玻璃漏斗下面，漏斗倒盖在培养皿上面;上端小孔用棉花塞住。培养皿放在一个铺有纱布的搪瓷盘上，静置12～20小时，菌褶上的孢子就会散落在培养皿内。形成一层粉末状孢子印(平菇极淡紫色，蘑菇、草菇
为褐色，香菇、金针菇孢子印白色)。用接种针沾取少量孢子在试管中的琼脂外面或培养皿上划线接种。待孢子萌发，生成菌落时，选孢子萌发早、长势好的菌落进行试管培养。
还可用孢子采集器收集孢子。方法是选好种菇后，按上述程序，轻轻掀开玻璃钟罩，将种菇柄朝下插在孢子采收器的钢丝架上，放在培养皿正中央。随即盖好玻璃罩，用纱布将钟掌周围塞好。并在纱布上倒少许升汞或无菌水。移入
20℃左右恒温箱培养。
②褶上涂抹法：按无菌操作分离时;应选择成熟的种菇，用接种针直接插入褶片之间，轻轻抹取褶片表面子实体尚未弹射的孢子，再在培养基上划线接种。
③钩悬法：取成熟菌盖的几片菌褶或一小块耳片(黑木耳、毛木耳、白木耳〕，用无菌不锈钢丝(或铁丝、棉线等其他悬挂材料)悬挂于三角瓶内的培养基的上方，勿使接触到培养基或四周瓶壁。置适宜温度下培养、转接即可。
④贴附法：按无菌操作将成熟的菌褶或耳片取一小块，
用溶化的琼脂培养基或阿拉伯胶、浆糊等贴附在配管斜面培养基正上方的试管壁上。经6～12小时的培养，待孢子落在斜面上，立即把孢子连同部分琼脂培养基移植到新的试管中培养即可。
孢子分离得到的母种、必须进一步提纯复壮，当母种定植一星期左右，菌丝布满斜面时，选择菌丝健壮、生长旺盛无老化、无感染杂茵的母种试管，进而转管扩大，一般到栽培种，转管不宜超过5次。
孢子分离得到的母种，必须通过出菇试验，鉴定为优质菌种后，才可供生产使用。
一般菌类如蘑菇、平菇、凤尾菇、香菇、冬菇和草菇等，都可用多孢分离法获得母种。
现就银耳孢子分离略述于下：
按无菌操作获取种耳后，悬挂种耳的三角瓶经12小时培养后，瓶底培养基表面就有"孢子印"。取出种耳，置
20℃—25℃温箱培养2～3天，培养基表面会出现乳白色透明的糊状小菌落，就是银耳的酵母状分生孢子形成的少量银耳菌丝。此时移接入试管斜面培养基上，待长满斜面后，再移接入营养丰富，且表面比较干燥的培养基上。经30天左右，菌落长出白色菌丝。
银耳的酵母状分生孢子、菌丝只有与羽毛状菌丝的子囊菌(香灰菌丝)混合培养时，由后者帮助分解木材及其他一些纤维物质，提供营养，才能利于银耳孢子萌发，菌丝的定植和子实体的形成。
在两种菌丝交会时，先选出两种纯菌丝。
羽毛状菌丝要纯化选育，一般要选取生长迅速，爬壁力强的试管斜面或种瓶，取先端菌丝，转管移接，置25℃—28℃上培养，重复转管几次即可得到优良纯种。
银耳菌丝的特点，菌丝生长缓慢，担孢子也不易萌发。在进行两菌混合时，先取经8～IO天培养的银耳菌丝斜面，按无菌操作方法在该斜面上距银耳菌丝约0.5厘米处接入一
小块羽毛状菌丝。置25℃下培养1周即得到混合好的银耳母种。
2.组织分离培养法
利用子实体内部组织，进行无性繁殖而获得母种的简便方法，即组织分离。该法操作简便，菌丝生长发育快，品种特性易保存下来，特别是杂交育种后，优良菌株用组织分离法能使遗传特性稳定下来。常采用以下分离方法。
(l)子实体分离：种菇要选朵大盖厚，柄短，八九分成熟的优良品种。切去菇两基部，在无菌箱内以0.1%的升汞水浸几分钟，再用无菌水冲洗并揩干或用75%酒精棉球擦拭菌盖与菌柄2次，进行表面消毒。接种时，只要将种菇撕开，在萌盖和菌柄交界处或菌褶处，挑取一小块组织;移接
到PDA培养基上。置25℃左右温度下培养3-5天，就可以看到组织上产生白色绒毛状菌丝，转管扩大即得到菌种。如香菇、平菇等可以用此方法。
(2)菌核分离：茯苓、猪苓、雷丸等菌的子实体不易采集。而常见的是它贮藏营养的菌核。用菌核分离，同样可以获得菌种。方法是将菌核表面洗净，用酒精或升汞消毒后，切开菌核，取中间组织一小块，约黄豆大小，接种在PDA
培养基斜面上，保温培养。应注意的是，菌核是贮藏器官，大部分是多糖类物质，只含有少量的菌丝，因此挑取的组织块要大一些，如果组织块过小，则不易分出菌种。
(3)菌素分离：有一部分子实体不易找到，也没有菌核，可以用菌素进行分离。如蜜环菌、假蜜环菌。其操作方法是先用酒精或升汞将菌素表面黑色皮层轻轻擦拭2～3次，
然后去掉黑色外皮层(菌鞘)，抽出白色菌髓部分;用无菌剪刀将菌髓剪一小段，接种在培养基上，保温培养，即得该菌菌种。
菌素分离要注意：因菌素比较细小，分离素也比较细小，分离时极易污染杂菌，所以要严格操作。
3.基内菌丝分离培养法
利用食用菌生育的基质作为分离材料，来得到纯菌种的一种方法，叫基内菌丝分离法。
此种分离方法是适宜只有在特定的季节才出现，而且是朝生暮死，不易采得的子实体。基内分离法与组织分离法不同之点是，干燥的菇木或耳木中的菌丝常呈休眠状态。接种后有时并不立刻恢复生长。因此，有必要保留较长的时间(约1个月)，以断定菌丝是否能成活。基内菌丝分离法又可分为，材中菌丝分离(即菇木或耳木分离法)及土中菌丝分离法等。
(1)材中菌丝分离法：就是菇木或耳木分离法，为了减少杂菌的感染，菇(耳)木在分离之前，必须进行无菌处理。可以把菇(耳)水表面用酒精灯火焰轻轻烧过，以烧死霉菌的孢子，或再用0.1%的升汞水浸孢几分钟，然后用无菌水冲洗后用无菌滤纸吸干。接种块切取时应注意。接种块必须在该菌菌丝分布的范围内切取。所以，菌丝生长缓慢的种类应浅取;菌种生长快的种类可以深取。同时。还应根据菇菌的种类、木材质地、菇(耳)木粗细、发育时间的长短来确定菌丝分布的范围。然后用一把利刀进行切取。接种块应尽量小些，以减少杂菌感染机会，提离菌种的纯度。接种块移到培养基上，就应该放到适合菌丝生长的22℃～26℃
的温室或温箱中培养，使菌丝恢复生长。
(2)土中菌丝分离：食用菌种类很多，许多土生的食用菌;孢子不易萌发。组织分离也不易成功，用土中菌丝分离获得纯种的方法，叫土中菌丝分离。
土中菌丝分离时要注意，由于土中菌丝体的周围生活着多种多样的土壤微生物，因此分离时必须尽可能避开这些微生物的干扰，尽可能批取清洁菌丝素的尖端、不带杂物的菌丝接种，反复用无菌水冲洗，在培养基中加入一些抑制细菌
生长的药物，如
40微克/升的链霉素或金霉素。如发现感染细菌，可以把菌落边缘的菌丝挑出来，接种到木屑培养基中。因细菌没有分解木质素的能力，因此在木屑培养基中不易扩展;只局限于接种处。待菌丝长出感染区后，就可以再进行扩大提纯了。
(3)子实体基部分离：从瓶栽、袋栽或大床栽培的子实体基部分离出新菌丝的方法，叫子实体基部分离，现以袋栽银耳为例说明：
从出耳早、出耳率离、无病虫害的栽培室中;选择生活力最强的幼耳5袋，移到气候温和，有散射光的野外场所进行后期培养，以增强菌丝体的生活力。经培养7～10天后，待子实体直径达4～5厘米时便可取回，作为分离的母体。再从中筛选最理想的一朵，用利刀割掉银耳子实体，放置于
0℃的冰箱或有敌敌畏的容器中过夜，以便杀死瓶中的害虫。然后用75%酒精或升汞擦洗耳基和袋子外边的杂质，连同接种工具、接种培养基等移进无菌室。经灭菌后，用接种刀把袋口上部约15毫米厚的老菌根挖除，并进行培养。待袋口露出白色菌丝时，用接种针挑取一块半粒米大的白色菌结体，迅速移入母种试管培养基的中央，轻轻地脱去接种针，
塞上棉塞。
为了能够获得较多的母种，一次接种量要有100—200支试管，以便从中选择。分离后应及时移入22℃—24℃恒温箱或温室中培养。由于培养基内水分较多，菌丝恢复要比耳木分离得快。经2-3天后，分离物的边缘就可看
到白色菌丝。每天要至少观察两次，以便提纯。观察、提纯方法与耳木分离法担同。经适温培养10-15天后，当接种块扭结团出现红、黄色水珠时，即可扩大原种。
(二)原种和栽培种的接种培养
母种获得以后，为了满足菌种生产的需要。应选出优良、纯度高的母种进一步扩大为原种。
原种培养基一般采用棉籽壳、木屑、草类等培养基。
瓶装或袋装的原种培养基灭菌后，可送入灭过菌的接种箱内，待瓶中的培养基冷至30℃以下，可按照无菌操作程序进行接种。
菌种瓶(袋)放入培养室时，要经常进行检查，一经发现杂菌污染，立即取出。培养成的原种，菌丝体必须健壮有力，紧贴瓶壁而不干缩，颜色纯正，具有一定清香味，生活力强，扩制成栽培种时吃料快。
栽培种就是将原种进一步扩大培养成三级种，它和原种的接种及培养相同。一般香菇、平菇、冬菇、猴头、木耳、银耳的栽培种多用锯木、棉皮作培养基。蘑菇多用粪草做培养料。
栽培种要求料块不脱水干缩。菌丝体健壮有力、颜色纯正，有清香味，无老化现象，无杂菌污染，有的种许可有少量原基，接入栽培料后，发菌快，长势好，生活力强。
原种在接栽培种时，原种瓶口的一层菌丝体应挖去不用。
(三)液体种的简单培养
目前，用液体深层发酵法生产菌种，具有生产量大、周期短、菌龄整齐、成本低廉、接种方便等特点，是实现食用菌工厂化生产的目标。现将液体种培育过程简述于后，供参考。
简言之就是将纯正优良的菌种，接入液体培养基(固体培养基不加凝固剂)，使菌丝繁殖形成大量小菌球，然后将这种培养基拌入木屑或棉籽皮料内，制成菌块、培养其形成子实体。还可用于制原种、栽培种。
培养液体菌种，可将培养液装入三角瓶中，约占空瓶的五分之一重量。用摇瓶机(也称摇床)来培养。摇瓶机有旋转式和往复式两种，一般多用往复式。液体培养基可用马铃薯汁(加糖)，麦芽汁配制，也可用玉米粉、豆饼粉、糖、无机盐等配制。可以混合培养基，因适用于多种食用菌和药用菌的培养，均有好效果。组分：豆饼粉2%，玉米粉1%，
葡萄糖3%，酵母粉0.5%，磷酸二氢钾0.1%，碳酸钙 0.2%， pH自然， 12℃灭菌半小时。然后接种培养。
如果生产量较大，在三角瓶的基础上，再逐级扩大种子缸，发酵罐中进行液体深层通气发酵，产生大量菌种。但由于生产中要求设备繁多，技术性强，我们还应创造条件;实现食用菌栽培的现代化。
(四)菌种质量的鉴定
菌种质量鉴定最好的方法是，做出菇试验。但是时间比较长。在购置菌种时，或在菌种生产中，如何能知菌丝生长情况，快速判断菌种质量?我们介绍几种方法：
1.肉眼观察：优良菌种菌丝浓白，绒状，粗壮密集，生长整齐，速度快，香味浓厚。
2.优良菌种标准可归纳为："纯、香、正、壮、润"五个字。检查时，打开瓶塞，从菌种瓶中部取出小块菌丝体，观察色泽，闻其气味，手捏料块检查其含水量，看是否符合上述要求标准。
3.显微镜检查：挑取少量菌丝，置显微镜上观察其形态，菌丝分枝，分隔情况，锁状联合，细胞膜的厚薄。
培养观察：从菌种瓶中挑取小块菌丝体，接种斜面试管培养基上，置23℃～25℃恒温中培养，经五周后检查菌种生活力。如果菌丝生长快，旺盛纯一，健壮浓厚，长且整齐，则表示菌种的生活力强。
4.分块法：在桌上放一张白纸，把菌龄相同的菌种从瓶内取出一大块，用手分成2块，再把2块分成4块，4块
分成8块，依次进行。优良菌种整块多，碎渣少。劣次菌整块少，碎渣多。
5.液体菌种鉴别：当三角瓶或发酵缸培养3-7天后，如液面出现气泡，产生"油皮"、混浊等现象，说明菌种本
身带有杂菌。如菌块上浮，或迟迟长出很薄的菌丝层，则说明菌种生活力弱。白块四周的菌丝生长快、浓白、棉絮状，表明菌种生命力强。
(五)菌种生产过程中的杂茵防治
在生产菌种时，要时刻注意杂菌污染，以防为主，一旦发生，根治很不容易。所以整个制种过程都必须在无菌条件下进行。接种箱及所有分离、接种的用具、器皿，都要进行严格的消毒灭菌。工作人员的双手要用消毒剂清洗，并穿戴消过毒的工作服、帽和口罩，动作要敏捷、准确，尽量不要讲话走动，以防空气中的杂菌感染。
分离母种时，选择出菇早、生活力强，第一潮菇是关键，因它生活力强，接种后迅速占领阵地，无杂菌侵入的机会。
被污染的菌种，原因是多方面的，一般是灭菌不彻底所致，或因接种时无菌操作不严、瓶盖不合适造成的。所以灭菌一定要彻底，最好在接种萌将培养基置25℃左右温箱中做效果检查，经2天不长杂菌，说明彻底，可以使用，接种过程中一定要严格无菌操作。
污染杂菌另一个原因可能是分离母种时感染杂菌，因种菇表面带菌，消毒不彻底，通过组织块将杂菌带入培养基。
总之，污染机会很多，要注意环境消毒，按无菌操作规程彻底灭菌，层层把关，环环抓紧，严加注意;提离菌种质量。

‘叁’ 食用菌栽培有哪几种方法

微生物的培养方法有三种，即纯培养法、选择性培养法和优势培养法。
一、 菌种制作的基本设备
1、 食用菌菌种制作的工艺流程 培养料的贮备和预处理------- 容器、工具的洗涤------ 配料、培养基制作------ 灭菌------ 冷却------ 接种------ 培养------- 贮存 2、 基本设施 ① 厂房：② 原料库③原料预处理场地④ 洗涤室：5配料室⑥ 灭菌室⑦ 接种室⑧ 化验室 ⑨ 培养室⑩贮存室 二、 纯种分离 菌种的分离方法主要有：孢子分离法、组织分离法、基内菌丝分离法和土中菌丝分离法。
1、 孢子分离法：属有性繁殖。对于香菇、平菇异宗结合的菇类，为避免产生单孢不孕现象，必须采用多孢分离法。单孢分离法主要用于杂交育种的研究。
⑴ 种菇的选择和处理 种菇选择的标准：必须纯正，具有本菌株性状，发育健壮，无病虫害，成熟度适当。种菇选定后，首先除去附着在菇体表面的杂物，如蘑菇、草菇可用0.1%升汞浸泡消毒2-3分钟，然后用无菌水漂洗3次，以洗除表面附着的药物，最后用无菌纱布吸干水分。香菇、平菇可用75%酒精进行表面消毒。
（2）多孢分离法 ① 整菇播种法② 钩悬法③ 贴附法 4菌褶上抹取孢子法⑤ 孢子印分离法 ⑥ 空中孢子捕捉法
（3）单孢子分离法 一般采用方法：平板稀释法、连续稀释法、毛细管法等。
2、 组织分离法
（1） 子实体分离法
（2）菌核分离法
（3）菌索分离法：对一些不易找到子实体及菌核的菌类
3、基内菌丝分离法 对于子实体只有在特定的季节下出现，平时不易采到，或子实体小而薄或呈胶质状态
（1）菇木（或耳木）分离法 在食用菌繁殖旺盛期
（2） 代料基质分离法 分离前，选择一批子实体发生早、产量高、菇体尚幼嫩且生活力强而无病虫害的栽培袋，待子实体将近成熟时，去掉子实体，然后用75%酒精将培养袋进行消毒后，在培养料下1.5cm处挑取0.3cm的培养料小方块组织，接入试管培养基的中央，置于恒温下培养。
3、 土中菌丝分离法： 用于采集生长在土中的菇类菌丝体
三、制种技术 采用孢子分离、组织分离和基内菌丝分离等方法分离培养而获得的纯菌丝，经过原种的扩大培养和母种、栽培种的制作，即可作为食用菌生产用的菌种。
1、 菌种的类型 母种、原种、生产种
2、 培养基的种类 天然培养基、合成培养基、半合成培养基
3、 原种制作 从担孢子或菇体组织直接分离培养获得的原种或引进的原种
4、 母种及生产种制作 将原种菌丝体移植到由粪、草、木屑、棉籽壳或麦粒等原料配制成的培养基上，而制成的菌种称母种。将母种再扩大繁殖制成的菌种，称栽培种或生产种。
5、 培养基灭菌
（1）高压蒸汽灭菌法 琼脂培养基采用1.05kg/cm2 压力，温度121℃ ，灭菌45-60分钟；母种和栽培种固体培养基采用1.2-1.5kg/cm2 压力，温度123-129℃ ，灭菌1-1.5 小时。 （2） 常压蒸汽灭菌
6、 接种室消毒灭菌 熏蒸消毒法：甲醛与高锰酸钾混合熏蒸法
（2）紫外线消毒：（3）石碳
酸灭菌
7、 接种 在无菌条件下，将原种或母种菌种移接到经过严格灭菌的培养基上，称为接种。 8、 菌种培养
四、菌种保藏方法及复壮技术
1、 菌种保藏方法 菌种保藏的基本手段是采用低温、冷冻、干燥、减少供氧量等方法，终止其繁殖，降低其代谢强度，使之处于休眠状态。

‘肆’ 食用菌菌种分离有哪些方法

菌种分离：
有担孢子分离、组织分离（子实体、土壤中的菌根、菌素等）和基内分离（菇木）3种方法

‘伍’ 野山菌菌种分离法

组织分离就行啊，很简单。
在网络上搜索“组织分离法”，网络里有详细的介绍

特性说明
组织分离法简便，后代不易发生变异。组织分离最好采用正处于旺盛生长中的幼嫩子实体或菇蕾作为分离材料，采取菌盖与菌柄交接处的组织进行分离，效果最好，对于那些有内或外菌幕保护的菇类来说，取在菌幕保护下的幼嫩菌褶接种，生活力更加旺盛。对于某些菌根菌，则取用靠近基部的菌柄组织才能成活。

组织分离法例子
编辑
1.着名的黑木耳菌种“菊三”、“冬梅1号”、“雪梅1号”、“雪梅3号”、“984”就是黑龙江省柴河食用菌学会冬梅食用菌厂，通过对野生木耳组织分离，驯化选育成功的。
2.香菇组织分离方法
选用的子实体先经0.1%开汞水或70%酒精表面消毒后。用无菌水冲洗并用无菌纱布擦去表面水分。分离香菇时用无菌解剖刀自菌柄处切开少许，再用手将子实体掰开为二，在菌盖与菌褶交界处，切取0.3～0.4立方厘米的一小块菌肉，移放在斜面培养基中央。如已开伞的种菇、则选菌盖与菌柄交界处的菌肉。分离草菇时，用无菌解剖刀把菌蕾纵切少许；再用手把菌盖轻轻剥开，在菌柄上方和菌盖交界处，切取1～5毫米的细块，接在斜面培养基中。如种菇已受雨淋，吸水较多，应取菌褶作为接种材料。组织分离后将试管外面放在恒温箱中培养。待组织块周围萌发出菌丝，并向 培养基蔓延生长后，再挑取生长健壮的菌丝进行转管培养。组织分离法操作简便，又不易带入杂菌，容易获得纯菌种。但对银耳、黑木耳等胶质菌；因其子实体中菌丝的含量极少，如用组织分离培养，则往往不易成功。

‘陆’ 食用菌制种技术的分离与培养

食用菌菌种分离方法有四种，即组织分离法、孢子分离法、耳木分离法和土中菌丝分离法。
（一）组织分离法
组织分离法是利用子实体内部组织来获得纯菌种的方法，根据不同的分离材料大体可分为三种。
1、子实体组织分离
①、种菇的选择 从优良的品系中选取优良的个体作种菇，以单生菇、菇形圆整、无病虫害菇作分离材料。
②分离 把种菇带入接种箱内，用75%酒精表面消毒，用解剖刀在菌柄中部纵切一刀，然后撕开，挑取菌盖与菌柄交界处的一小块组织，接种到PDA培养基上，数天后就可看到组织块及培养基上有白色菌丝，即表明分离成功。
2、菌核组织分离 茯苓、猪苓、雷丸等药用菌，常利用菌核分离得到菌种。分离方法是将菌核表面消毒后，用解剖刀切开，取中间组织1小块，接入PDA培养基上，20℃—25℃培养。
3、菌索分离 密环菌，假密环菌常用菌索来分离。方法是将菌索表面消毒后，去掉菌鞘，把白色菌髓部分用无菌剪刀剪成小段。移接在PDA培养基上，20℃—25℃培养，有白色菌丝长出且无污染，即表明分离成功。
（二）孢子分离法
孢子分离法是利用菌类的成熟孢子能自动弹射的原理，在无菌操作条件下，使孢子在适宜的培养基上萌发长成菌丝体而获得菌种。
1、种菇的选择 孢子分离用的形态不同，孢子分离的方法也不同。
①整菇插种法：是将整只成熟度适当的种菇，经表面消毒后，插入孢子采集器内，放在适当的温度下，让其弹射孢子的方法。蘑菇、香菇、草菇等食用菌常用此法采集孢子。
②钩悬法：将新鲜的成熟度适当的耳片用无菌水冲洗后悬挂在无菌的三角瓶内或有孔钟罩内，在一定温度下让其弹射孢子。木耳、银耳常用此法采收孢子。
（三）、耳木（菇木）分离法
耳木（菇木）分离法是利用耳木或菇木中的菌丝体得到菌种的方法。
1、耳木的采集与选择 一般在该菌的生长季节里，选取生长的子实体大、肉质厚、成熟度适当、无杂菌感染的耳木或菇木进行分离。
2、分离方法 在所选耳棒长有子实体的部位，横断面锯下锯成1cm厚薄的木片，带入已经消毒的接种箱（或接种室）内。将上述木片浸入0.1%升汞溶液中30s—60s，用无菌水冲洗数次，以冲去残留的升汞液，放在无菌纱布上吸干水分，多面手用灭过菌的榔头，解剖刀切去树皮部分，把木片劈成小块，随后用镊子将小木块放入PDA培养基上，每管放一块，放适宜温度下培养。
（四）土中菌丝分离法
它是利用菌类地下的菌丝体来分离得到菌种的一种方法。主要用于腐殖质腐生菌的分离，用前述三种方法能分离得到菌种，一般不采用这一方法。但在野外采集时，菇类子实体已腐烂，而又十分需要该菌种时，就要用此法分离。具体操作如下：
①取菇体下与菇根相连的菌丝体，尽可能取较清洁的菌丝束。
②由于土壤中含有各种微生物，如细菌、放线菌、霉菌等，因此分离时要用无菌水反复冲洗菌丝束，把附着的泥土等杂物冲洗干净，把无菌棉花或纱布吸干水分。
③取菌丝束尖端部分，接入有细菌抑制剂的培养基中，25℃左右培养，无杂菌污染即分离成功。
④菌丝的鉴定。在土中获得的菌丝，其可靠性较小，必须经过出菇鉴定，才能确认是该菌的菌种。 接种后的原种或栽培种全部拿出培养箱或培养室，根据不同食用菌菌丝发育最适温 度进行培养。培养2～3天后，菌丝开始生长时，要每天定期检查，如发现黄、绿、橘红、黑色杂菌时，要及时拣出清理。尤其是塑料袋菌种，检查工作到菌丝长满为止。培养室切忌阳光直射，但也不要完全黑暗；注意通风换气，室内保持清洁，空气相对湿度不要超过65%；同时菌种瓶、袋不要堆叠过高，瓶间要有空隙，以防温度过高造成菌丝衰老，生活力降低。特别是对加温的培养室要注意：一要保持室内温度的稳定，因在温差较大的情况(特别是母种培养)会形成冷凝水，而使菌丝倒伏变黄。有条件的话，可根据菇类的菌丝生长对温度的要求，按品种分开放在不同温度的培养室(箱)内培养。同时要注意经常调换原种、栽培种排放的位置以使同一批菌种菌丝生长一致。二要注意通风换气，以免室内二氧化碳浓度过高而影响菌丝生长。

‘柒’ 什么是食用菌母种、原种和栽培种

母种:从蘑菇上直接分离得到的菌种(试管种,用培养基培养)。

原种:由母种扩大繁殖得到的菌种(瓶装种,用培养料培养,一般多拿罐头瓶或者小袋子培养)。

栽培种:由原种扩大繁殖得到的菌种(袋装种,用培养料培养,一般都拿蘑菇袋子培养)。

母种用来保存菌种,原种用来扩大菌种,栽培种用来生产的。

组织分离法组织分离法是通过切取菌索、子实体、菌核的新鲜幼嫩的组织进行分离，以获取纯菌丝的方法，是最常用的菌种分离法之一 。

子实体、菌索等实际就是双核菌丝的纽结物，具有很强的再生能力。因分离时所 选择的材料不同 ，该方法又可分为菌索组织分离法、子实体组织分离法及菌核组织分离法。

在实践中，子实体组 织分离法是最有效、最常用的方法。但对于胶质菌，由于其子实体中所含的菌丝量比较低 ，如黑木耳、银耳等，利用组织分离培养难度较大。

组织分离属于无性繁殖的范畴，能保持原菌株的特性，遗传稳定变异小，不仅适于孢子不易收集或萌发的食用菌，也适于稳定优良品种的遗传性。

孢子分离法 孢子分离法，是采取子囊果或子实体中成熟的子囊孢子或有性孢子萌发成纯菌丝，再进一步培养成菌种的方法。

由此法可以获得强活性、短菌龄的菌丝，该方法的另外一个优点是分离得到的有性孢子兼有双亲的遗传特性，可用于杂交育种和选育新种中。

只是孢子间不仅存在个体差异，还存在较普遍的自然分化现象，出现的变异较大，必须经过出菇试验后才能用于生产中团。对于产孢子的真菌，一般其分离法多采用孢子分离法。

以上内容参考：网络-食用菌菌种

‘捌’ 什么叫菌种分离

菌种分离就是用无菌操作技术将所需的食用菌与其他杂菌分开，让其在适宜的条件下生长繁殖而得到纯种。分离通常是在无菌条件下经分离技术进行的，是菌种制作程序中的一个非常重要的技术环节，其菌种质量的好坏，菌性的优劣与它有直接关系。菌种分离一般有孢子分离法、组织分离法和菇（耳）木分离法3种，其中组织分离法操作简便，能保持菇种特有的优良性状，一般不必做出菇实验，所以采用较多。

‘玖’ 银耳菌种分离有几种方法各有何特点

目前，银耳菌种的分离，常采用多孢子分离法、组织分离法和基内菌丝分离法3种。

（1）多孢子分离法

又称孢子弹射法。它是利用银耳子实层弹射有性孢子（担孢子）萌发成菌丝来获得纯白菌丝的一种方法。

（2）组织分离法

它是利用子实体的组织块或在银耳种瓶中挑取白毛团，移接到斜面培养基或木屑培养基上，培育成菌种的一种简便分离法。这种方法操作容易，继代能保持原菌株的优良种性，不易发生变异，被广泛采用。但如果选用的子实体感染病毒，分离得到的菌丝容易退化；若种耳耳片太老，菌丝成活率也很低。

（3）基内分离法

①在栽培袋群体中，选择标准种耳后，割去子实体，取菌袋内含有纯白菌丝体的耳基部位；②选取长有标准种耳的椴木，割去子实体，略烘干后从木质部分离纯白菌丝。这两种基质内获得的纯白菌丝移接斜面培养基中，在萌发的菌丝中进行提纯、转管培养。

上述3种方法均可获得纯菌种，目前生产上多采用组织分离法。

‘拾’ 菌种鉴定常用的分离方法有哪些

菌种质量检测的目标包括菌丝形态、菌落特征以及子实体形态等方面。质量检测常用方法如下：

（1）建立标准的培养和观察方法

对于一个栽培品种各菌种的质量检测，实际上是以该品种典型的生物学特性（包括形态特征、生理生态特性、栽培习性）为参照标准进行比较，以检验菌种是否存在品种退化、菌种老化、病菌侵染、杂菌污染和品种混杂等质量问题。同时，菌种质量检测不仅要考虑从哪些方面来评价一个菌种的质量优劣，也要考虑用怎样的标准方法对菌种质量进行评价的问题。因为一定的结果来源于一定的方法和一定的条件。方法和条件不同，结果就失去了可比性，也就无法鉴别，因此，需要建立标准。这些标准包括：培养基、培养条件（温度、湿度、pH、光照等）、菌种的菌龄等。

（2）连续观察

在菌种生长过程中，要连续观察，一切不正常的现象只有在生长过程中才能表现出来。而当菌种长满培养基表面后，其不正常现象往往会被菌种的过龄而掩盖。

（3）宏观检查

对食用菌母种、原种及栽培种的宏观检查要根据其培养特征来进行（参见前述有关内容），这是菌种生产者及使用者普遍使用的方法，简单易行，但需要有多年的从业经验与技术沉淀。如被检菌种表现出菌落生长速度不一致、气生菌丝变稀疏或出现扇变菌落、菌落上过早出现色素、或不同特征的菌落混杂共存、或菌落上出现黑褐色、青灰色、黄褐色或红色的孢子堆，均可以确定该菌种存在质量问题。优质菌种外观菌丝洁白、密集粗壮，生长速度一致，齐发并进。

在生产实践中，广大菇农和专业工作人员总结出“纯、正、壮、润、香”的质量检查方法。这种应用感官识别菌种优劣，是经验的总结，能大致、快速地鉴定出菌种的优劣。具体方法是：

“纯”指菌种的纯度高，无杂菌感染，无斑块、无抑制线，无“退菌”、“断菌”现象等。

“正”指菌丝无异常，具有亲本正宗的特征，如菌丝纯白、有光泽，生长整齐，连结成块，具弹性等。

“壮”指菌丝发育粗壮，长势旺盛，分枝多而密，在培养基上恢复、定植、蔓延速度快。

“润”指菌种含水量适中，基质湿润，与瓶壁紧贴，瓶颈略有水珠，无干缩、松散现象。

“香”指具该品种特有的香味，无霉变、腥臭、酸败气味。

通过检测各种食用菌菌丝生长的色泽、速度、均匀度等特征是否正常，来判断菌种生长是否正常、是否可用，但辨别不了是否优质高产。

（4）显微镜检查

对菌丝体进行显微观察，可以确定菌丝粗细、分枝、隔膜、锁状联合等特性是否均一，是否与该栽培品种的典型特征一致（参见前述相关内容）。具有不同形态特征的菌丝体存在于同一菌种体中，表明该菌种存在质量问题；如果出现菌丝体重寄生现象，常表现出不同特征的菌丝体相互缠绕，或菌丝体中空变细，或在寄生点出现吸器等不正常现象。

镜检的方法是：挑取少量菌丝，置载玻片中央的水滴上，用解剖针或接种针拨散，盖上盖玻片，也可加碘酒或美蓝等染色后进行镜检。正常的菌丝一般透明、分枝状，有横隔和明显的锁状联合；异宗结合的食用菌，如仅有单核菌丝，不具结实性，不宜作菌种用；双核菌丝中，锁状联合多而密，则结菇力强，一般可认为是好菌种。如：

①双孢菇 观察双孢菇单孢子萌发后的菌丝生长形态。凡菌丝洁白、健壮，保存时间较长时菌丝颜色不变，较耐28℃以上气温，生长在基质上平贴培养基表面，气生菌丝不多的，为同化能力较强，产量较高的菌株。相反，菌丝生长初期好，很快变黄变稀，如蜘蛛丝一样，长出培养基表面菌丝较多的菌株产量较低。

②香菇 观察香菇的双核菌丝，在斜面培养基上生长速度达到1.2厘米/天以上的，菌丝不十分粗壮和洁白，锁状连合频繁，锁状连合在菌丝间相距较近，且在观察面上分布均匀，一般均是高产和抗杂能力较强的菌株。香菇出菇的密度与锁状连合有一定关系。

③草菇 观察草菇菌丝，发现菌丝分枝角度大的，出菇率高，产量高。菌丝分枝角度小、平行排列的，产量低。

各种食用菌的菌丝生长是否正常、是否可用，一般都以色泽、速度、均匀度等特征加以检测，但这并不能说明其是否优质高产。

（5）拮抗试验

也称对峙反应。同一种食用菌，经分离或杂交，将选育出许多不同的菌株，这些菌株的菌丝在形态上很难区别。如不同编号的香菇菌种，都是白色绒毛状菌丝，镜检时均具有锁状联合等。在当前菌种管理工作尚不十分健全的情况下，“同名异种”、“同种异名”的现象普遍发生，要识别异同，可采用“拮抗试验”加以区别。具体方法是：

用1支20毫米×200毫米的无底试管，中央部位装入长 5～7厘米的木屑麸糠培养基，两端压平并盖棉塞，灭菌后，两端各接入两株受检的菌种 1小块，25℃左右条件下培养，当两端菌丝往中央生长并相互接触后，把试管移至20℃、约300勒克斯的漫射光下继续培养，观察菌丝接触区有无对峙反应。若无褐色的带线出现，表示两个受检菌株的基因极相似或相同，是相同的菌株，仅编号不同，即同种异名。如果受检菌株间形成带线，则表示是不同的菌株。

用平板进行拮抗试验测试，方法是在无菌的PDA培养基平板上各接入2个或多个被检菌株的菌种，在上述条件下培养，观察菌丝相接触部分有无带线，以区别相同或不同的菌株。也可用菌种瓶（袋）进行拮抗测试（图2-11）。

图2-11 拮抗现象

（6）菌丝长速测定

在适宜的条件下，若菌丝生长迅速、粗壮有力、浓密整齐，一般为优质菌种。若菌丝生长缓慢、中断或长速极快、稀疏无力、参差不齐和易枯黄萎缩，则为不良菌种。菌丝生长速度测定，可在PDA平板中心接种培养，测量菌落两个直交直径，取其平均值。同理，还可在原种、栽培种瓶（袋）壁上划线测定。

（7）菌丝生长量测定

将等面积的菌苔接入无菌的液体培养基内，在相同的条件下，进行摇床振动培养，经过一定时间后，过滤收集菌丝，反复冲洗干净后置容器内，80～100℃烘箱中烘干至恒重后称重。凡菌丝增殖快、重量重的为优质菌株，而增殖慢、重量轻的为不良菌株。

（8）耐高温测定

以双孢菇为例，把菌种置于20～22℃下培养，待菌丝长到1/2试管斜面时，每一菌株取出2～3支试管，置于35℃温度下，经24小时作抗热性试验，然后放到22～23℃下培养，观察菌丝恢复情况。若菌丝恢复萌发快，仍健壮、旺盛生长，则表明该菌株具有耐较高温的优良性状；如果菌丝生长缓慢，出现发黄倒伏，萎缩无力，则为不良菌株。

（9）均一性测定

将母种接种于标准培养基的平板上，并置于标准的环境条件下，每批做30～50个重复，进行长势和长速的连续观察记录。均一性好的品种，每个重复之间长势和长速几乎没有肉眼可见的差异。如果长势和长速不一，则表明原始的母种的遗传均一性不良，不宜作生产用种。

（10）纯度测定

菌种纯度高低是鉴定菌种质量好坏的关键环节。优质菌种要求同一管、瓶或袋内只含有所需要的菌种菌丝体，而不能含有其他种类的杂菌。这里所说的杂菌包括细菌、放线菌、酵母菌和各种霉菌，以及含有两种食用菌菌丝体或同一种食用菌的两个品种菌丝。凡是被杂菌污染的菌种都是不纯菌种，必须予以淘汰。在三角瓶内装入浅层液体培养基，灭菌后接入经捣散的菌种，25℃条件下培养，约1周观察，若有气泡和菌膜发生，并具酸败味，说明菌种不纯，混有杂菌；如果无上述现象则菌种纯正无杂。

（11）长势测定

菌丝长势包括菌丝生长的状态和速度。凡是菌丝生长迅速、整齐浓密、健壮有力的菌种为优良菌种。如果菌丝生长缓慢，或长速特快、稀疏无力、参差不齐、易于衰老，则表明是劣质菌种。在鉴别菌丝长势时，必须注意，在不同培养基上、不同培养条件下，同一种食用菌菌丝的长势不同，因此，判断食用菌的菌种长势，应采用相同的培养基，这样，结果就可靠一些。在外界环境条件相同的情况下，菌丝生长旺盛、生长量多、生长速度快的要好于菌丝生长弱、生长量少、生长速度慢的菌种。还有一种方法是在三角瓶内装入浅层液体培养基，灭菌后接入经捣散的菌种，25℃条件下培养，约1周观察浮在液面的菌种。如果菌丝向旁边迅速生长、健壮有力、边缘整齐，且不断增厚，说明该菌株生长势强；若表面生长慢、稀疏、菌丝层薄，说明长势弱，不宜用于生产。

（12）抗霉性测定

以木耳为例：制备平板，在平板的一边分别接入不同的木耳菌株，每一菌株3个重复，在26～28℃下培养。待木耳菌丝长到平板一半左右时，在平板的另一边接上木霉菌丝，继续培养。之后注意观察木霉菌丝与木耳菌丝的交界处，出现拮抗线的表示木耳菌株抗霉能力强，木霉菌丝无法长过去，为抗霉能力强的菌株。如果木霉菌丝很快盖过木耳菌丝，说明这个木耳菌株的抗霉能力差或没有抗霉力。

（13）出菇试验

对引进或分离的同一品种的若干菌株进行出菇对比试验，必须是在各级菌种的培养基成分、培养温度、培养时间及栽培条件基本一致的情况下进行。出菇试验可按菇类的常规栽培方法进行，数量可少些。为使试验准确，每一菌株设3～4个重复，以避免试验的偶然性。在位置排放上尽可能按菌名拉丁文排列，以相同的措施管理，在管理过程中对环境因子的变化、管理措施及生长历程、品种本身性状等要详细全面记录。以香菇为例记载内容如下：

①母种菌丝生长情况，如菌丝浓淡、生长快慢、菌苔韧性等。

②原种、栽培种中菌丝生长情况，如菌丝萌动、吃料、生长快慢；菌种表面有无菌皮或菌皮厚薄，白色颗粒状物有无或多少；培养基转色情况等。

③栽培阶段应记载：菇木转色快慢、颜色深浅；出菇快慢、菇生长密度；子实体经济性状，包括菇的大小、厚度、色泽、圆整程度、菌柄长度、粗细等；转潮快慢；对水分的敏感程度；产量及产量分布；出口菇比例等。

通过对记载资料分析，选出综合性状符合要求的菌株，供大面积生产或出售。

出菇试验因季节推迟或其他原因，可采用一种较简单的方法来弥补，即直接将接有各菌株并已发好菌的瓶（袋）装菌种，小心地敲破瓶颈或打开塑料袋口，使培养料外露（如果是双孢菇，则要覆土调好土粒的湿度），置最适宜的温、湿度条件下进行出菇（耳）管理，观察记载各项指标，最后进行评比。但这种方法的结果只能提供参考。

（14）栽培指标

采用一定的栽培规模，通过不同地区、不同原料、不同栽培方式，进行多次反复栽培观察，详细记录、评比后，具有优质、高产、高抗、高效和遗传性、稳定性强的菌株，才是优质和可推广的品种。其鉴定的内容、方法和指标有：

①吃料能力鉴定 将菌种接入最佳配方的原种培养料中，置适宜的温、湿度条件下培养，1周后观察种菇（耳）菌丝的生长情况。如果菌种块能很快萌发，并迅速向四周和培养料中生长伸展，则说明该品种的吃料能力强；反之，菌种块萌发后生长缓慢，迟迟不向四周的料层深处伸展，则表明该品种对培养料的适应能力差。对菌种吃料能力的测定，不仅用于对菌种本身的考核，同时还可以作为对培养料选择的一种手段。

②成活率 将菌种接在适宜的培养基上，若菌丝能很快恢复、定植和蔓延生长，成活率很高，是质量好的菌种；反之，接种后恢复慢，成活率不高是质量差的菌种。

③出菇快慢 一般说，高温型的出菇快，低温型的出菇慢，中温型的介于两者之间。而以菇的质量来说，高温型的质量差，低温型的质量好。但同一温型食用菌品种的不同菌株，其菌种接种后若菌丝分解培养料能力强，培养前后培养料失重大，出菇快而多，总产高，即是好菌种；否则为劣质菌种。

④菇峰间隔 在一个生产周期中，子实体发生可分数潮次，产菇最多时称菇峰，最低时称菇谷，每个菇峰和菇谷构成一潮菇。凡菇潮多，间隔时间短，说明菌丝分解能力强，供子实体发生的养分积累多，因此转潮快，是好的菌种；反之，菇潮间隔时间长，或不明显，零星出菇，产量低，即为劣质菌种。

⑤干燥率 鲜菇经干制后干燥率高，说明转化率高，子实体含水分低，为优质菌种。

⑥生物学效率 生物学效率，指每100千克干料可产多少千克鲜菇。生物学效率高，则菌种质量好，反之为劣质菌种。

（15）经济指标

高产不一定高效、丰产不等于丰收，要占领市场，获得较高利润，还必须具备商品的要求，如产品的色、香、味、形，档次，上市时间，货架期和保质期等。凡是鲜菇上市时间早，产量高、品质好、档次高、含水量低，不易变色、变质、破碎、失重，无农药残毒、残臭，符合食品卫生标准和得到的利润高等，均表示经济指标高，则为优质菌株；而上市有效时间短，易变色、变味、变质，含水量高，失水严重，易破碎，利润低的菌种均为劣质菌种。如香菇以大小适中、肉厚、色深、边缘内卷，柄短细为优良；双孢菇以色白、子实体大小适中，菌柄短，不易开伞等为优良；银耳以色白、开片好、蒂头小、松泡率高为优良等。