高效液相色谱仪的使用方法

‘壹’ 液相色谱仪的使用方法

液相色谱仪使用及维护

液相色谱仪使用时要非常的注意。

使用卡套柱时，两端的卡套应时刻连接在柱芯上。不管您是平衡色谱柱或是清洗，任何时候都不能将卡套取下来，否则会造成填料的流失。

液相色谱柱使用注意：

卡套柱的安装（加预柱）

1．将卡套架套入柱芯

2．将两片夹套片嵌入柱芯的凹槽，使夹套高于柱芯（见下图）

3．将已套到柱芯上的卡套架向上推，直至高过夹套片

4．将"子弹头"预柱放入卡套片内

5．将卡套帽和卡套架旋在一起，然后用手拧紧

6．然后依同样的顺序连接好柱子的另一端

平衡色谱柱

反相色谱柱在经过出厂测试后是保存在乙腈/水中的。请一定确保您所使用的流动相和乙腈/水互溶。由于色谱柱在储存或运输过程中可能会干掉，因此在用流动相分析样品之前，应使用10－20倍柱体积的甲醇或乙腈平衡色谱柱；如果您所使用的流动相中含有缓冲盐，应注意用纯水"过渡"。

硅胶柱或极性色谱柱在经过出厂测试后是保存在正庚烷中的。如果该色谱柱需要使用含水的流动相，请在使用流动相之前用乙醇或异丙醇平衡

如何平衡色谱柱？

平衡过程中，将流速缓慢地提高用流动相平衡色谱柱直到获得稳定的基线（缓冲盐或离子对试剂度如果较低，则需要较长的时间来平衡）

色谱柱的再生

进行色谱柱再生时，应使用一个谦价的泵，我们建议最好不使用您的高效液相色谱仪上的泵。


注意：

在对NH2改性的色谱柱进行再生时，由于NH2可能成铵根离子的形式存在，因此应该在水洗后用0.1M的氨水冲洗，然后再用水冲洗至碱溶液完全流出。 如果简单的有机溶剂/水的处理不能够完全洗去硅胶表面吸附的杂质，用0.05M稀硫酸冲洗非常有效。

色谱柱的维护

1．使用预柱保护分析柱（硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定的溶解度）

2．大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2－7.5，尽量不超过该色谱柱的pH范围

3．避免流动相组成及极性的剧烈变化

4．流动相使用前必须经脱气和过滤处理

5．如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕柱子冲洗干净，并保存大乙腈中

6．压力升高是需要更换预柱的信号

‘贰’ 高效液相色谱仪的使用和原理分析

高效液相色谱仪(HPLC)是分析实验室常用的测试仪器之一，其应用越来越广泛。此种仪器在使用过程中，难免会出现各种各样的问题，并将直接影响到所测数据的准确性和仪器的正常工作。操作者如果能了解故障的成因，即可清楚预防和排除这些故障的方法，就可正确地使用仪器并最大限度地发挥仪器的性能。今天我们要从以下几个方面和您分享下在使用高效液相色谱仪中需注意的几个问题。

一、使用试管的问题

1、试管的洁净问题。

高效液相色谱分析法是一个很灵敏的分析方法，如果因使用不洁净的试管，便会影响试验结果的准确性。例如，在用甲醇作溶剂来溶解样品时，所用的小试管是用橡胶塞来做盖子的，因此，在每次进样时，都有一个保留时间固定的干扰峰存在，后经证实，此干扰峰是由甲醇浸泡橡胶塞而溶下的组分所产生，换用玻璃试管后，干扰峰消除。

2、塑料试管的溶解问题。

近年来，一次性塑料试管给试验人员带来了极大的方便，但是，在使用过程中一定要注意有机溶剂对试管的溶解现象，在利用此种试管提取样品时，有些有机溶剂(如氯仿等)对管壁有溶解现象，这些被溶解下来的物质有时也能在检测器上产生信号，从而干扰样品的测定。这时，可用相同的实验条件先行试验一下，看看不含被抽提物时，提取液在检测器上能否产生干扰信号，如确有干扰信号存在，就只能换用耐有机溶剂的玻璃试管了。

3、被测样品在试管壁上的吸附问题。

这个问题也应引起注意，否则也会影响测试结果的准确性，在治疗药物监测(Therapeutic Drug Monitoring,TDM)中，有些被测药物如阿米替林，丙咪嗪等易吸附在玻璃试管的管壁上，因此，操作中宜采用聚丙烯管，为防止提取中吸附现象的发生，可采用0.5%的已二胺已烷液做为提取剂，可有效地防止吸附。

二、操作进样阀的问题

目前，在分析型高效液相色谱仪中常用的进样阀是7725型进样阀，其内部的六通阀结构使进样操作非常方便，但是，如果使用不当，也会带来问题。例如，在高效液相色谱法的试验过程中，有时会有异常色谱峰的出现以及重现性不好的问题，这主要是由于操作方法不当所引起，要想解决此类问题，需从以下几个方面入手。

1、进样量的控制。

用进样阀来进样时，阀内的样品环是定量的，(一般分析型进样阀的样品环体积为20ul)，由于进样时，注射到进样阀内的样品溶液在样品环的管路中有径向的速度梯度(即管轴处比管壁处的液流速度快)。因此，要想使样品环中充满样品溶液，从而使用进样阀来准确地定量，则必须使进样量大于样品环体积的2倍。如果用注射器来控制进样量，则最大只能注射样品环体积1/2的量，这样才能防止部分样品由溢流管溢出从而导致定量分析的误差。

2、进样阀的清洁问题。

如果样品环中有上次进样时样品的残留，必然会污染下次注射进的样品，为防止这种现象的发生，应按下列步骤操作：a.进样阀有2个位置，INJECT和LOAD。首先在LOAD位置时，以注射器将流动相注入进样阀内清洗几次，每次用量大约40ul；b.然后将进样阀板手扳至INJECT位置时，再以流动相清洗几次，每次用量还是40ul；c.最后，再将样品注射到进样阀里。

按照上述的步骤操作，可以避免由进样阀引起的污染，从而使干扰峰消除并提高分析结果的准确性。

3、进样阀溢流管的堵塞。

有时，进样阀的溢流管会发生堵塞现象，向进样阀内注射样品时，注射针推不动。此故障是由于溢流管的堵塞所致。堵塞的原因多半是由于溶解样品的流动相用的是盐溶液，而其中的盐在溢流管的排空端口处结晶所致。此时，可用小烧杯盛少量蒸馏水对溢流管口稍加浸泡，端口处盐的结晶就能被溶解掉，故障排除。如能在每次进样完成之后，用蒸馏水反复冲洗至溢流管中的盐分全部冲出，则可避免此故障的发生。

三、流动相(MOBLLE PHASE)的问题

甲醇和乙腈在高效液相色谱分析法中常常被用来配制流动相。高效液相色谱法中常用的试剂最好是高等级的专用试剂，如色谱纯试剂。在要求不太严格时，优级纯甚至分析纯的试剂也能用。高效液相色谱分析法中常用的是紫外检测器，因此，从降低基线噪音和提高分析灵敏度上来考虑，应该使用紫外吸收小且杂质含量少的色谱纯试剂。

1、流动相的过滤。

配制好的流动相在使用前一定要先用0.5um孔径的微孔滤膜来过滤。这是因为溶液中含有很多肉眼难以发现的微小颗粒，如果不把它们滤除掉，就会堵塞泵口、柱头上的过滤器，这样就堵塞了流动相的正常通道，使色谱柱的阻力增加，柱压升高，柱效下降。碰到这种情况时，要换用经过滤的流动相，并将堵塞的滤器拆下来浸泡在20%的硝酸水溶液中以超声波清洗机清洗20分钟，以除去滤片上的堵塞物。

2、流动相的脱气。

流动相在使用前必须脱气，以尽可能的除去溶解在流动相中的气体，否则，这些气体会使柱填料的性能降低，还能够对检测器的信号产生很大的干扰。脱气有多种方法，如超声脱气、真空脱气、氮气脱气等。真空脱气法和氮气流脱气法是目前最常用的脱气法。水和甲醇混合后会产生大量的气泡，如果不脱气就使用，气泡就会进入色谱柱和检测器，并将影响分析工作的正常进行。

四、色谱柱的使用和保养

色谱柱是高效液相色谱仪最主要的部件，被测物质能否被很好的分离和测定，色谱柱的性能起着决定性的作用。因此，在日常工作中，应特别注意色谱柱的正确使用和维修保养，以延长色谱柱的使用寿命。

1、使用预柱和保护柱。

预柱(pre-column)安装于泵和进样器之间，它给色谱柱中的流动相提供了完全的平衡，并防止了对柱填料有破坏作用的组分或污染物进入色谱柱。保护柱(guard column)可以阻挡能够牢固地吸附于色谱柱上的组分进入色谱柱，保护柱应与色谱柱的填料相同。预柱和保护柱可以经常更换，而不需要经常更换色谱柱，这就延长了色谱柱的使用寿命。

2、防止气体进入色谱柱。

有些色谱柱(如凝胶柱)是不允许气泡进入的，否则将会使柱效降低甚至形成微小的难以驱除的气室。因此，为了防止气泡进入色谱柱，一定要使用经过脱气的流动相，并且要严格按照下列步骤来安装色谱柱。a.拆卸下色谱柱入口处的密封螺丝，观察是否有溶剂渗出；b.如有溶剂渗出，即可将色谱柱接到管路上，以避免气泡的进入；c.如无溶剂渗出时，表明色谱柱的此端已经进去空气了，此时，可将色谱柱的出口端接到进样阀上，以流动相来反方向冲洗色谱柱，以便将柱内的空气排除。最好以0.2ml/min的小流量来冲色谱柱，如果溶剂的流速太快或者是压力突然的上升都将会导致柱性能的降低；d.如果流出的溶剂里不含有气泡，说明柱内的气体已经被排出了，再将色谱柱以正确的方向接好，这样气泡就进不到色谱柱里面了。

3、色谱柱的清洗。

为了不使被测物质和杂质停留在色谱柱中，在每次的样品分析工作完成之后，都应及时地清洗色谱柱。首先要用对被测样品洗脱能力强的溶剂来洗脱色谱柱，以分析工作中常用的反相色谱分析法为例，因其先流出的物质是极性大的物质，此时应用100%的甲醇或使用异丙纯、四氢呋喃等极性稍弱的溶剂将吸附在柱内的极性小的物质洗脱下来，洗脱液的用量一般为柱体积的20倍即可。如果流动相是缓冲溶液，则应先用蒸馏水来冲洗色谱柱，以冲掉柱内的盐，然后再用合适的溶剂来冲洗。

凝胶滤过色谱法(Gel Filtration Chromatography)中所使用的凝胶柱常用缓冲溶液做流动相，用完之后当然要用蒸馏水来冲洗。如果是连续操作，可以将缓冲溶液置于柱内过夜，但最好是维持小流速(＜0.5ml/min)以防止缓冲盐的析出，如果流动相中含有卤化物，即使是停一夜，也必须要用蒸馏水将色谱柱冲洗干净，以防止它们对柱体的腐蚀。

4、色谱柱的存放。

如果色谱柱暂时不用，存放时要注意以下几点：

a.几天之内的短期放置，应先用溶剂冲洗好色谱柱(如凝胶柱则用蒸馏水来冲洗)，再把色谱柱的两头用密封螺丝密封好即可。

b.如果色谱柱长期不用，仅用上述方法来处理就不行了，这时应使用色谱柱使用说明书中所指明的溶剂来充满色谱柱，反相柱一般使用甲醇，正相柱则可用正已烷或庚烷，而凝胶柱则不能用水了，因柱内如果有微生物的生长则会使柱效降低，此时应用0.05%的NaNs水溶液(防腐剂)来冲洗色谱柱，再将色谱柱封严。色谱柱长期放置时，一定要将色谱柱的两端封严，以防止由于溶剂挥发而造成的柱填料干缩现象，因这可导致柱效的严重降低。

c.色谱柱应贮存在室温下，如果放置于0℃以下的环境里，柱内就会结冰，这也将导致柱效的降低。

高效液相色谱仪的构造高效液相色谱仪（HPLC）一般由高压输液系统、进样系统、分离系统、记检测系统、数据处理系统等几部分组成。制备型仪器还需配有馏份收集系统。为了取得较好的分析结果，HPLC仪器对于准确度、精确度、灵敏度及结果重现性有较高的要求。

高效液相色谱仪的工作原理

储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱(固定相)内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附-解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。

(2)高效液相色谱仪的使用方法扩展阅读：

高效液相色谱仪的构造高效液相色谱仪（HPLC）一般由高压输液系统、进样系统、分离系统、记检测系统、数据处理系统等几部分组成。制备型仪器还需配有馏份收集系统。为了取得较好的分析结果，HPLC仪器对于准确度、精确度、灵敏度及结果重现性有较高的要求。

A

BOUT

高压输液系统

高压输液系统包括：溶剂储液瓶、溶剂脱气装置、高压输送泵以及梯度洗脱装置。其中，高压输液泵是高效液相色谱仪的主要部件之一，输送压力达150—350×105Pa。输液系统要为HPLC仪器提供流量恒定、准确、无脉冲的流动相，流量的精度和长期的重复性要好，同时还要提供精度好、准确度高、重现性好的多元溶剂梯度。因此，输液泵的好坏直接影响着整个系统的质量和分析结果的可靠性。

进样系统：进样能在试样引入色谱柱，有六个接口：1,4之间接定量环；2接高压泵；3接色谱柱；5,6接废液管。

色谱分离系统：色谱柱通常为不锈钢柱，内装各种填充剂。常用的填料为硅胶，可用于正相色谱;化学键合固定相，根据键合的基团不同，可用于反相或正相色谱。其中、最常用的是十八烷基键合硅胶，即ODS柱，可用于反相色谱或离子对色谱。

检测系统：检测系统用于连续检测色谱柱流出的物质，进行定性定量分析。要求其灵敏度高、噪音小、基线稳定、响应值的线性范围宽等。近年来各国都在研究开发新的检测技术，进一步扩大了HPLC的应用。

根据检测需要的不同检测器可分为紫外检测器(UVD)、示差折光检测器(RID)、电化学检测器(ECD)、红外检测器(IRD)、核磁共振检测器(NMRD)、质谱检测器(MSD)、蒸发光散射检测器(ELSD)、小角度激光散射检测器(LALLSPD)。

数据处理系统：高效液相色谱的分析结果除可用记录仪绘制谱图外，还可使用微处理机和色谱数据工作站来记录和处理色谱分析的数据。

‘叁’ 液相色谱仪的使用方法以及注意事项有哪些!

高效液相色使用方法：
1)．过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。
2)．对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。
3)．打开HPLC工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。
4)．进入HPLC控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。
5)．有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击
start，冲洗时速度不要超过10 ml/min.
6)．调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。点击injure，选用合适的流速，点击on，走基线，观察基线的情况。
7)．设计走样方法。点击file，选取select users and methods，可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法，点击new method。选取需要的配件，
包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。选完后，点击protocol。一个完整的走样方法需要包括：
a.进样前的稳流，一般2-5分钟；
b.基线归零；
c.进样阀的loading-inject转换；
d.走样时间，随不同的样品而不同。
8)进样和进样后操作。选定走样方法，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方法走完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。
9)．关机时，先关计算机，再关液相色谱。

‘肆’ 高效液相色谱仪的基本操作流程

1)、过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。 2)、对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。 3)、打开HPLC工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。 4)、进入HPLC控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。

‘伍’ 如何使用液相色谱

1．
电源准备
打开稳压器电源开关，须待电压指示至
220V
后，才能开启其他有关设备。
2．LC-600高效液相色谱仪的准备
试剂：三氟乙酸
乙腈
超纯水（Millipore
超纯水）
冰乙酸
溶液配置：贮液瓶与流动相的准备
A
液
0.1%三氟乙酸
（三氟乙酸
1ml，超纯水
999ml）室温保存
B
液
60%乙腈
（乙腈
600ml，
超纯水
400ml）室温保存
样品液
0.01%乙酸
（冰乙酸
10

l
超纯水
100ml）室温保存
泵头冲洗液：精滤后超纯水或者是
1%色谱纯甲醇
室温保存
注：贮液瓶应用超纯水淌洗干净，备用。
流动相溶剂用洁净
G4
玻沙漏斗精滤除去微小颗粒（目前未滤过溶液）。
操作者必须清楚并注明
A、B
贮液瓶盛装为何种溶剂。
冲
洗
泵
头
：
用
注
射
管
于
软
塑
料
管
末端
抽
吸
至
有
水
流
出
，
调
节
流
速
开
关
控
制
流
速
为20-30drop/min.（
①
流动相管道排气
如果，管道中气泡较多，可通过弹击管道，排除气泡，并逆时针旋转脱气泵活塞使其松动，用注射管于流动相出口的塑料管末端抽吸至管道内气泡排除完全。操作时，我们通常已经打开了脱气机（气泡严重影响分离效果，所以观察管道中液体是否有气泡非常重要。）
②
开机
③
进入LC-600高效液相色谱仪操作系统
④
数据记录的终止与保存
3．
关机
1）N2000色谱工作站的关闭
在
N2000的主操作界面上分别单击关闭泵、检测器图标，或通过菜单关闭。关闭电脑主机及显示器。将所有使用仪器用布盖好。关闭排气扇、空调与稳压器开关。
2）
清洁卫生
实验完毕后，打扫仪器室桌面与地面清洁，保持桌面整洁。
3）
仪器使用记录
记录当天的仪器使用情况于指定记录本上，包括仪器使用起止时间与出现问题的解决方案，并签上操作者的名字.以上为－－-液相色谱仪的使用方法

‘陆’ 高效液相如何使用

如果HPLC使用人员能在分析样品之时就熟悉常见的问题并加以解决，就能避免许多麻烦，让您在HPLC使用过程中轻松应对。
1 高效液相色谱仪系统
液相色谱仪主要由贮液瓶、泵、进样器、柱子、柱温箱、检测器、数据处理系统组成（见图1）。对于整个系统而言，柱子、泵和检测器是核心部件，同时也是易出问题的主要部位。
2 常见问题及解决方法
高效液相色谱仪作为一种高精密仪器，如果在使用过程中操作不当的话,就容易导致一些问题，其中最常见的就是柱压问题、漂移问题、峰形异常问题。
2.1 柱压问题
柱压问题是使用高效液相色谱过程中需要密切注意的地方，柱压的稳定与色谱图峰形的好坏、柱效、分离效果及保留时间等密切相关。所谓柱压稳定并不是指压力值稳定于一个恒定值，而是指压力波动范围在345kPa以内（在使用梯度洗脱时，柱压平稳、缓慢的变化是允许的）。压力过高、过低都属于柱压问题。
2.1.1 压力过高
这是高效液相色谱仪在使用中最常见的问题，指的是压力突然升高，一般都是由于流路中有堵塞的情况。此时，我们应该分段进行检查。
①首先断开真空泵的入口处，此时PEEK管里充满液体，使PEEK管低于溶剂瓶，看液体是否自由滴下，如果液体不滴或缓慢滴下，则是溶剂过滤头堵塞。处理方法：用30%的硝酸浸泡0.5h，在用超纯水冲洗干净。如果液体自由滴下，溶剂过滤头正常，再检查。②打开Purge阀，使流动相不经过柱子，如果压力没有明显下降，则是过滤头堵塞。处理方法：将过滤头取出，用10%的异丙醇超声30min。如果压力降至690kPa以下，过滤头正常，再检查。③把色谱柱出口端取下，如果压力不下降，则是柱子堵塞。处理方法：如果是缓冲盐堵塞，则用95%的水冲至压力正常；如果是一些强保留的物质导致堵塞，则要用比现在流动相更强的流动相冲至压力正常。假如按上面的方法长时间冲洗压力都不下降，则可考虑将柱子的进出口反过来接在仪器上，用流动相冲洗柱子。这时，如果柱压仍不下降，只有换柱子入口筛板，但一旦操作不慎，很容易造成柱效下降，所以尽量少用。
2.1.2 压力过低
压力过低的现象一般是由于系统泄漏，处理方法：寻找各个接口处，特别是色谱柱两端的接口，把泄漏的地方旋紧即可。当然还有一个原因就是泵里进了空气，但此时表现的往往是压力不稳，忽高忽低，更严重一点会导致泵无法吸进液体。处理方法：打开Purge阀，用3~5ml/min的流速冲洗，如果不行，则要用专用针筒在排空阀处借住外力将气泡吸出。
2.2 漂移问题
主要包括基线漂移和保留时间漂移。
2.2.1 基线漂移
一般说来，机器刚启动时，基线容易漂移，大概要30min的平衡时间，如果用了缓冲溶液或缓冲盐，还有就是在低波长下（220nm）平衡时间相对会比较长，但如果在实验过程中发现基线漂移，则要考虑下面的原因（见表1）。
2.2.2 保留时间漂移
保留时间重现是液相性能好坏的一个重要标志，同一种东西，两次的保留时间相差不要超过15s，超过了30s可看做保留时间漂移，就无法进行定性，要考虑以下原因（见表2）。
2.3 峰形异常问题峰形问题是液相的主要问题，在做液相过程中，我们就是要变换不同的条件来改善不好的峰形，对于各种各样的异常峰，要区别对待

‘柒’ 高效液相色谱仪器使用方法

一、脱气
流动相脱气对于避免HPLC系统出问题，顺利得到一个理想的数据是一个很有效的措施。HPLC系统内是不希望有气泡存在的。HPLC泵在输送液体时要产生很大的力量，由于气体的压缩比与液体相比大的多，因而当气泡存在时，你将观察到瞬间的流速降低和系统压力下降。如果这个气泡足够大，液相泵将不能输送任何溶剂，而且如果压力低于预先设定的压力低限，泵将停止工作。有些泵设计可以很好地排除气泡，而也有一些泵设计当气泡存在时将停止运转。
当一个气泡通过输液泵时，由于系统压力大，气泡通常会溶解在流动相溶液中，随流动相通过柱子。但是到达检测器流通池时系统压力又恢复到了大气压，因而气泡可能在检测器流通池中又显现，在色谱图上会出现不规律的毛刺。为解决这个问题，有些仪器公司设计一个反压控制器，这样可以在检测器出口提供足够的压力保持气泡始终溶解在流动相中直到它们流出检测器。当然，这个压力不能超过流通池所能承受的压力极限，否则可能损坏检测器。
紫外/可见光（UV/VIS）检测器的液相色谱图中的噪音毛刺通常是气泡进入并通过流通池的征兆。有些检测器对空气的存在也非常敏感，但表现出的征兆与UV/VIS不同，例如有报导说，当使用荧光（FL）检测器时，流动相中溶解氧的存在可能会使一些化合物失去荧光性。此外，对于利用待测物质在电极表面发生氧化还原反应引起电流变化而进行检测的电化学（EC）检测器，对流动相中的溶解氧的存在也非常灵敏。此外，气泡的存在有时还会导致保留时间不重现。
所以，必须注意消除流动相中的空气，并且还应避免空气由管路（如PTFE管）渗透进流动相中。
如果适当地关注在使用之前脱去流动相中溶解进的空气，上述这些问题均能避免，或把影响降至最低。常用的脱气方法有如下几种：
1、吹氦脱气法：利用氦气在液体中溶解度比空气低的特性，在0.1MPa压力下，以约60 mL/min流速通入流动相储液容器中10～15min，可以很有效地从流动相中排除溶解的空气，能排除接近80%的氧气。采用一个高效分布式喷射流装置，一体积的氦气可从流动相中将等体积的几乎全部气体排除。这意味着1L氦气通过1L流动相就可完成排气这个工作。这种脱气方法虽然好，但我们国内氦气价格较高，很少有实验室采用此方法。
2、 加热回流法：此法的脱气效果较好。在操作时要注意冷凝塔的冷却效率，否则溶剂会丢失，混合流动相的比例会有变化。
3、 抽真空脱气法：此法可使用真空泵，降压至0.05～0.07MPa即可除去溶解的气体。但是由于真空脱气会使混合溶剂组成发生变化，从而影响到实验的重现性，因此多用于单溶剂体系的简单分析。
4、超声波脱气法：将欲脱气的流动相置于超声波清洗器中，用超声波震荡10～20min。此法的脱气效果zui差。
5、 在线脱气法：现在商品的HPLC仪器，均可配在线脱气机。在线脱气使用简单，低故障，有效。建议购买仪器时一定要购买，有的公司是作为选购件，所以与仪器公司谈配置时应与公司确认。

二、过滤
任何颗粒物进入HPLC系统后都会在柱子入口端被筛板挡住，zui后的结果是将柱子堵塞，表现出的特征是系统压力增加并使色谱峰变形。因此，要采取各种预防措施，包括操作步骤和商品仪器自身的各种过滤设计，努力防止或减少颗粒物进入HPLC系统中，从而延长仪器和色谱柱的使用寿命，并提高数据的可靠性。在HPLC系统中，颗粒物的主要来源有三个途径：流动相、被测样品和仪器系统部件的磨损物。
1、流动相如果流动相均由高效液相色谱级溶剂组成，流动相没有必要过滤。这是因为高效液相色谱级的有机溶剂，例如乙腈、甲醇等，在制造的工艺过程中都已经过了0.2 µm微孔滤膜过滤。同样的，无论你是买的HPLC级的水还是在实验室使用超纯水净化系统制备的水，最后一步也是通过0.2 µm微孔滤膜。
然而，如果有任何一种缓冲液中加入了固体物，例如磷酸盐，流动相过滤将是必要的一个步骤。虽然缓冲盐可能是可溶解的、高纯的，但它还是可能含有颗粒物质，例如在盖试剂瓶的塑料内盖时，塑料瓶盖子与瓶口边缘挤压就会产生塑料颗粒。在这种情况下，添加的一种固体物可能完全溶解了，但是少量杂质颗粒存在于流动相中成为残渣。
流动相通过0.45 µm微孔滤膜过滤对于从流动相中除去所有颗粒物是一个有效方法。0.2 µm微孔滤膜也可以用，但是它们就这个应用而言并不比0.45µm微孔滤膜更有效，而且它的过滤速度会更慢，特别是当实验室使用的试剂和水的质量不太好时。建议实验室在编写制定他们流动相制备标准操作程序（SOPs）时规定，可以借鉴国际上同类实验室的规定，即：
流动相制备仅采用HPLC级液体时不需要过滤，反之所有流动相组成在使用前必须过滤。
在连接储液瓶和泵的输液管的末端入口采用下沉式过滤器（常见材质有熔融玻璃砂芯滤板和微孔金属的两种）也是很重要的。这个过滤器的规格为≥10 µm的微孔物质，所以它不能取代流动相过滤步骤，但是它能除去系统中的尘土并保证储液瓶、输液管使用的可靠性。
2、被测样品液相系统中的第二个颗粒物来源是被测样品。一些实验室在将他们的样品放置在自动进样器盘（或手动进样）以前，所有样品都先通过一个0.45 µm针筒式过滤器过滤。这是一个有效除去被测样品中颗粒物的方法。
但是这个过程也有一点需要关注：你使用了针筒式过滤器就不可能100%得到通过过滤器的被测样品，总会有或多或少的丢失。丢失来自这样几方面：过滤器滤膜的吸附、过滤器滤出的颗粒物上的吸附、针筒式滤膜过滤器与针筒连接处的渗漏等。如果有丢失，过滤后液体中被测物的含量或浓度与原基本样液的含量或浓度还相同吗？
这个问题一般需要通过实验确认。确认这步是要增加工作量和费用的。过滤器的使用是一种消耗，每个过滤器的价格从几元到十几元。但在做食品中残留物分析时，由于基质大多比较复杂，所以过滤这步已成为不可或缺的一步。在实际分析工作中，一般检测每一组样品会带一个外标、一个添加回收或是质控样品，所以，只要zui终检测时得到的信噪比能满足检出限要求，可将这步视为系统误差而忽略。
3、仪器系统部件的磨损物最后，在HPLC系统中颗粒物的另一个主要来源是输液泵密封垫和进样阀旋转轴的磨损。关于输液泵密封垫的磨损更换有两种不同建议。
一种建议认为，在一般实验室中输液泵密封垫通常使用寿命为六个月到一年，因此建议半年或一年更换这些密封垫，实验室应基于上述观点制定定期预防性维护计划。该观点认为：与输液泵密封垫颗粒堵塞柱子而更换新柱子的费用相比，更换密封垫的费用低些。一些输液泵有玻璃砂芯或筛网，可在流路中滤掉从泵密封垫磨损下来的颗粒物，防止这些颗粒物随流动相流至柱头。若有这种装置应查阅输液泵操作手册，查看推荐的这种过滤器清洗或更换的间隔。
另一种建议则认为，原装密封垫的密封效果最好，更换以后容易引起流动相渗漏。所以，只要不漏液就不要轻易更换密封垫。
两种说法都有其道理，具体如何操作，建议与仪器公司工程师沟通，各公司的仪器还是有些不同的。
自动进样器旋转轴的密封随着使用时间也会磨损，但是在我的经验中，即便是高负荷的运转旋转轴密封垫也可以使用几年。如果你的自动进样器系统有计数进样阀转动次数的功能，你可以设定一个警铃当预设阀转动次数已达到时提醒你。
曾有一种说法，进样器最多转动20,000次，这仅仅是进样10000个；但这似乎不是实验室涉及的常规样品分析使用寿命，它们的实际使用寿命会更长。旋转轴密封磨损后会渗液，比较明显的特征是同一样品多次进样后，峰面积值差别比较大（RSD>5%）。当然，输液泵的密封垫和旋转轴的密封垫磨损将增加更多研磨物在流动相中，加速对这些部件的损伤。
此外，如果你日常运行的流动相有缓冲盐，如磷酸缓冲盐，密封垫的磨损会更快。无论颗粒物源于何物，实验时都要将其除去。推荐在HPLC系统中采用一个0.45或0.5 µm的在线多孔过滤器，接在自动进样器和柱子之间，即使已使用了保护柱。这个在线过滤器将成为挡板代替柱头的滤板，而且如采用一个玻璃砂芯滤板，既便宜，更换又方便（几分钟就可更换）。若采用在线过滤，HPLC系统检测每批样品开始前记录下压力值，当压力上升一定值，例如25%或增加500psi，应该更换玻璃砂芯滤板了，更换以后冲洗几分钟系统将恢复到原来的压力值。

三、冲洗
使HPLC系统良好运行的第三个要点是保持系统的清洁。你需要关注流动相流经该系统的所有地方，对于这些地方经常性的冲洗，将使你的系统保持在“Ready”状态。
1、流动相储液瓶首先要经常清洗流动相储液瓶，或者每做一批新样品更换一次流动相。一个脏的储液瓶将会污染注入的流动相。建议储液瓶中缓冲液使用时间不要超过一周，而有机溶剂使用时间不要超过一个月。
也有人建议储液瓶中保持用溶剂充满，直到更换分析方法储液瓶需更换新溶剂（流动相组成发生变化）时，将旧溶剂倒掉更换新溶剂，这样胜于将溶剂用完。但这对于分析样品量少的实验室而言似乎有些浪费。仪器公司的工程师建议储水瓶的水要天天换，每周瓶子还应该用异丙醇清洗一次。有的实验室则在水里加入0.1～1 mM的甲酸抑制微生物的生长。这些做法看起来有些繁琐，但却能起到“磨刀不误砍柴工”作用。
2、泵接下来要冲洗的是泵。千万不要一分析完冲几分钟后就停泵，特别是当流动相中含有难挥发的缓冲液（如磷酸盐）时。如果仪器不是连续使用，当流动相蒸发时，难挥发物就会粘在活塞密封垫的表面，难挥发物将形成固形物沉淀。这是泵密封垫磨损和单向阀渗漏的主要原因之一。所以，无论使用长短，在停泵以前一定要用非缓冲液流动相冲洗泵在半个小时以上，要是流动相中有难挥发缓冲盐则建议冲洗的时间应该更长些。
3、自动进样器自动进样器也要按规定清洗。现在的仪器多配有自动进样器的冲洗液瓶，通常只要注意及时更换、补充冲洗液即可。自动进样器用的洗涤液也要采用与流动相相同的方式处理，并根据溶剂的有效期和规定，清洗储液瓶或更换洗涤液。现在的自动进样器设置、操作都很简单，如果时间允许（特别是利用夜间运行），每次分析完后设置进1、2针纯溶剂（如甲醇、乙腈），也是一个好做法。
4、色谱柱对柱子的污染是随使用时间而增加。通常表现是：运行走基线时在记录的色谱图中基线噪音增加，泵压也增加。解决这个问题的zui有效方法就是在每一批样品分析结束后或准备卸下柱子时用大量的流动相冲洗柱子（例如，甲醇、乙腈和水）。用梯度冲洗效果更好，具体的比例要根据柱子的说明书和性质而定。
5、检测器如果是正常使用，检测器将依据其性质并按照说明书规定进行洗。例如UV/VIS检测器或FL检测器，在对柱子和系统进行冲洗时也就一同对检测器流通池中污染物进行了清洗。但是蒸发光检测器或质谱仪则需要按照说明书进行定期清洗。这些检测器在使用时会有难挥发污染物沉积，如质谱仪离子源的喷针、毛细管、锥孔板、预四极等部件，因而需要定期清洗。而且对联有这些检测器的系统冲洗时，最好与这些检测器断开，以减少对检测器的污染。
总之，实验室日常使用的液相色谱仪要是能认真做好这三项工作——脱气、过滤和冲洗，你的仪器可以得到良好的预防性维护，使用时就会感到比较顺手。当然，在实际操作时遇到的问题并没有这么简单，但这三个良好习惯将是正确操作、使用HPLC系统的基础。答案来自

‘捌’ 液相色谱仪的使用步骤是什么

目的：制定规范的高效液相色谱仪操作、维护保养和清洁规程。
范围：适用于Agilent 1260 HPLC。
责任：色谱检验工程师负责本规程执行。
内容：
1 开机
1.1 打开电脑。
1.2 打开液相色谱各个模块的电源。
1.3 双击桌面“仪器—联机”，进入联机界面。
1.4 排气：
1.4.1 手动旋开泵处冲洗阀（逆时针旋转约1圈）。
1.4.2 右键单击“泵”图标区域，选择“方法…”选项，进入泵编辑画面，设流速：5ml/min（一般为3－5ml/min），点击“确定”。
1.4.3 右键单击“泵” 图标，点击“控制…”选项，选中“ON”，点击“确定”，则系统开始冲洗，直到管线内（由溶剂瓶到泵入口）无气泡为止，（一般为5分钟），切换通道继续冲洗，直到所有要用通道无气泡为止。
1.4.4 右键单击“泵” 图标，点击“方法…”选项，设流速：0ml/min，手动旋紧冲洗阀。
1.4.5 右键单击“泵”图标，点击“方法…”选项，按照方法要求选择合适比例的流动相，设流速：1.0ml/min。
1.4.6 同理右键单击“柱温箱”，“检测器”图标，点击“方法…”选项，按照方法的要求设置温度，波长，点击“控制” 选项，“ON”打开柱温箱和检测器。

2 编辑方法
2.1 点击“方法”－“编辑完整方法”开始编辑完整方法。
2.2 选中除“数据分析 ”外的三项，进入下一选项卡。
2.3 方法信息：在“方法注释”中加入方法的信息（如：This is for test!）。进入下一选项卡。
2.4 泵参数设定：在“流速”处输入流量, 如1.0ml/min，停止时间：如10 min（该停止时间仅为做一个样品需要的时间），按照要求选择合适比例的流动相配比，如乙腈：水＝75：25，A为水，B为乙腈，则设置B：75％即可。进入下一选项卡。
2.5 自动进样器参数设定: 选择“洗针进样”----可以输入进样体积和洗瓶位置，进入下一选项卡。
2.6 柱温箱参数设定: 在“温度”下面的空白方框内输入所需温度,如：40度。进入下一选项卡。
2.7 UV检测器参数设定: 在“波长”下方的空白处输入所需的检测波长,如254nm。点击确定。
2.8 在“ 运行时选项表 ”中，选中“ 数据采集”，点击“确定”。
2.9 从“方法”菜单，选中“方法另存为…”，输入一方法名，如“测试”，点击“确定。

3 单次采集
3.1 从“运行控制”菜单中，选择“样品信息”选项，选择合适的路径，在“数据文件”中选择 “前缀/计数器”，输入样品瓶的位置，点击“确定”。
3.2 基线平稳后约10分钟，从“运行控制”菜单中选择“运行方法”。

4 多次数据采集
4.1 按照步骤2 编辑完整方法。
4.2 点击“序列”－“序列表”，输入“样品瓶”“样品名称”，“进样次数”，选择合适的“做样方法”
4.3 点击“序列”－“序列参数”，选择序列数据的保存路径（序列会自动生成以“序列名称－时间”为名称的文件夹保存数据），数据建议以选择 “前缀/计数器”保存。
4.4 从“序列”菜单，选中“序列另存为…”，输入一序列名，如“测试”，点击“确定。
4.5 从“运行控制”菜单中选择“运行序列”。

5 数据分析（脱机状态使用）
5.1 双击“仪器 —脱机”图标 进入的脱机画面。
5.2 从“视图”菜单中，点击“数据分析”进入数据分析画面。
5.3 从“文件”菜单选择“调用信号”，选中您的数据文件名。点击“ 确定”，则数据被调出。（如预建立标准曲线，应先打开浓度较低的标样图谱。）
5.4 做谱图优化：从“图形”菜单中选择“信号选项”。从“范围” 中选择“满量程” 或“自动量程” 及合适的时间范围或选择“自定义量程” 调整。反复进行，直到图的比例合适为止。点击“ 确定”。

6 积分:
6.1 从“积分”菜单中选择“积分事件”选项，选择合适的“斜率灵敏度”，“峰宽”，“最小峰面积”，“最小峰高”。点击 ，自动加载积分参数。
6.2 点击左边“√”图标，将积分参数存入方法并退出“积分事件”。
6.3 如积分结果不理想，则修改相应的积分参数，直到满意为止。

7 标准曲线
7.1 点击“校正”－“校正设置”，输入“含量单位”。
7.2 点击“校正”－“新建校正表”，点击确定。输入“化合物名称”和“含量”，点击“确定”，按照提示删除其他组分。
7.3 至此完成单级校正，如要增加校正级别，应从“文件”菜单选择“调用信号”，选中您的数据文件名（第二个标样），点击“校正”－“添加级别”，点击确定，输入“含量”，依次增加校正级别。

8 打印报告
8.1 从“报告”菜单中选择“设定报告”选项，点击“定量结果”框中“定量”右侧的黑三角，选中“外标法”，其它选项不变，点击“ 确定”。
8.2 从“报告”菜单中选择“打印报告”，则报告结果将打印到屏幕上，如想输出到打印机上，则点击“报告” 底部的“打印”钮。
8.3 点击“文件”－“另存为”－“方法”，把数据分析方法保存，下次分析可直接在“文件”－“调用”－“方法”下，将该方法调出使用。（调用的方法中含有积分方法，标准曲线方法和打印报告方法）

9 关机
9.1 关机前，先关紫外灯，用相应的溶剂（甲醇或乙腈）充分冲洗系统大约30分钟。（色谱柱最终应保存在甲醇或乙腈中）
9.2 退出化学工作站，依提示关泵，及其它窗口，关闭计算机。
9.3 关闭Agilent 1260各模块电源开关。

10 其它注意事项
10.1 当样品运行时，切勿打开自动进样器前遮盖，否则进样过程停止。
10.2 系统发生漏液时，机器会检测到并停止进样，状态指示灯为红色。检查擦干并安置好漏液处，擦干漏液传感器，单击ON按钮，系统重新初始化。
10.3 注意紫外灯使用寿命，切勿来回开关紫外灯。

‘玖’ 液相色谱仪使用步骤是什么

高效液相色谱仪的使用

1.色谱柱它包括空柱和填料。空柱是内壁抛光的不锈钢管，内径为4～5mm，长100～250mm。按气相色谱法中洗涤空柱的方法洗净，用匀浆法填充固定相。将此柱装入仪器的管路中，用柱式机械往复泵输入新鲜脱气的流动相。等基线平直后可用苯、萘、菲的混合试液，用正己烷(含 0.05%甲醇)或甲醇：水(83：17)为流动相测定柱效及分离度塔板数在2～3万/ml以上及分离度在1.5以上者，柱效好。为防止柱污染，常用1个 50mm长，4~5mm内径，装有硅胶(40-50mm)或立柱相同填料的保护柱(预柱)接在主柱之前，以延长色谱柱的寿命。反相键合相柱用毕。必须用水充分流经，以洗去盐类、酸碱等杂质防止柱生锈及填料中杂质的积聚，再用甲醇流经洗涤使色谱柱获得再生。

2.流动相的洗脱方式配好经脱气的流动相放于贮液瓶中，经过有滤过头、内径2mm的聚四氟乙烯管流入高压泵进入色谱柱，最后自检测器流出或收集或作废液回收。用流动相洗脱的方式有恒溶剂脱洗法(isocratic dlution)，即自洗脱开始到结束，溶剂的配比恒定。另一类为梯度洗脱法(gradicnt clution),即使溶剂的极性强度在色谱过程中逐渐增加。须按一定程序不断改变流动相的浓度配比，从而使同一个试样中组分性质相差较小的及较大的都能在一次色谱过程中很好分离，而整个色谱过程缩短。必须注意，梯度洗脱法不能用于分子排阻色谱及用电化学检测的反相高效液相色谱法中。

3.检测器适用于血药浓度的检测器有紫外线吸收，荧光发射和电化学三种。紫外检测器应用于对紫外光有吸收的药物，大多数药物分子对紫外光有吸收，故能较普遍采用，检测限有0.1μg左右。紫外检测器有固定波长型、可变波长型及扫描器，既能使流动相停流作组分的定性定量检测，又能提高测定灵敏度，重现性较好。荧光发射检测器对能产生荧光的药物才能使用。80年代应用激光替代氙灯光源，光强度增加了3~4倍，对某些药物的检测限可达pg级。电化学检测器是由一个碳糊或破碳做成的蒲层电解池。常用于检测儿茶酚胺类及有酚类基团的各种药物和代谢物。流出组分进入2μl的薄层电解池，在一暄电压下电解产生电流，放大后检测，检测限pg级。

4.数据处理现代高效液相色谱仪带有数据处理系统，除记录谱外，还能自动记录峰的保留时间，能自动积分求算峰面积，并能按照预定的程序作有关计算，报告分析结果。

高效液相色谱仪使用过程中常见问题及其解决方法

1 液相色谱仪系统

液相色谱仪主要由贮液瓶、泵、进样器、柱、柱温箱、检测器、数据处理系统组成(如图1所示)。对于整个系统而言，柱子、泵和检测器是核心部件，同时也是容易出事故的主要场所。

2 常见问题及解决方法

2.1 针对柱压问题(表1)

柱压问题是使用高效液相色谱过程中需要密切注意的地方，柱压的稳定与色谱图峰形的好坏、柱效、分离效果及保留时间等密切相关。所谓柱压稳定并不是指压力值稳定于一个恒定值，而是指压力波动范围在50PSI之间。压力过高、过低及波动较大都属于柱压问题，但柱压的高低与色谱柱的种类、品牌、液相系统本身及使用的流动相种类相联系。值得注意的是在使用梯度洗脱时，进柱压的平稳缓慢的变化是允许的。

在实际应用中柱压过高可从以下几个方面来考虑[1]。首先考虑柱子是否被堵，此时可更换一根新柱子进行检测。

2.2 针对保留时间漂移的问题 [2，3] (表2)

保留时间的改变是很多液相色谱使用者常碰到的问题，其包括了保留时间增大和减小。它的产生与很多原因有关。

2.3 针对异常色谱峰问题[2-4]

异常的色谱峰指的是色谱图中无峰或出现负峰、宽峰、双峰、肩峰、峰形不对称等情况。具体情况与原因分析如表3。

3 高效液相色谱仪的保养[5-7]

3.1 HPLC的日常操作条件

工作温度10～30℃; 相对湿度<80%; 最好是恒温、恒湿，远离高电干扰、高振动设备。

3.2 泵的保养

使用流动相尽量要清洁;进液处的沙芯过滤头要经常清洗;流动相交换时要防止沉淀;避免泵内堵塞或有气泡。

3.3 进样器的保养

每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污染。

3.4 柱的保养

柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动;当柱子和色谱仪连接时，阀件或管路一定要清洗干净;要注意流动相的脱气; 避免使用高粘度的溶剂作为流动相;进样样品要提纯;严格控制进样量;每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品;每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱;若分析柱长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭。

3.5 检测器(UV)的保养

紫外灯的保养要在分析前、柱平衡得差不多时，打开检测器;在分析完成后，马上关闭检测器。同时样品池要保养。

4 结语

在高效液相色谱使用过程中故障排出时要遵守以下原则：一次只改变一个因素，从而确定假定因素与问题之间的联系;如果通过更换组件来排查故障时要注意将拆下的完好组件装回原位，从而避免浪费;养成良好的记录习惯，一个良好的记录是成功地进行故障排除的关键。

总之，在使用高效液相色谱时一定要注意样品的前处理与仪器的正确操作和保养，仪器系统的干净是用好仪器和维护维修仪器的关键。

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