简述临床常用的细菌培养方法

A. “细菌培养”的具体培养步骤是什么

以光合细菌培养方法为例。光合细菌培养的方法，按次序分为容器、工具的消毒， 培养基的制备，接种和培养管理四个步骤。

（一）容器、工具的消毒参考、此处从略。

（二）培养基的制备

1．培养用水

如果培养的光合细菌是淡水种，菌种培养可用蒸馏水，生产培养可用消毒的自来水（或井水）配制。如果培养的光合细菌是海水种，则用天然海水配制培养基，注意在海水中加入磷元素时，不能用磷酸氢二钾，应用磷酸二氢钾，不然会产生大量沉淀。

2．灭菌和消毒菌种培养用的培养基应连同培养容器用高压蒸气灭菌锅灭菌。小型生产性培养可把配好的培养液用普通铝锅或大型三角烧瓶煮沸消毒。大型生产性培养则把经沉淀砂滤后的水用漂白粉（或漂白液）消毒后使用。

3． 培养基配制根据所培养种类的营养需要选择合适的培养基配方。按培养基配方把所需物质称量，逐一溶解，混合，配成培养基。也可先配成母液，使用时按比例加入一定的量即可。

（三）接种培养基配好后，应立即进行接种。光合细菌生产性培养的按种量比较高，一般为20%～50%，即菌种 母液量和新配 培养液虽之比为1∶4～1∶1，不应低于20%，尤其是微气培养，接种量更应高些，否则光合细菌在培养液中很难占绝对优势，影响培养的最终产量和质量。

（四）培养管理光合细菌的培养过程中，管理工作包括日常管理操作和测试，生长情况的观察、检查以及出现问题的分析处理等三个方面。

B. 微生物的培养方法

1．平板划线分离培养法

对混有多种细菌，采用划线分离和培养，使原来混杂在一起的细菌沿划线在琼脂平板表面分离，得到分散的单个菌落，以获得纯种。平板划线分离法通常有两种方法：

①分区划线分离法：此法常用于含菌量较多的细菌的分离。先用接种环挑取标本涂布于琼脂平板1区（占培养基总面积的¼）并作数条划线，再于2、3、4区依次划线。每划完一个区域，均将接种环烧灼灭菌1次，冷后再划下一区域，每一区域的划线均与上一区域的划线交接1~3次。一个成功分区划线的平板，培养后分别观察1区形成菌苔，2区菌落连成线，3区和4区可分离到单个菌落。

②连续划线分离法：此法常用于含菌量不多的标本或培养物中的细菌分离培养。方法是先将接种物在琼脂平板上1/5处轻轻涂抹，然后再用接种环或拭子在平板表面曲线连续划线接种，直至划满琼脂平板表面。

2.琼脂斜面接种法

主要用于菌落的移种，以获得纯种进行鉴定和保存菌种等。用接种环（针）挑取单个菌落或培养物，从培养基斜面底部向上划一条直线，然后再从底部沿直线向上曲折连续划线，直至斜面近顶端处止。生化鉴定培养基斜面接种，用接种针挑取待鉴定细菌的菌落，从斜面中央垂直刺入底部，抽出后在斜面上由下至上曲折划线接种。

3．穿刺接种法

此法多用于半固体培养基或双糖铁、明胶等具有高层的培养基接种，半固体培养基的穿刺接种可用于观察细菌的动力。接种时用接种针挑取菌落，由培养基中央垂直刺入至距管底0.4cm处，再沿穿刺线退出接种针。双糖铁等有高层及斜面之分的培养基，穿刺高层部分，退出接种针后直接划线接种斜面部分。

4．液体培养基接种法

用于各种液体培养基如肉汤、蛋白胨水、糖发酵管等的接种。用接种环挑取单个菌落，倾斜液体培养管，在液面与管壁交界处研磨接种物（以试管直立后液体淹没接种物为准）。此接种法应避免接种环与液体过多接触，更不应在液体中混匀、搅拌，以免形成气溶胶，造成实验室污染。

5．倾注平板法

本法主要用于饮水、饮料、牛乳等标本中的细菌计数。取纯培养物的稀释或原标本1ml至无菌培养皿内，再将已融化并冷却至45~50℃左右的琼脂培养基15~20ml倾注入该无菌培养皿内，混匀，待凝固后置37℃培养，长出菌落后进行菌落计数，以求出每毫升标本中所含菌数。先数6个方格（每格为1cm2）中菌落数，求出每格的平均菌落数，并算出平皿直径，然后按下列公式计数，求出每毫升标本中的细菌数。

全平板菌落数=每方格的平均菌落数×лr2

每ml标本中的细菌数=全平板菌落数×稀释倍数

6．涂布接种法

本法多用于纸片扩散法药敏试验的细菌接种。将一定量或适量的菌液加到琼脂培养基表面，然后用灭菌的L型玻璃棒或棉拭子于不同的角度反复涂布，使被接种液均匀分布于琼脂表面，然后贴上药敏纸片，或直接培养，本法经培养后细菌形成菌苔。

C. 微生物培养方法

微生物培养法是在人为条件下繁殖微生物的方法。根据微生物的种类以及对养料、温度、氧气、水分、酸碱度等环境条件的要求不同，并联系生产和实验上的具体要求，可有不同的培养方法。可分好气培养法和厌气培养法两类。中海生物技术的培养基一是好气微生物培养法，常用：①摇床培养法，即将微生物接种于盛有液体培养基的三角瓶后，放在恒温培养室中的摇床上作有节奏的振荡，使空气不断进入培养液中，促其良好生长;②浅盘培养法，又称表面培养法，在盘内放一浅层培养基，使微生物能够充分接触空气，而有利于生长繁殖，但此法所需空间大，并且容易污染杂菌;③深层培养法，适用于好气微生物的大规模发酵培养，在大容积的液体培养基中，通入无菌空气，并不断搅拌，可使微生物充分接触空气，迅速繁殖并积累代谢产物。二是厌气微生物培养法，实验室常用化学还原剂或抽气机吸除培养基中的分子氧，也有用静止状态的深层培养法。在生产中常用密封式发酵罐或不通风的固体发酵法。

D. 微生物的培养方法有哪些

微生物培养法是在人为条件下繁殖微生物的方法。根据微生物的种类以及对养料、温度、氧气、水分、酸碱度等环境条件的要求不同，并联系生产和实验上的具体要求，可有不同的培养方法。可分好气培养法和厌气培养法两类。中海生物技术的培养基一是好气微生物培养法，常用：
①摇床培养法，即将微生物接种于盛有液体培养基的三角瓶后，放在恒温培养室中的摇床上作有节奏的振荡，使空气不断进入培养液中，促其良好生长;
②浅盘培养法，又称表面培养法，在盘内放一浅层培养基，使微生物能够充分接触空气，而有利于生长繁殖，但此法所需空间大，并且容易污染杂菌;
③深层培养法，适用于好气微生物的大规模发酵培养，在大容积的液体培养基中，通入无菌空气，并不断搅拌，可使微生物充分接触空气，迅速繁殖并积累代谢产物。二是厌气微生物培养法，实验室常用化学还原剂或抽气机吸除培养基中的分子氧，也有用静止状态的深层培养法。在生产中常用密封式发酵罐或不通风的固体发酵法。

E. 细菌培养的方法有哪些

细菌的培养方法
根据培养细菌的目的和培养物的特性培养方法分为一般培养法,二氧化碳培养法和厌氧培养法三种.
1. 一般培养法 将已接种过的培养基,置37℃培养箱内18-24小时,需氧菌和兼性厌氧菌即可于培养基上生长.少数生长缓慢的细菌,需培养3-7天直至一个月才能生长.为使培养箱内保持一定湿度,可在其内放置一杯水.培养时间较长的培养基,接种后应将试管口塞棉塞后用石腊凡士林封固,以防培养基干裂.
2. 二氧化碳培养法 某些细菌,如牛流产布氏杆菌和胎儿弧菌等需要在含有10%二氧化碳的空气中才能生长,尤其是初代分离培养要求更为严格.将已接种的培养基置于二氧化碳环境中进行培养的方法即二氧化碳培养法,常用方法有以下几种:
(1) 二氧化碳培养箱 可将已接种的培养基直接放入箱内孵育,即可获得二氧化碳环境.
(2) 烛缸法 将已接种的培养基,置于容量为2 000ml的磨口标本缸或干燥器内.缸盖或缸口处均需涂以凡士林,然后点燃蜡烛直立置入缸中,密封缸盖.待燃自行熄灭时,容器内约含5-10%的CO2 容器置37℃培养.
(3) 重碳酸钠-盐酸法 每升容积的容器内,重碳酸钠与盐酸按0.4g与3.5ml的比例,分别将两种药各置一器皿内(如平皿内),连同器皿置于标本缸或干燥器内,盖严后使容器倾斜,两种药品接触后即可产生二氧化碳.
3. 厌氧培养法 目前常用的厌氧培养方法有厌氧罐法,气袋法及厌氧箱三种.
(1) 厌氧罐法 是目前应用较广泛的一种方法,共分为以下几种.
抽气换气法:该法适用于一般实验室,其特点是较经济并可迅速建立厌氧环境.标本接种后,将平板放入厌氧罐,拧紧盖子,用真空泵抽出罐中空气,使压力真空表至-79.98KPa,停止抽气,充入高纯氮气使压力真空表指针回0位,连续反复3次,最后在罐内-79.98KPa的情况下,充入70%的N2 ,20%H2 ,10%CO2 (有人改用20%CO2 及80%H2 ,亦可获得好结果).罐中需放入冷催化剂钯粒,可催化罐中残余的O2 和H2 化合成水.同时罐中应放有美蓝指示管,美蓝在有氧的环境下呈蓝色,无氧时为红色.临用前首先将美蓝煮沸使变成无色,放入罐中先呈浅蓝色,待罐中无氧环境形成,美蓝即可持续无色.
气体发生袋法:气体发生袋系由锡箔密封包装,其中含有两种药片,一种为含枸椽酸和重碳酸氢钠的药片,另一种是含有硼氢化钠的药片.前者遇水放出二氧化碳,后者可释放氢.使用时在袋的右上角剪一小口,灌进10ml蒸馏水,立即放入含有钯粒,指示剂及平板培养基的厌氧罐中,拧紧盖子经2-3分钟后,可感到盖子微热并有少量水蒸气出现.密封后1小时左右罐中的O2 的含量可低于<1%.
(2) 气袋法 此种方法不需要特殊设备,操作简单,使用方便,不但实验室中可用,而且外出采样,现场接种也可用.原理与气体发生袋完全相同,只是采用塑料袋代替了厌氧罐,气袋为一透明而密闭的塑料袋,内装有气体发生安瓿,指示剂安瓿,含有催化剂的带孔塑料管各一支.其操作方法为首先将接种的平板培养基放入袋中,用弹簧夹夹紧袋口,然后用手指压碎气体安瓿,20分钟后再压碎指示剂安瓿,如果指示剂不变蓝色,说明袋内达到厌氧状态,即可放入37℃进行培养.
(3) 厌氧培养箱 使用之前须仔细检查厌氧装备有无漏气等问题,以及催化剂,指示剂质量等.使用时严格遵守操作规程,保证箱内气体比例合理.

F. 怎么做细菌培养

细菌培养是一种用人工方法使细菌生长繁殖的技术。大多数细菌可用人工方法培养，即将其接种于培养基上，使其生长繁殖。培养出来的细菌用于研究、鉴定和应用。
具体培养步骤：
以光合细菌培养方法为例。光合细菌培养的方法，按次序分为容器、工具的消毒，培养基的制备，接种和培养管理四个步骤。
（一）容器、工具的消毒参考、此处从略。
（二）培养基的制备
1．培养用水
如果培养的光合细菌是淡水种，菌种培养可用蒸馏水，生产培养可用消毒的自来水（或井水）配制。如果培养的光合细菌是海水种，则用天然海水配制培养基，注意在海水中加入磷元素时，不能用磷酸氢二钾，应用磷酸二氢钾，不然会产生大量沉淀。
2．灭菌和消毒菌种培养用的培养基应连同培养容器用高压蒸气灭菌锅灭菌。小型生产性培养可把配好的培养液用普通铝锅或大型三角烧瓶煮沸消毒。大型生产性培养则把经沉淀砂滤后的水用漂白粉（或漂白液）消毒后使用。
3．培养基配制根据所培养种类的营养需要选择合适的培养基配方。按培养基配方把所需物质称量，逐一溶解，混合，配成培养基。也可先配成母液，使用时按比例加入一定的量即可。
（三）接种培养基配好后，应立即进行接种。光合细菌生产性培养的按种量比较高，一般为20%～50%，即菌种母液量和新配培养液虽之比为1∶4～1∶1，不应低于20%，尤其是微气培养，接种量更应高些，否则光合细菌在培养液中很难占绝对优势，影响培养的最终产量和质量。
（四）培养管理光合细菌的培养过程中，管理工作包括日常管理操作和测试，生长情况的观察、检查以及出现问题的分析处理等三个方面。
日常管理和测试：
（1）搅拌和充气：光合细菌培养过程中必须充气或搅拌，作用是帮助沉淀的光合细菌上浮获得光照，保持菌细胞的良好生长。小型厌气培养常用人工摇动培养容器的方法使菌细胞上浮，每天至少摇动三次，定时进行。大型厌气培养则用机械搅拌器或使用小水泵使水缓慢循环运转，保持菌体悬浮。微气培养是通过充气帮助菌体上浮，因为培养液中溶解氧含量增加，光合细菌繁殖受到抑制，产量下降，所以必须严格控制充气量。一般采用定时断续充气，充气量控制在1～1.5升/（升·h）之间，溶解氧量保持在1×10-6以下。
（2）调节光照度：培养光合细菌需要连续进行照明。在日常管理工作中，应根据需要经常调整光照度。白天可利用太阳光培养，晚上则需要人工光源照明，或完全利用人工光源培养。人工光源一般使用碘钨灯或白炽灯泡。不同的培养方式所要求的光照强度有所不同。一般培养光照强度应控制在2000～5000lx之间。如果光合细菌生长繁殖快，细胞密度高，则光照强度应提高到5000～10000lx。光照强度可通过调整培养容器与光源的距离或使用可控电源箱调节。
（3）调节温度：光合细菌对温度的适应范围很广，一船在23～39℃的范围内均能正常生长繁殖，可不必调整温度。在常温下培养也可通过调整，将温度控制在光合细菌生长繁殖最适宜的范围内，使光合细菌更好地生长。
（4）酸碱度的测定和调整：在培养光合细菌的过程中，必须注意酸碱度的变化。由于光合细菌的大量繁殖，菌液的pH值上升，这意味着光合细菌正处于指数生长期。但当pH值超过最适范围甚至生长的适应范围时，光合细菌的生长达到顶点，随后生长下降。如果能及时调整菌液的酸碱度，使pH值保持在最适范围，则光合细菌能继续生长繁殖。为了延长光合细菌的指数生长期，提高培养基的利用率和单位水体的产量，测定和调整PH值是非常重要的。一船采用加酸的办法来降低菌液的酸碱度，醋酸、乳酸和盐酸部可使用，最常用的是醋酸。在日常的管理工作中，必须每天或隔天测定菌液的pH值，当pH值上升超出最适范围，即加酸调整。如果在培养过程中不测定、调整酸碱度，当光合细菌的生长达到一定密度后pH值也上升到9以上，细菌生长受阻，此时应采收或再扩大培养。在培养过程中不调整PH值，获得的最终产量低。

G. 细菌分离培养的基本要领和常用方法有哪些

一、基本要领

菌种分离主要在培养皿上进行，常用的方法是稀释法和划线法。

菌种分离的目的是是微生物的一个个体通过繁殖，在固体培养基上长出肉眼能见的群体，然后根据培养特征，用接种针调取所需菌种并在显微镜下检查，证明为单一形状的菌体。

改变培养基条件也有助于菌种分离。没有一种培养基或一种培养条件能够满足一切微生物生长的需要，在一定程度上所有的培养基都是选择性的。

如果某种微生物的生长需要是已知的，也可以设计特定环境使之适合这种微生物的生长，因而能够从混杂的微生物群体中把这种微生物选择培养出来，尽管在混杂的微生物群体中这种微生物可能只占少数。

二、方法

1、稀释倒平板法

首先把微生物悬液作一系列的稀释（如1:10、1:100、1:1000、1:10000），然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。

如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。

2、涂布平板法

因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。

其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的微生物悬液滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，经培养后挑取单个菌落。

3、平板划线法

最简单的分离微生物的方法是平板划线法，即用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。

有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法、四格法等。

4、 稀释摇管法

用固体培养基分离严格厌氧菌有特殊性，如果该微生物暴露于空气中不立即死亡，可以采用通常的方法制备平板，然后置放在封闭的容器中培养，容器中的氧气可采用化学、物理或生物的方法清除。

对于那些对氧气更为敏感的厌氧性微生物，纯培养的分离则可采用稀释摇管培养法进行，它是稀释倒平板法的一种变通形式。

先将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热使琼脂熔化后冷却并保持在50℃左右，将待分离的材料用这些试管进行梯度稀释，试管迅速摇动均匀，冷凝后，在琼脂柱表面倾倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物，将培养基和空气隔开。

培养后，菌落形成在琼脂柱的中间。进行单菌落的挑取和移植，需先用一只灭菌针将液体石蜡--石蜡盖取出，再用一只毛细管插入琼脂和管壁之间，吹入无菌无氧气体，将琼脂柱吸出，置放在培养皿中，用无菌刀将琼脂柱切成薄片进行观察和菌落的移植。

(7)简述临床常用的细菌培养方法扩展阅读

在以上介绍的几种方法中，平板分离法普遍用于实验室微生物的分离与纯化，稀释法是液体培养基分离纯化常用的方法。

一般情况下可以通过适当改善培养基的条件来培养特点菌种。

如为了得到嗜热微生物，可在50℃~60℃下进行培养。有时投加相应的抑制剂也能提高菌种分离效果，如在土壤样品的悬浮液中投加10%的苯酚数滴，可以抑制霉菌和细菌的生长，而有利于放线菌的分离。在培养基中投加一定量的青霉素或链霉素能抑制细菌的生长，而有利于霉菌的分离。

H. 接种细菌的三种方法各有什么用途

接种细菌的方法各有什么用途：

1、平面接种法：此方法主要用于鉴定或保存菌种，或观察细菌的某些生化特性和动力。

2、菌落分纯法：此方法主要用于分离琼脂平板上的混合菌。

3、液体培养基接种法：此方法可用于比浊试验中。

4、平板划线接种法（又称分离培养法）：平板划线接种法为最常用的分离培养细菌的方法，通过平板划线后，可使细菌分散生长，形成单个菌落，有利于从含有多种细菌的标本中分离出目的菌。平板分离划线的方法比较多，其中以分区划线发育曲线划线法较为重用。其目的都要时细菌呈现单个菌落生长，便于同杂菌菌落鉴别。

5、纯培养细菌接种法：用于培养保存菌种及其实验用。

6、半固体培养基穿刺培养法：用于保存菌种及间接观察细菌之动力（无动力之细菌仅沿穿刺线生长，清晰可见；有动力的细菌使培养基呈现浑浊样，穿刺线甚至难以看出。）

接种注意事项：

1、在超净工作台上操作，工作台在使用前要紫外消毒，酒精消毒等。

2、应在酒精灯火焰前操作。

3、取菌种前灼烧接种针或接种环（要烧红）。

4、烧红的接种针（环）少使冷却在取菌种，以免烧死菌种。

5、接种后应尽快塞上面塞。